ABSTRACT The morphological premalignant changes in prostate epithelium such as high grade prostatic intraepithelial neoplasia (HGPIN) precede invasive prostate cancer (PC) by several decades. The overall aim of this project was to identify patterns of gene expression in HGPIN and early PC which increase our understanding of the early biology of PC and identify genes and pathways that correlate with an aggressive phenotype. A comprehensive tissue cohort of premalignant prostate lesions was collected in a tissue microarray (TMA) platform that was utilised for high-throughput validation of target genes. Using this unique resource, the expression of the tumour suppressor gene PTEN was assessed using immunohistochemistry in an initial candidate gene approach based on mouse models implicating PTEN in carcinogenesis. No significant difference in expression of PTEN was detected in premalignant and benign epithelium. A transcript profiling approach was undertaken by integrating laser capture microdissection, linear RNA amplification and oligonucleotide microarrays to perform a screen of matched patient samples of normal, HGPIN and PC cells. The expression patterns of two genes encoding secreted proteins, neuropeptide Y (NPY) and macrophage inhibitory cytokine (MIC-1) were validated using immunohistochemistry on TMAs representing the progression model of early PC. Increased expression of these proteins in PC was confirmed to occur early in the disease process and altered expression of NPY and MIC-1 was associated with worse clinical outcome. Further analysis of global gene expression patterns using a structured network knowledge base identified a notable aberration in the expression of extracellular matrix and extracellular matrix associated proteins in HGPIN and provided novel evidence for the role of this class of molecules in the development of PC. In summary, contrary to current dogma based on work in animal models, altered PTEN expression is unlikely to represent an important event in the development of malignancy in the human prostate. In contrast, the expression patterns and prognostic value of NPY and MIC-1 in HGPIN support their further evaluation as biomarkers for the development and progression of PC. The aberrant expression of genes and networks of genes detected in HGPIN will assist in further identification of biological pathways which may be targeted in therapeutic strategies against the development and progression of PC.

Prostate cancer is a significant public health concern due to its high incidence and mortality, and that no consensus exists regarding the best form of treatment for any stage of the disease. Prostate cancer mortality can be reduced by the early prostate cancer detection. The earlier the detection the more effective the treatment would be. Prostate cancer screening or early detection has been accomplished applying the digital rectal examination (DRE) , the measurement of serum the prostate specific antigen (PSA), transrectal ultrasonography and combinations of these tests. MS based proteomics and particularly MS-SEDLI-TOF technology have assisted in discovering prostate cancer biomarkers. On the other hand, a major cause of mortality for women is the ovarian cancer. Malignant ovarian tumors are heterogeneous in their biological and clinical behaviour and a greater understanding of how they develop and progress is a prerequisite to successful early detection, screening programs, and treatment modalities. Accordingly, the aims of the present thesis are: (i) To develop a reliable pattern recognition system for the discrimination of healthy from patients with prostate cancer as well as controls from patients with ovarian cancer ,(ii) To develop efficient algorithms in order to handle the large number of features that are extracted from proteomic spectra, (iii) To develop a methodology to facilitate the investigation of the low intensity peaks which are the peaks in which biologists are mostly interested in, (iv) To propose potential biomarkers for discriminating healthy from prostate cancer cases and healthy from ovarian cancer cases . To cope with the above issues and in search of efficient methods for handling proteomic spectra a novel multi classifier pattern recognition methodology has been designed, developed and implemented, for the analysis of prostate and ovarian proteomic data. Furthermore, a novel method for splitting and grouping peaks according to their intensities has been developed to be consistent with biologist interest in investigating low intensity peaks. / Τα δεδομένα πρωτεομικής τα οποία εξάγονται από φασματογράφο μάζας έχουν ως αποτέλεσμα την δημιουργία ενός μονοδιάστατου σήματος το οποίο στον οριζόντιο άξονα έχει τιμές μάζας/φορτίο και στον κατακόρυφο άξονα έχει τις αντίστοιχες τιμές έντασης. Οι τιμές στον οριζόντιο άξονα (μάζα/φορτίο) οι οποίες αντιπροσωπεύουν πεπτίδια ή πρωτεΐνες έχουν ένα εύρος από 0 έως δεκάδες χιλιάδες. Επομένως τα πρωτεομικά φάσματα θεωρούνται ιδιαίτερα πολύπλοκα. Η διαχείριση της πληροφορίας των πρωτεομικών φασμάτων καθώς και η εξαγωγή διαγνωστικών συμπερασμάτων είναι ένα πεδίο ανοιχτό προς έρευνα. Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί την δεύτερη πιο σημαντική αιτία θανάτου στην Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής και τον Καναδά. Η θνησιμότητα που οφείλεται στον καρκίνο του προστάτη μπορεί να μειωθεί από την έγκαιρη πρόγνωσή του. Όσο ποιο έγκαιρη είναι η πρόγνωσή του τόσο ποιο αποτελεσματική είναι η θεραπεία του. Ο προστάτης είναι ένας αδένας που βρίσκεται στο εσωτερικό του σώματος, κάτω από την ουροδόχο κύστη του άνδρα και περιβάλλει την ουρήθρα. Τον αδένα αυτό τον έχει ένας άνδρας ήδη από την στιγμή που γεννιέται. Με την λειτουργία του συμβάλει, στον έλεγχο της ούρησης, το οποίο το πετυχαίνει λόγω της ανατομικής του θέσης, στον εμπλουτισμό του σπέρματος με χρήσιμα και απαραίτητα συστατικά και στη λειτουργία της εκσπερμάτισης. Ο καρκίνος του προστάτη είναι η ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων στον αδένα αυτόν. Τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται πολύ πιο γρήγορα από τα φυσιολογικά κύτταρα, και έτσι, η ολοένα αυξανόμενη συγκέντρωσή τους δημιουργεί όγκους. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα έχουν την δυνατότητα να μεταφέρονται σε άλλα σημεία του σώματος (κάνουν μετάσταση) και να καταστρέφουν τα υγιή κύτταρα. Η πρωτεομική με την εφαρμογή της φασματογραφίας μάζας έχει βοηθήσει σημαντικά στην πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη και στην ανακάλυψη γνωστών βιοδεικτών του καρκίνου του προστάτη όπως είναι το ειδικό αντιγόνο του προστάτη (PSA), η προστατική όξινη φωσφατάση (PAP), το ειδικό πεπτίδιο του προστάτη (PSP) και το ειδικό αντιγόνο μεμβράνης του προστάτη (PSMA). Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια συνήθεις γυναικολογική κακοήθεια με ποικίλα ιστολογικά χαρακτηριστικά. Είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνου ανάμεσα σε όλες τις γυναικολογικές κακοήθειες, καθώς και ο πέμπτος πιο συχνός τύπος καρκίνου μεταξύ γυναικών του δυτικού κόσμου. Η πλειοψηφία των κακοηθών όγκων των ωοθηκών εμφανίζεται σε γυναίκες ηλικίας άνω των 65 χρόνων, ενώ οι καλοήθεις όγκοι είναι συνηθέστεροι σε νεότερης ηλικίας γυναίκες μεταξύ 25 και 45 χρόνων. Λόγω της πολυπαραγοντικής φύσης του καρκίνου, είναι πολύ πιθανό, μια ομάδα βιοδεικτών να είναι πιο ενδεικτικοί για την πρόβλεψη της βιολογικής συμπεριφοράς διαφόρων όγκων, από την χρήση ενός μόνο βιοδείκτη. Το CA-125 είναι ένας δείκτης ο οποίος χρησιμοποιείται για την διάγνωσης και συγκεκριμένα στην πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Η επιβεβαίωση του και αξιοπιστία του βιοδείκτη CA-125 οδήγησε στην ευρέως χρήση του, ως βιοδείκτης για τον καρκίνο των ωοθηκών, καθώς και στην κλινική διάγνωση της ανταπόκρισης του ασθενούς κατά την θεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατες προσπάθειες επικεντρώθηκαν στην βελτίωση της διαγνωστικής ακρίβειας του CA-125, είτε χρησιμοποιώντας μόνο τον συγκεκριμένο βιοδείκτη (CA-125), είτε χρησιμοποιώντας τον με νέους βιοδείκτες που έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο των ωοθηκών. Ο βιοδείκτης CA-125 βρίσκεται στο μητρικό γάλα και στο αμνιακό υγρό στις υγιείς γυναίκες. Παρόλα αυτά υπάρχει επίσης σε γυναίκες με γυναικολογικά προβλήματα όπως μητρικό λειομύωμα και ενδομητρίωση μειώνοντας έτσι την ειδικότητα του βιοδείκτη. Επιπροσθέτως άλλοι βιοδείκτες οι οποίοι έχουν βρεθεί είναι οι prostasin, OVX1, CA-15.3, CA-72.4, και inhibin. Έτσι οι στόχοι της παρούσας διατριβής είναι: (i) ο κατάλληλος συνδυασμός των βημάτων, προεπεξεργασίας, εξαγωγής χαρακτηριστικών, επιλογής χαρακτηριστικών και επιλογής ταξινομητή ώστε η διάγνωση να είναι ακριβέστερη από τις υπάρχουσες μεθόδους. (ii) να προταθούν βιοδείκτες (biomarkers) και συγκεκριμένα τιμές φάσματος (μάζας/φορτίου) οι οποίες ενδεχομένως να σχετίζονται με τις ασθένειες προς μελέτη (Καρκίνου του προστάτη και των ωοθηκών). Για την εκπλήρωση των ανωτέρω στόχων σχεδιάστηκαν και αναπτύχθηκαν μεθοδολογίες με στόχο την ακριβή διάκριση των υγειών από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και ωοθηκών. Προτείνονται τιμές μάζας/φορτίο οι οποίες ενδεχομένως να αποτελέσουν χρήσιμους βιοδείκτες για τον καρκίνο του προστάτη και για τον καρκίνο των ωοθηκών. Επίσης υλοποιήθηκε μεθοδολογία για να μπορέσουμε να ερευνήσουμε την διαγνωστική αξία των κορυφών, των πρωτεομικών φασμάτων, με διάφορες τιμές έντασης και κυρίως των χαμηλών, οι οποίες θεωρούνται ως πλούσιες σε πληροφορία από τους βιολόγους.

Ιστορικά, τα ευρήματα των C.B. Huggins (Huggins and Hodges, 1941; Huggins, 1963) και A.V. Schally (Schally et al., 1984) αποτέλεσαν την απαρχή μιας ερευνητικής πορείας με αφετηρία το πεδίο της νευροενδοκρινολογίας και προορισμό εκείνα της γυναικολογίας και της ογκολογίας. Η γνώση αναφορικά με τη φυσιολογία της ενδογενούς ορμόνης (LHRH) και το ρόλο της στην παθοβιοχημεία των ασθενειών (ενδοκρινικών διαταραχών και ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων) και υπό το πρίσμα της πρωτεύουσας ή υποστηρικτικής θεραπευτικής προσέγγισης, κατέστησε τον ιατρικό ευνουχισμό μέσω της δράσης στον υποδοχέα της LHRH – Ι στρατηγική επιλογής για την καταπολέμηση των ενδοκρινικών διαταραχών και των ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων (καρκίνος του μαστού, καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος του ενδομητρίου, καρκίνος του προστάτη). Μια πληθώρα αναλόγων της LHRH έδωσε και δίνει το παρόν σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο, με τη συστηματική έρευνα, σύνθεση και ανάπτυξη να αποδίδουν μόρια – αγωνιστές ή – ανταγωνιστές του υποδοχέα της LHRH – Ι, πεπτιδικής (γραμμική ή κυκλική δομή, stapled peptides) ή μη φύσης ως μοναδιαίες οντότητες ή σε σύζευξη με ένα ευρύ φάσμα κυτταροτοξικών μορίων (Αnderes et al., 2003; Keramida et al., 2006; Persson et al., 2009; Kritzer, 2010; Mezo and Manea, 2010). Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στην in vitro και in vivo αξιολόγηση και φαρμακοκινητική μελέτη καινοτόμων αναλόγων της LHRH – κυκλικής και γραμμικής δομής – στη βάση του ορθολογικού μοριακού σχεδιασμού και αποσκοπώντας σε εναλλακτικές προσεγγίσεις για την καταπολέμηση του καρκίνου του προστάτη (και έτερων ενδοκρινικών διαταραχών), συγκριτικά με το leuprolide (εμπορικά διαθέσιμος αγωνιστής του υποδοχέα της LHRH – Ι). Η παρούσα διδακτορική διατριβή θέτει ως υπόθεση εργασίας πως καινοτόμα ανάλογα της LHRH των ήδη υπάρχοντων στην κλινική με βελτιωμένο φαρμακοκινητικό προφίλ δύναται να αποτελέσουν τη βάση βέλτιστων εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων με ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα, δρώντας in situ ή/ και προσφέροντας νέες δυνατότητες χορήγησης, εστιάζοντας στην οδό ή/ και τη μείωση της συχνότητας αυτής. Η εν λόγω ερευνητική προσέγγιση εστιάζει στον καρκίνο του προστάτη, μια νόσο που χρήζει εναλλακτικής θεραπευτικής στρατηγικής, δεδομένης της χαμηλής αποτελεσματικότητας αυτής (η νόσος προοδευτικά γίνεται ανεξάρτητη των ορμονών και συνεπώς, μεταστατική), αλλά και της χαμηλής ποιότητας ζωής των ασθενών στη βάση του «συμβιβασμού» με τις οδούς χορήγησης που εφαρμόζονται σήμερα στην κλινική (depot formulations). Επιπρόσθετα και κατά την εκπόνηση της εν λόγω ερευνητικής προσέγγισης αναπτύχθηκαν, επικυρώθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν καινοτόμες μεθοδολογίες υγρής χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας (LC – MS/ MS) σε βιολογικά υγρά – ηπατικά μικροσώματα (μύα, επίμυα, ανθρώπου), νεφρικές μεμβράνες μύα, πλάσμα και όρχεις μύα – και έτερα υποστρώματα (κυτταρικά εκχυλίσματα, υδάτινο περιβάλλον ιχθύων Danio rerio), οι οποίες, εν συνεχεία, συζεύχθηκαν με in vitro ή/ και in vivo βιοδοκιμασίες. Τα πειραματικά ευρήματα συγκρίθηκαν με εκείνα των εμπορικά διαθέσιμων αναλόγων της LHRH, με αγωνιστική (leuprolide) ή ανταγωνιστική δράση (antide, cetrorelix). Πιο αναλυτικά και λαμβάνοντας υπόψην το «νοσηρό» φαρμακοκινητικό προφίλ των αναλόγων της LHRH που χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική, διερευνήθηκε η in vitro (ηπατικά μικροσώματα μύα, επίμυα και ανθρώπου – νεφρικές μεμβράνες μύα) και in vivo (πλάσμα μύα) πεπτιδική σταθερότητα των υπό μελέτη αναλόγων, συγκριτικά με την LHRH και εμπορικά διαθέσιμα ανάλογα αυτής (antide, leuprolide). Τα ευρήματα επέτρεψαν την αξιολόγηση και ταξινόμηση των αναλόγων του ενδιαφέροντος βάσει πεπτιδικής σταθερότητας (δοκιμασία σάρωσης). Ταυτόχρονα, προσδιορίστηκε το μεταβολικό τους προφίλ, αποκαλύπτοντας τους ευάλωτους πεπτιδικούς δεσμούς, καθώς και τις εμπλεκόμενες ενδοπεπτιδάσες (NEP – EC 3.4.24.11, ACE – EC 3.4.15.1). Τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με τη χρήση ειδικών ενζυμικών αναστολέων (ενδεικτικά: DL – Thiorphan). Ο νεφρός βρέθηκε να είναι το πρωτεύον μεταβολικό όργανο. Η ανίχνευση και η ημι – ποσοτικοποίηση των μεταβολικών προϊόντων οδήγησε στον προσδιορισμό σχέσεων δομής – δραστικότητας, αποτελώντας τη βάση του ορθολογικού σχεδιασμού καινοτόμων μορίων. Οι απορρέουσες σχέσεις δομής –δραστικότητας υποστηρίζουν πως (i) η μεθυλίωση της υδροξυλομάδας της Tyr5, (ii) η αντικατάσταση της Pro9 από Aze και (iii) η κυκλοποίηση ενισχύουν την πεπτιδική σταθερότητα των αναλόγων του ενδιαφέροντος. Στα πλαίσια μελετών φαρμακοδυναμικής, αναπτύχθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/ MS για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό της τεστοστερόνης και των υπό μελέτη αναλόγων σε πλάσμα (0, 05 – 100 ng/mL) και όρχεις μύα (2, 0 – 2000 ng/g). Η τεστοστερόνη θεσπίστηκε βιοδείκτης αποτελεσματικότητας (efficacy) και τοξικότητας (toxicity) στη βάση του καίριου ρόλου που διαδραματίζει το εν λόγω στεροειδές στη φυσιολογία του άξονα υποθάλαμος – υπόφυση – γονάδες και την παθοβιοχημεία των ενδοκρινικών διαταραχών και του ορμονο – εξαρτώμενου καρκίνου του προστάτη. Η φαρμακολογική απόκριση (απελευθέρωση τεστοστερόνης) βρέθηκε πως είναι ειδική και λαμβάνει χώρα μέσω του υποδοχέα της LHRH – Ι. Πιο σημαντικά, επετεύχθη ιατρικός ευνουχισμός, βάσει ιστοπαθολογικών ευρημάτων και προσδιορισμού της τεστοστερόνης (πλάσμα και όρχεις μύα), κατόπιν επαναλαμβανόμενης ενδοπεριτοναϊκής χορήγησης του επιλεγμένου καινοτόμου γραμμικού αναλόγου της LHRH, linearGnRH1. Το ίδιο ανάλογο βρέθηκε να έχει κυτταροστατική δράση σε πειράματα κυτταρικού πολλαπλασιασμού (κύτταρα LNCaP και PC3). Παράλληλα και υπό το πρίσμα του ρόλου της LHRH στην παθοβιοχημεία έτερων ορμονο – εξαρτώμενων καρκίνων (καρκίνος του μαστού, καρκίνος των ωοθηκών, καρκίνος του ενδομητρίου), αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και βελτιστοποιήθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/ MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό της 17β – οιστραδιόλης σε βιολογικά υγρά. Τέλος, αναπτύχθηκε καινοτόμος μεθοδολογία LC – MS/MS για τον ποσοτικό προσδιορισμό πεπτιδίων του ενδιαφέροντος στο υδάτινο περιβάλλον των ιχθύων του είδους Danio rerio. Το καινοτόμο γραμμικό ανάλογο της LHRH, linearGnRH1, δεδομένου του φαρμακοκινητικού/ φαρμακοδυναμικού του προφίλ, δρα υποστηρικτικά ως προς την υπόθεση της παρούσας διδακτορικής διατριβής, σύμφωνα με την οποία καινοτόμα ανάλογα των ήδη υπάρχοντων στην κλινική με βελτιωμένο φαρμακοκινητικό προφίλ δύναται να αποτελέσουν τη βάση βέλτιστων εναλλακτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων με ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα, δρώντας in situ ή/ και προσφέροντας νέες δυνατότητες χορήγησης, εστιάζοντας στην οδό ή/ και τη μείωση της συχνότητας αυτής. Το linearGnRH1 δύναται να αποτελέσει τη βάση για τον ορθολογικό σχεδιασμό μορίων (stapled peptides, μιμητές), αποσκοπώντας σε εναλλακτικές θεραπευτικές στρατηγικές για την καταπολέμηση του ορμονο – εξαρτώμενου καρκίνου ή/ και των ενδοκρινικών διαταραχών. Πέραν του linearGnRH1, ας σημειωθεί πως κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής συγκεκριμένα καινοτόμα κυκλικά ανάλογα της LHRH (cyclicGnRH1, cyclicGnRH2, cyclicGnRHDL1, cyclicGnRHDL2) εμφάνισαν ένα διακριτό φαρμακοκινητικό προφίλ. Το φαρμακοδυναμικό προφίλ των εν λόγω κυκλικών πεπτιδίων απαιτείται να διερευνηθεί περαιτέρω με την εφαρμογή των καινοτόμων μεθοδολογιών LC – MS/MS που αναπτύχθηκαν, επικυρώθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν κατά την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Συνολικά, η καινοτομία της εν λόγω ερευνητικής προσέγγισης έγκειται (i) στην ανάπτυξη, επικύρωση και βελτιστοποίηση ενός πλήθους μεθοδολογιών LC – MS/MS σε σύζευξη με in vitro και in vivo βιοδοκιμασίες, οι οποίες και αποτελούν ένα διακριτό αναλυτικό εργαλείο και (ii) στο προκλινικό φαρμακολογικό μοντέλο που αναπτύχθηκε με την επιλογή του μύα ως ζωικό πρότυπο. Κοινή συνισταμένη, η εν τω βάθει αξιολόγηση της φαρμακοκινητικής/ φαρμακοδυναμικής των πεπτιδίων του ενδιαφέροντος με το ερευνητικό βλέμμα στα πεπτιδικά φάρμακα.. stapled peptides.. μιμητές.. / The highly influential findings of C. B. Huggins (Huggins, 1963) and A. V. Schally (Schally et al., 1984) brought a new era in the research fields of neuroendocrinology, gynecology and oncology. The knowledge acquired regarding the physiology of LHRH and its role in the pathobiochemistry of the disease resulted in the consideration of medical castration via the LHRH receptor as a well established strategy for the treatment of endocrine disorders (e.g. precocious puberty) and hormone – dependent cancers (breast cancer, endometrial cancer, prostate cancer). Numerous LHRH analogues have been synthesized and evaluated both in the clinic and preclinical level. Overall, systematic work has resulted in the synthesis of LHRH receptor agonists and antagonists, either peptides (linear, cyclic, stapled peptides) or small organic molecules as entities or combined with various cytotoxic molecules (Αnderes et al., 2003; Keramida et al., 2006; Persson et al., 2009; Kritzer, 2010; Mezo and Manea, 2010). Although extensive research has been carried out in the field of hormonal therapy, poor pharmacokinetic properties still characterize LHRH peptide analogues. Poor stability of LHRH analogues compromises efficacy, while the need for their subcutaneous administration (depot formulations) aggravates the quality of life for cancer patients. Nowadays, LHRH analogues in the clinic most likely achieve the desired pharmacologic effects by action primarily on the pituitary and to a much lesser extent by direct antiproliferative effects on tumor cells. Herein, we hypothesize that stable analogues of such super – agonists would be advantageous, either by allowing a reduction in dosing frequency or by allowing the use of analogues that act directly on the tumor, with possible additive effects and subsequent enhancements in efficacy. In this context, the pharmacokinetic/ pharmacodynamic profiles of novel LHRH analogues were determined both in vitro and in vivo. Similarly, commercially available LHRH analogues (leuprolide, antide, cetrorelix) served as positive controls. Novel LC – MS/MS based approaches (LC – MS/ MS methodologies coupled to in vitro and in vivo bioassays) were developed, validated and optimized for the evaluation of the peptide analogues in question (linear or cyclic) in various biological fluids and matrices; (i) mouse, rat and human liver microsomes, (ii) mouse kidney membrane preparations, (iii) mouse plasma and tissue (testis), (iv) egg – water (Danio rerio embryos environment). Furthermore, a novel LC – MS/MS based approach was developed, validated and optimized for the simultaneous quantification of testosterone and peptides in question, upon the intraperitoneal administration of peptide analogues in mice. Testosterone served as an efficacy and toxicity biomarker. Peptide metabolism was thoroughly studied by an LC – MS/MS based approach coupled to an in vitro bioassay (mouse kidney membrane preparations), allowing (i) structural elucidation and semi – quantitation of metabolites (and peptides) as a function of time, (ii) determination of the susceptible to proteolysis peptide – bonds, (iii) structure – activity relationships (SARs) and (iv) peptide ranking (screening assay). Taking into account the role of LHRH in gynecology and hormone – dependent cancers of breast, endometrium and ovary, an LC – MS/MS based approach was developed for the quantification of 17β – oestradiol (efficacy and toxicity biomarker) in mouse plasma upon the intraperitoneal administration of peptide analogues in mice. A novel LC – MS/MS based approach was also developed for the quantification of peptides of interest in the aquatic environment of Danio rerio. Employing the aforementioned analytical tools, peptide stability against proteolysis was evaluated both in vitro (mouse kidney membrane preparations) and in vivo (mouse plasma). LHRH and commercially available analogues served as positive controls. The SARs derived suggested that enhanced stability was achieved by (i) methylation on the hydroxyl group of Tyr5, (ii) replacement of Pro9 by Aze and (iii) cyclisation. Hence, new promising chemical entities could be synthesized and developed on the basis of rational drug design. Metabolic profiles were also determined revealing the susceptible to proteolysis peptide bonds. Susceptible peptide bonds and endopeptidases involved were further confirmed in the presence of specific endopeptidase inhibitors. A facile preclinical mouse model was developed in the context of our objectives. Intraperitoneal administration was selected, since (i) it is a mix – mode type of administration with elements of rapid absorption and (ii) oral administration was not practical due to the low bioavailability of the peptides that were tested. The LC – MS/MS based quantification of the selected bioactive peptides and their corresponding metabolites as well as the selective monitoring of biomarkers (e.g. testosterone) in response to drug dose, in plasma and testes, combined with the appropriate preclinical mouse model, represents a distinctive approach. The mouse model described in this paper is particularly valuable, since (i) the human LHRH receptor is homologous to the mouse receptor (Millar, 2004), (ii) information on in vitro and in vivo stability can be obtained with a relatively small amount of peptide (1 – 2 mg), (iii) information on the LHRH receptor agonism (receptor specific in vivo modulation) can be obtained by using testosterone as a marker, (iv) it allows the determination of the dosing regimen required for efficacy based on action on the pituitary, (v) it can become the basis of follow up experiments on genetically modified mouse animal models or other tumour xenografted mouse models (Sharpless and Depinho, 2006; Morgan et al., 2008). The robust sensitive methodology that was developed for the quantification of testosterone in mouse plasma (0.05 – 100 ng/mL) or determination of testosterone in testes (2 – 2000 ng/g) provides an excellent handle on compound efficacy assessment. Testosterone as an efficacy and toxicity biomarker was found to be specific upon peptide binding to the LHRH receptor. Medical castration was achieved upon the repeated dosing of a selected novel linear analogue (linearGnRH1). Measurements in plasma were further supported by statistical significant testosterone values in testis and histopathological findings (atrophy). Moreover the testis weights of the treated animals were significantly lower in comparison to the control group (atrophy induced by dosing), thus making the differences in testosterone testis concentration between control and peptide treated animals even more pronounced. Although the binding affinity of linearGnRH1 on the LHRH receptor was not as high as the binding affinity of leuprolide (~ 15 nM versus <1 nM), the in vivo efficacy between the two analogues was similar (at the tested dose), suggesting that the enhanced stability or bioavailability of linearGnRH1, compensates for binding affinity differences. LinearGnRH1 was also found to be anti – proliferative upon dosing in LNCaP cells (as potent as the superagonist leuprolide). It is possible that linearGnRH1 can play a significant role for the treatment of hormone – dependent cancers, by acting not only at the pituitary level (thus, suppressing the pituitary – testicular axis), but also by exerting an antitumor activity directly on cancer cells, as has been previously shown for other LHRH agonists (Maudsley et al., 2004; Marelli et al., 2006). Except for linearGnRH1, selected cyclic analogues (cyclicGnRH1, cyclicGnRH2, cyclicGnRHDL1, cyclicGnRHDL2) exhibited a distinct pharmacokinetic profile. Their pharmacodynamic profiles should be evaluated further employing the novel LC – MS/MS based approaches developed and validated in this study. Overall, the novelty of the approach described herein consists of (i) the LC – MS/MS methodologies coupled with in vitro and in vivo bioassays developed, validated and employed that provide a distinct analytical tool and (ii) the facile preclinical pharmacological mouse model developed and employed. The approach aims to the pharmacokinetic/pharmacodynamic evaluation of the peptides of interest towards a new generation of peptide drugs.. stapled peptides.. mimetics. Considering the pharmacokinetic/ pharmacodynamic profiles of linearGnRH1, findings on this novel analogue satisfy our hypothesis according to which stable analogues of the LHRH super – agonists used in the clinic would be advantageous, either by allowing a reduction in dosing frequency or by allowing the use of analogues that act directly on the tumor, with possible additive effects and subsequent enhancements in efficacy. LinearGnRH1 can serve as the platform for the rational drug design of new chemical entities (stapled peptides, mimetics) for the treatment of hormone – dependent cancers and/ or endocrine disorders.

Orientador: Marco Antônio Rodrigues Fernandes / Resumo: O presente estudo consiste na análise da viabilidade econômica e financeira da implantação da radioterapia de intensidade modulada (IMRT) no tratamento do câncer de próstata e comparar seus benefícios clínicos frente aos procedimentos similares custeados pelos sistemas de saúde públicos e privados. Para tanto, foram analisadas as distribuições de dose de radiação preconizadas nos planejamentos radioterápicos com as técnicas de radioterapia conformacional tridimensional (3D-CRT) e de intensidade modulada (IMRT), prescrita para 20 pacientes com câncer de próstata tratados em um serviço de radioterapia privado. Para verificação da qualidade da distribuição de dose de radiação no volume de tratamento, foram analisados os índices de homogeneidade (IH) e de conformidade (IC) de cada um dos planos radioterápicos estudados. Em comparação com a técnica 3D-CRT, a técnica de IMRT permitiu uma melhor cobertura e conformação da dose prescrita no volume alvo de planejamento (PTV), porém distribuída de forma mais heterogênea. Além disso, avaliou-se os custos financeiros para aquisição dos equipamentos de irradiação e manutenção dos tratamentos, bem como os valores de repasses feitos pelos sistemas de saúde para os procedimentos de radioterapia em próstata. / Mestre

The androgen receptor’s (AR) resurgence following treatment leads to castration resistant prostate cancer (CRPC). Studies show that the aryl hydrocarbon receptor (AhR) regulates AR signaling, is constitutively active, and enhances AR signaling in CRPC. AhR has ligands with carcinogenic properties and interacts with phytochemicals with anti-tumorigenic properties. Curcumin inhibits AhR activity and multidrug transporter ABCG2 activity, which mediates substrates out of the cell. Elevated ABCG2 expression causes resistance to anticancer drugs. AhR transcriptionally activates ABCG2 and our hypothesis is that inhibition of AhR activity by curcumin will decrease ABCG2 expression and activity in CRPC cells. C4-2 cells were treated with increasing concentrations of curcumin (0, 10, 25, 50µM) and CH223191 (50µM). Results show that curcumin decreases AhR, CYP1B1 and ABCG2 gene expression. Higher concentrations of curcumin diminish AhR and ABCG2 protein expression, ABCG2 activity, and cell proliferation. These results will help reveal a role for AhR in drug resistance.

The extension from Quantitative Magnetic Resonance Imaging to synthetic imaging has the clear advantage of being able to continually image the patient after the exam. MR techniques such as DWI are commonly used but have some clear disadvantages resulting from the use of echoplanar imaging. It should then be asked whether one imaging technique is objectively better. If one technique is better, the incorporation in clinical settings could produce better diagnostic rates, and save valuable time. In order to quantitatively assess the quality of these techniques, the SNR and CNR values of similar tissues were compared. The pre-analysis discussion concentrating on the spatial resolution and artifacts, supports that synthetic images have an advantage over DWI due to higher resolution and absence of artifacts. The SNR and CNR values were calculated for each patient and image type for the comparison, initially assuming that the synthetic images would have a higher mean SNR and CNR. In most cases the differences between scan types was found to not be statistically significant. In conclusion, this analysis could not support the initial theory that the synthetic images had a higher SNR or CNR. The research shows that they are more likely to be comparable. An investigation of the diagnostic power of the synthetic in comparison to standard DWI would give clinical relevance to these results.

The development of novel imidazopyridines, which includes both tetrahydroimidazo[1,5-a]pyridine (rIMP) and imidazo[1,5-a]pyridine (IMP) was investigated using conventional and microwave induced procedures that afforded compounds at high yield of 88-96%. rIMP was synthesized using a two-step procedure that involved the microwave synthesis of IMP, then the reduction of the pyridine moiety of the fused imidazopyridine rings using 10% Pd/C and hydrazine monohydrate. The microwave synthesis of imidazopyridines involved the one pot reaction of 2-benzoylpyridine, substituted benzaldehyde and ammonium formate in acetic acid under open vessel microwave conditions, which resulted in products within 40 minutes. Novel PEG-IMP development, involved the synthesis of ethylene glycol tethered benzaldehydes and IMPs using traditional Williamson etherification synthesis, which afforded products at a high yield of 92-95%. We have then shown IMP and rIMP roles in its antiproliferative property towards PCa cells, specificity in inhibiting PI3K isoforms, and structural motif’s interaction with different residues in the kinase binding domain of the class I PI3K isoforms. The antiproliferative property towards PC3 cells shows increased activity with compounds containing pyridyl group on carbon 3 of the imidazo[1,5-a]pyridine parent moiety with signs of toxicity to PC3 within 24 hours of incubation and at 1 μM of the parent compound. Furthermore, the IMPs were tested against five prostate cellular lines: PC3, RWPE1, D145, LNCaP and LNCaP C81. IMPs showed little activity towards RWPE1 and increased activity towards PC3 cells. We determined that functionalizing the phenyl group at position 1 increased the efficacy of rIMP compared to the IMP. After showing increased toxicity to PC3 cells, it was important to investigate the mechanism in which IMP pose toxicity towards PC3 cells. The biochemical assay showed that rIMP was more effective in inhibiting PI3Kα isoform compared to both pan inhibitor wortmannin and IMP. Both IMP and rIMP inhibited more than 60% of PI3Kγ isoform activity at nanomolar concentrations. After showing IMPs affinity to PI3K isoforms, we investigated the binding interactions rIMP and IMP towards the PI3K isoforms using MOE molecular modeling software.

L’HBP et le cancer de la prostate constituent les deux maladies prostatiques les plus répandues chez l’homme âgé. La compréhension de leur étiologie et de leur pathogenèse est nécessaire afin de permettre la prévention mais aussi la recherche et le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Notre but est d’étudier l’implication du stress oxydatif dans l’HBP et d’étudier l’effet de l’extrait de propolis sur le cancer de la prostate in vivo chez le rat Wistar et in vitro sur les cellules LNCaP. Nous avons montré que : 1) Le stress oxydatif joue le rôle de promoteur dans le développement de l’HBP, 2) Le benzo(a)pyrène administré aux rats Wistar induit le développement du cancer de la prostate, 3) La propolis induit la diminution de la prolifération, de l’expression du Ki-67 (-49 %) et de l’expression de AhR chez le rat Wistar, 4) La propolis possède un effet antiprolifératif sur les cellules LNCaP via le blocage de la signalisation de AR. / BPH and prostate cancer are the two most prevalent prostatic diseases in elders. Understanding their etiology and pathogenesis is necessary in order to prevent them and to enhance both research and development of new therapeutic agents. Our goal is to study the implication of oxidative stress in BPH and to study the effect of propolis extract on prostate cancer in vivo in Wistar rats and in vitro on LNCaP cells. We have shown that: 1) Oxidative stress acts as a promoter in the development of BPH, 2) Benzo(a)pyrene administered to Wistar rats induces the development of prostate cancer, 3) Propolis induces a decrease in proliferation, Ki-67 expression (-49%) and AhR expression in the Wistar rat, (4) Propolis has an antiproliferative effect on LNCaP cells via AR signaling blockade.

Malgré le rôle des variants constitutivement actifs du récepteur des androgènes (RA) et du stroma tumoral dans le cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC), leurs relations restent inconnues. Nous rapportons l’impact de l’interleukine-6 (IL-6) sécrétée par les cellules stromales prostatiques (PrSC) sur les cellules épithéliales tumorales prostatiques exprimant les variants autonomes du RA. Le milieu de culture conditionné par les PrSC (CMPrSC) contenait des taux élevés d’IL-6 et induisait une augmentation de l’activité transcriptionnelle de STAT3 dans les LNCaP et C4-2b exprimant le variant RAQ640X, via une activation de pY705-STAT3. Cette activité de STAT3 était inhibée par la neutralisation de l’IL-6. L’analyse par mRNA array et RT-qPCR a mis en évidence un profil transcriptomique spécifique lié à l’expression du RAQ640X et à l’exposition au CMPrSC, impliquant les fonctions de motilité, d’invasion et de migration cellulaires, et l’expression de gènes favorisant la dissémination métastatique. Ainsi, nos résultats illustrent une coopération épithélio-stromale «privilégiée» en présence de variants autonomes du RA, impliquée dans la progression tumorale. / Constitutively active androgen receptor (AR) variants and stromal microenvironment are involved in castration resistant prostate cancer (CRPC), but their relationship remains unknown. We describe the effects of interleukin-6 (IL6) secreted from prostate stromal fibroblast cells (PrSC) towards prostate epithelial cancer cells expressing constitutively active AR variants. Conditioned culture medium from PrSC (CMPrSC) contained high levels of IL-6 and led to an increased STAT3 transcriptional activity in LNCaP and C4-2b cells expressing the ARQ640X variant, through pY705-STAT3 activation. This STAT3 activity was significantly diminished with neutralizing antibody anti-IL6. Gene expression analysis using mRNA array and RT-qPCR highlighted a specific transcriptional profile related to ARQ640X expression and PrSC exposure, resulting in cellular motility, invasion and cellular migration, and IL-6 genes expression promoting metastatic dissemination. Overall, our data emphasize a “preferred” epithelio-stromal cooperation when expressing constitutive active RA variants, which contributes to tumor progression.

O câncer de próstata é a segunda causa de morte entre homens no Brasil. É tipo um câncer de crescimento lento, podendo levar anos para o tumor atingir 1 cm3, porém, em alguns casos ele pode se espalhar pelo corpo, sendo o osso o principal sítio de metástase. No estágio de desenvolvimento do câncer conhecido como metástase, o principal tratamento consiste em terapia de restrição andrógena, levando as células prostáticas a pararem de proliferar, uma vez que elas crescem em resposta a presença de hormônios andrógenos, como a diidrotestosterona e testosterona. Porém, em alguns casos, as células proliferam mesmo na ausência de andrógenos e isto se deve a diversos fatores que, em geral, estão associados a mutações no receptor andrógeno e/ou alterações no metabolismo andrógeno. Quando isto acontece, os tratamentos disponíveis são menos efetivos e costumam falhar. Porém, estudos sugerem que o γ-orizanol, um fitoesterol extraído do óleo do farelo do arroz; e extratos amplamente utilizados na medicina popular, como o extrato hidroalcólico de Thuya occidentalis, poderiam atuar inibindo o desenvolvimento e progressão do câncer de próstata. Neste estudo, com o uso de abordagens bioquímicas e de biologia molecular, foi demonstrado que o tratamento com γ-orizanol diminui a viabilidade e biomassa celular em cultura, associado ao aumento da morte celular por apoptose e/ou necrose, em linhagens celulares responsivas (LNCaP) e não-responsivas a andrógenos (PC3 e DU145), além de aumentar a pERK1/2 em células LNCaP e DU145. O γ-orizanol também foi capaz de bloquear o ciclo celular em G2/M nas células PC3 e LNCaP e em G0/G1 nas células DU145. Estes efeitos foram ainda acompanhados por uma redução da expressão do gene e proteína caveolina-1- uma importante molécula envolvida no aumento da agressividade do câncer de próstata, e também, na progressão da doença para o fenótipo andrógeno resistente - nas células não-responsivas a andrógenos, e do gene PCGEM1 - gene específico da próstata regulado por andrógeno - nas células LNCaP e DU145. Ainda, γ-orizanol também mostrou capacidade de regular vários miRNAs - pequenas moléculas de RNA não codificantes de proteínas - envolvidos no controle de funções associadas ao desenvolvimento, progressão e invasão no câncer de próstata, como o miR16-1, miR19b-2, miR24b-1, miR24b-2, miR99a, miR133a-5p, miR182-5p, miR198 e miR222. O extrato hidroalcólico de Thuya occidentalis reduziu a viabilidade e biomassa celular nas linhagens responsiva (LNCaP) e não-responsivas (DU145 e PC3) a andrógenos, além de induzir parada do ciclo celular na fase G0/G1 nas células DU145 e aumentar a morte celular por apoptose e/ou necrose em todas as linhagens. Da mesma forma que o γ-orizanol, este extrato reduziu a expressão da caveolina-1 nas linhagens não-responsivas a andrógenos. Trabalhos anteriores mostram que o monoterpeno α-tujona é o principal composto ativo do extrato de Thuya occidentalis. Por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas foi mostrada a existência de 0,0016 μg de α-tujona na dose de extrato usada neste estudo. No entanto, o tratamento com 0,0016μg de α-tujona foi efetivo somente sobre linhagem LNCaP, não tendo efeito sobre as outras linhagens estudadas, reforçando a hipótese da diferença de sensibilidade entre as linhagens responsivas e não responsivas a andrógeno e mostrando a contribuição de outros componentes do extrato nos efeitos observados neste estudo. Concluindo, estes resultados demonstram que tanto γ-orizanol como o extrato de Thuya occidentalis podem vir a ser agentes terapêuticos promissores no tratamento de câncer de próstata, não só por inibirem o crescimento celular, mas também e principalmente pela possibilidade de induzirem a recuperação da sensibilidade a andrógenos, aumentando as possibilidades de tratamento da doença. / Prostate cancer is the second cause of death among men in Brazil. It is a slowgrowing cancer and it may take years for tumor to reach 1 cm3, but in some cases it can spread throughout the body and the bone is the main site of metastasis. At this cancer stage known as metastasis, the principal treatment involves antiandrogen therapy, leading to prostate cells stop proliferating, because they grow in response to presence of androgens such as testosterone and dihydrotestosterone. However, in some cases, the cells can proliferate even in the absence of androgens and this fact occurs due to many factors and they are generally associated with mutations in the androgen receptor and/or alterations in androgen metabolism. In this stage, the treatments available are less effective and usually fail. However, studies suggest that γ-oryzanol, a phytosterol extracted of rice bran oil; and extracts widely used in folk medicine, as Thuya occidentalis hidroalcolic extract, could act inhibiting the development and progression of prostate cancer. In this study, using molecular biology and biochemical approaches we showed that γ- oryzanol treatment was able to decrease cell viability and biomass in culture, and this fact was linked to increased cell death by apoptosis and/or necrosis in androgen responsive (LNCaP) and unresponsive (DU145 and PC3) prostate cancer cell lines, besides increasing pERK1/2 in LNCaP and DU145 cells. γ- oryzanol was also able to cause cell cycle arrest at G2/M phase in LNCaP and PC3 cells and at G0/G1 phase in DU145 cells. These effects were also accompanied by a reduction in caveolin-1 gene and protein expression - an important molecule related to high aggressiveness in prostate cancer and also in the progression of the disease to androgen resistant phenotype - in androgen unresponsive cells, and also PCGEM1 gene - a prostate specific gene regulated by androgens - in LNCaP and DU145 cells. γ-oryzanol also showed ability to regulate several miRNAs - small non-coding RNA molecules - involved in the control of many functions associated with the development, progression and invasion of prostate cancer, such as miR16-1, miR19b-2, miR24b-1, miR24b-2, miR99a, miR133a-5p, miR182-5p, miR198 and miR222. Thuya occidentalis hidroalcolic extract also reduce cell viability and biomass in androgen responsive (LNCaP) and unresponsive (DU145 and PC3) cells, in addition to inducing cell cycle arrest at G0/G1 phase in DU145 cells and to increase apoptosis and/or necrosis cell death in all cell lines. The same way that γ-oryzanol, this extract reduced the caveolin-1 expression in androgen unresponsive prostate cancer cells. Prior studies showed that the monoterpene α-thujone is the main active compound in the T. occidentalis extract. By gas chromatography coupled to mass detector it was showed the existence of 0.0016 μg of α-thujone in extract dose used in this study. However, the treatment with 0.0016 μg of α-thujone was effective only on LNCaP cell line, having no effect on the other studied lines, supporting the hypothesis of difference in sensitivity between responsive and unresponsive cell lines and showing the contribution of other components in the effects caused by the extract, observed it this study. In conclusion, these results demonstrate that both γ-oryzanol as T. occidentalis extract may become promising therapeutic agents in treatment of prostate cancer, not only inhibit cell growth but also and manly by the possibility of inducing the recovery of androgen sensitivity, increasing the treatment chances of treatment this disease.