Le parvovirus H-1 (PVH-1) est un petit virus à ADN simple brin qui se réplique de façon lytique préférentiellement dans les cellules transformées du fait de leur profil d’expression particulièrement favorable à l’activation du cycle viral. Cette caractéristique est connue sous le nom d’oncotropisme. Le génome de PVH-1 compte deux unités transcriptionnelles. La première contrôlée par le promoteur précoce P4, dont l’activation dépend de la prolifération et de la transformation cellulaires, permet l’expression des protéines non structurales NS1 et NS2, et la deuxième gouverne l’expression des protéines de capside VP1 et VP2 en réponse au promoteur P38. L’ensemble du cycle de PVH-1 dépend étroitement de la protéine NS1 qui intervient dans des processus aussi importants que la réplication de l’ADN viral, l’activation du promoteur P38 ou encore la cytotoxicité du virus. La protéine NS1 est finement régulée aussi bien au niveau trancriptionnel via le promoteur P4 dont l’activation dépend de l’état de transformation et de prolifération cellulaires, que post-traductionnel. Le but de ma thèse a été d’identifier de nouveaux éléments déterminants dans la mise en place de ces régulations et de mettre en évidence leur implication dans le cycle de vie et l’oncotropisme du PVH-1. / H 1 parvovirus (H-1PV) is a little single stranded DNA virus that preferentially replicates in a lytic manner in transformed cells due to their expression profile that meets the requirements for the activation of H¬ 1 PV life cycle unlike normal cells. This feature is known as oncotropism. H 1PV genome is constituted by two transcriptional units. The first one is driven by the proliferation and transformation dependent P4 promoter and allows the expression of both non structural proteins NS1 and NS2, and the second one controls the expression of both capsid proteins VP1 and VP2 through the activation of P38 promoter. H-1PV life cycle tightly depends on NS1 protein that is involved in crucial events, including viral DNA replication, P38 promoter activation as well as cytotoxicity.NS1 protein is regulated at both transcriptional and post translational levels.My thesis aimed at identifying new determining elements for both of these regulations and characterizing their involvement in both H-1PV life cycle and oncotropism.

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Introduction : La protéase High Temperature Requirement Factor A1 (HtrA1) pourrait être associée au pronostic du cancer de l’ovaire (CO). Objectif : Évaluer l’effet de l’expression de HtrA1 dans des tissus tumoraux sur le pronostic des femmes avec un CO séreux. Méthodes : Une étude de cohorte a été menée chez 122 femmes ayant un CO séreux traitées au CHU de Québec entre 1993-2006. Par immunohistochimie, l’expression de HtrA1 a été mesurée de façon visuelle et informatisée (% noyaux positifs). Des risques relatifs (HR) de progression et de décès ont été estimés avec le modèle de Cox multivarié. Résultats: Un faible pourcentage de noyaux marqués par HtrA1 était associé à une diminution des risques de progression (visuel HR=0,66, p=0,04, informatique HR=0,63, p=0,03) et de décès (visuel HR=0,69, p=0,09, informatique HR=0,56, p=0,01). Conclusion : La sous-expression de HtrA1 était associée à un meilleur pronostic des femmes avec un CO séreux. / Background: The protease High Temperature Requirement Factor A1 (HtrA1) might be associated with prognosis in ovarian cancer (OC). Objective: To evaluate the effect of HtrA1 expression in tumoral tissues on prognosis of women with serous OC. Methods: A cohort study was conducted among 122 women with a serous OC treated at the CHU de Québec between 1993-2006. Tissue microarrays were immunostained for HtrA1. HtrA1 expression was assessed visually and by digital image analysis (% of positive nuclei). Cox regression multivariate models taking into account standard prognostic factors were used to estimate adjusted hazard ratios (HR) of progression and death. Results: Low percentage of HtrA1 marked nuclei was associated with lower risks of progression (visual HR=0.66, p=0.04, digital HR=0.63, p=0.03) and death (visual HR=0.69, p=0.09, digital HR=0.56, p=0.01). Conclusion: Nuclear downregulation of HtrA1 was associated with a better prognosis in women with serous OC.

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, plusieurs des protéines impliquées dans l'assemblage et le remodelage de la paroi cellulaire sont produites sous forme inactive ou nécessitent une régulation négative une fois leur travail effectué. Des enzymes protéolytiques doivent donc intervenir à des moments précis pour réguler leur activité. Parmi ces enzymes on retrouve Kex2p, une protéase à sérine impliquée dans la maturation protéolytique des précurseurs protéiques acheminés vers la voie de sécrétion, et Yps1p, une aspartyl protéase dont la fonction est encore peu connue puisque aucun de ses substrats biologiques n'a encore été identifié. Par conséquent, notre objectif principal était de découvrir un ou plusieurs substrats naturels de l'endoprotéase Yps1 dans le but de lui associer une fonction précise. Puisque certaines évidences semblaient indiquer une implication possible de Yps1p dans la régulation des propriétés de la paroi cellulaire via le clivage endoprotéolytique de la chitine synthétase I, nous avons premièrement tenté de démontrer un lien direct entre Yps1p et l'activation de cette enzyme. Toutefois, nos résultats ont plutôt démontré que Yps1p était impliquée dans l'activation d'une ou plusieurs autres protéines que Chs1p. Nous avons donc opté pour une approche plus globale en caractérisant les phénotypes des mutants yps1[delta], kex2[delta] et yps1[delta]kex2[delta]. C'est alors que nous avons fait un premier lien entre Yps1p et les mannoprotéines de la paroi cellulaire. Par la suite, une comparaison entre les profils électrophorétiques des mannoprotéines sécrétées dans le milieu de culture nous a permis d'identifier quelques candidats potentiels que nous avons ensuite caractérisés par séquençage en N-terminal. En plus de confirmer que Yps1p joue un rôle important dans la régulation des propriétés de la paroi cellulaire chez S. cerevisiae, nos résultats ont démontrés que cette endoprotéase est impliquée dans le clivage endoprotéolytique de Gas1p, une [bêta] 1,3-glucanosyltransférase responsable de l'élongation des chaînes latérales de [bêta] 1,3-glucans. Par conséquent, cette découverte fait de Gas1p le premier substrat naturel de l'endoportéase Yps1 à être identifié.

La nemosis est un processus d’activation cellulaire déclenché in vitro par la mise en culture tridimensionnelle (sphéroïde) de cellules mésenchymateuses saines et qui se termine inéluctablement par une mort cellulaire de type nécrose programmée. Les fibroblastes sont les entités cellulaires les plus représentées dans la pulpe dentaire. Le premier objectif de ce travail était de confirmer l’existence de la réaction némotique dans ces cellules pulpaires et de la comparer à celle du fibroblaste pulmonaire pris comme référence. La caractérisation de ce phénomène a permis de mettre en évidence des similitudes mais aussi des différences marquées entre ces deux types cellulaires, en termes de libération de cytokines, de production d’enzymes protéolytiques et d’expressions géniques. Le second objectif de cette étude était de différencier la réaction némotique d’une autre nécrose programmée, la nécroptose. La finalité de ce travail était d’objectiver si cette activation fibroblastique peut se retrouver in vivo lors de pathologies pulpaires. / Nemosis is a cell activation process – induced in vitro when sound mesenchymal cells are forced to cluster (spheroids) – which inevitably leads to a programmed necrotic cell death. Fibroblasts are the most commonly found cells in the dental pulp. The first aim of this study was to confirm that nemotic reaction could be observed in these cells and to compare their behaviour with that of sound lung fibroblasts, employed as a reference model for nemosis. This process displayed not only important similarities but also differences between the two cell types studied regarding cytokines release, proteolytic enzymes production and gene expressions. The second purpose of this work was to discriminate between nemosis and necroptosis, which is a programmed necrotic cell death. Finally, this study aimed to highlight whether this nemotic cell activation can occur in vivo during dental pulp diseases.

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation sévère de l'intestin grêle et du côlon et comprennent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Les MICI sont des maladies complexes faisant intervenir des facteurs génétiques : certains senseurs bactériens, l'autophagie et le stress du réticulum endoplasmique. Un défaut de barrière de l'épithélium digestif est également fortement impliqué dans la physiopathologie du processus inflammatoire. La fonction barrière de l'épithélium digestif est assurée par plusieurs types cellulaires, synthétisant entre autres, des peptides antimicrobiens (PAM) et des mucines. Dans les MICI, une augmentation de la perméabilité intestinale et une perte de muco-sécrétion ont été décrites. Les protéases jouent un rôle fondamental dans la digestion du bol alimentaire mais également dans le maintien de l'homéostasie intestinale en activant ou dégradant divers motifs moléculaires, ou in induisant des signaux spécifiques aux cellules par l'activation de quatre récepteurs : les PARs (Protease-Activated Receptor). Dans les MICI, un excès d'activité protéolytique de type trypsine est observé. L'origine de cette activité est théoriquement attribuée aux cellules immunitaires, à une surproduction pancréatique ou au microbiote, mais les cellules épithéliales intestinales semblent également être une source majeure de protéases. L'objectif de mon projet de thèse visait à étudier l'impact des principales voies impliquées dans les MICI sur l'homéostasie des protéases épithéliales et le rôle de celles-ci dans la déstabilisation de la fonction de barrière. Nos résultats ont confirmé un excès de protéases à sérine dans les cellules épithéliales de patients atteint de MC ou de RCH. In vitro, sur des monocouches de cellules Caco-2, l'induction de l'autophagie diminuait la libération apicale de protéase de type trypsine, alors que le senseur bactériens NOD2 n'avait aucun effet. A l'inverse, une stimulation du Stress du réticulum endoplasmique (SRE) par la Thapsigargin, induisait une libération accrue de protéases actives de type trypsine au pôle apical des cellules. [...] / Crohn's disease (CD) and Ulcerative colitis (UC) are two forms of Inflammatory Bowel Disease (IBD), a chronic inflammatory pathology affecting the digestive tract. Patients suffer from relapsing flares, diarrhea, abdominal pain and bleeding. Although the molecular mechanisms of IBD are poorly understood, recent data suggest that IBD occurs in genetically predisposed individuals developing an abnormal immune response to intestinal microbes after, being exposed to specific environmental triggers. Genetic studies have reported more than 170 polymorphisms susceptible to be involved in IBD pathogenesis. The strongest associations have highlighted three main pathways altered in IBD including bacterial sensing (NOD2, CD), autophagy (ATG16L1 and IRGM, CD) and endoplasmic reticulum stress (ER-Stress) (XBP1, UC). The role of intestinal barrier function is also strongly implicated in IBD pathogenesis, and is modulated by factors present in the lumen derived from microbiota, food or at a molecular level, by factors such as proteases. In IBD pathophysiology, the inflammatory process is characterized by impaired intestinal biology including disruption of tight junctions and leaky gut, decreased amount of Paneth and Goblet cells, and translocation of luminal antigens triggering inflammation. Previous studies have demonstrated an increased level of active serine proteases in the stools and tissues of IBD patients, supposing that proteases originate from infiltrated immune cells, pancreatic secretion or microbiota. However, our team has reported that intestinal epithelial cells are a major source of serine proteases, in particular trypsin-like enzymes, are released by a stressed epithelium in pathogenic context such as irritable bowel syndrome. In this project, we aimed at better understanding whether the three main pathways involved in IBD (Nod2, autophagy, ER-stress) could be linked to an epithelial release of trypsin and reciprocally, if epithelial trypsin is able to induce or modulate these three IBD pathways. We confirmed that trypsin-like activity was significantly higher in biopsies from UC and CD patients compared to healthy controls. In Caco-2 monolayers cultured in transwells, secreted trypsin-like proteolytic activity remained stable upon NOD2 stimulation but decreased under autophagy induction. Thapsigargin (Tg) stimulation a well-known ER-stress inducer, enhanced the apical release of trypsin-like activity in Caco2 cells. [...]

The search for more effective treatment strategies in melanoma led to many new innovative approaches aiming at different molecular targets. Chemotherapy still remains the most effective treatment and many efforts are put in order to improve targeting and delivery of the chemotherapeutic agents. Among these, peptide conjugates of anticancer drugs were designed to increase stability, cell penetration, specificity and accumulation in cancer cells. We as well as others evaluated such a conjugate, termed PSF (L-prolyl-m-L-sarcolysyl-L-p-fluorophenylalanine-ethylester) in terms of its cytotoxicity in vitro and in vivo using a human melanoma tumor as a model, its stability, transport, and metabolisation. <p>By comparing the cytotoxicity of PSF and melphalan towards different cancer primary melanoma cell cultures, we noticed some interesting observations: PSF displayed the same toxicity pattern both in short (2h) and long term (24h) cell exposures whereas melphalan and m-sarcolysin needed long term exposure to reach the same toxicity. This could indicate that PSF very quickly penetrates the cells in accordance with what has been shown with red blood cells (RBCs). PSF has shown a much better and quicker penetration into the cells in vitro as compared to melphalan. <p>In this present work, the cytotoxic effect of PSF was further evaluated in vivo using a standardized nude mice tumor model bearing a human melanoma. First, the acute toxicity in rats and mice and the maximum tolerated dose were determined. After a dose-escalation study one dose was singled out and tested as a single dose and as a fractionated dose. PSF was able to reach the tumor site and a dose-response relationship was observed. The IP administration of fractionated doses of PSF had significantly better effect on tumor growth inhibition, regression and regrowth than single dose administration and this without any evidence for general toxicity monitored by animal weight loss. We also compared the efficacy of PSF to its parent drug m-sarcolysin, melphalan and cyclophosphamide and observed that PSF was much more active than both melphalan and m-sarcolysin at the same molar doses.<p>Body distribution of the 14C-labelled PSF revealed ratios of 2.4 and 1.5 compared to muscle tissue for the two melanoma tumors evaluated with no significant and stable accumulation in any vital organ. The amount of tracer was still high in the blood after 24 hours explaining the high radioactivity in the kidney and partly in the liver. Interestingly, the spleen had an unusual high radioactivity uptake reflecting the exceptional binding of the tracer to blood cells (BC), while the pancreas very high load was an indicator of protease-mediated specific delivery and strongly support our hypothesis elaborated on the basis of in vitro results. <p><p>Our in vitro data point to a particular mechanism of action of PSF based on the transport of PSF through the body by the rapid binding to blood cells and the delivery at the tumor site by the subsequent release of its active metabolites due to cleavage by tumor-associated proteases.<p>Concerning the binding of PSF to membranes and its transport the following observations were made: while PSF was stable in human plasma, it disappeared very quickly in whole blood along with the generation of a main metabolite: m-sarcolysin. The presence of BC membranes was required for both binding and generating the metabolites. Binding to natural or artificial membranes was achieved and only competition with melanoma cells or proteolytic enzymes such as dispase, led to the generation of active metabolites. The different metabolites were isolated using preparative LC and were then identified using Electrospray Ionisation Mass Spectrometry (ESI). Three metabolites, of which m-sarcolysin was the main one, were identified all bearing the chloroethyl alkylating group. <p>Enzymatic catalysis was further supported by a set of experiments where the enzymatic activity was non-specifically and specifically inhibited. In order to look at the effect of extracellular matrix proteases on PSF, three representatives of ECM proteases were incubated with PSF: collagenase A had no effect, but both dispase and trypsine were able to process PSF. <p>The following data indicate the higher processing of PSF in the presence of cells with a higher proteolytic activity and thus the delivery of the blood cell-bound PSF. When comparing BC with melanoma cells (MC), the latter showed a higher ability to bind and process PSF both by membrane-associated and most interestingly soluble proteases. A lot of families of enzymes are reported to be overexpressed by melanoma cells including: metalloproteases, cysteine cathepsins, serine proteases and aminopeptidases. All the melanoma cells and cell lines evaluated were able to generate PSF active metabolites. <p>To identify the families of enzymes expressed on the membrane of melanoma cells that might be involved in the mechanism of action of PSF, we performed 2D-gel electrophoresis on their membrane extracts. The 2D-gels experiments revealed the presence of proteins compatible with enzymes known to be important in melanoma and further work is needed to identify the individual enzymes involved by using mass spectrometry and Western blotting. <p><p>Both our in vitro and in vivo findings strongly suggest that not only melanoma tumor cells and tumor sites but other types of tumors as well may be targets for the toxic activity of PSF owing to their much higher load in proteolytic enzymes that are closely related to their invasive potential. The transport of PSF by the blood cells and the release of its metabolites at the tumor site result in a low amount of drug in its free soluble form within the blood and this may explain the relatively lower side-effects observed. PSF is thus expected to have a much better therapeutic index than conventional alkylating agents. This original mechanism of drug delivery may well be extended to other cancer and non-cancer drugs than alkylating agents.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’objectif de cette thèse était de développer et d’optimiser de nouvelles méthodologies et approches analytiques afin d’améliorer le potentiel de l’analyse protéomique pour les études biologiques.La première partie de ce travail est consacrée à la détermination massive et exacte de la position N-Terminale des protéines (N-Terminome). Pour cela, nous avons utilisé et développé une approche basée sur une dérivation N-Terminale au TMPP. Cette méthodologie de marquage de la position N-Terminale a permis d’aborder l’étude des clivages protéolytiques des protéines exportées par le parasite P. falciparum (pathogène de la malaria) dans le globule rouge.Afin de permettre une exploitation automatique à haut débit des données de MS/MS, nous avons élaboré une nouvelle méthodologie (dénommée dN-TOP). Celle-Ci repose sur l’utilisation de TMPP portant des isotopes stables et permet ainsi d’accéder à la détermination des positions N-Terminales pour des études de N-Terminome à large échelle.La seconde partie est dédiée aux développements de différentes stratégies analytiques de quantification, aussi bien au niveau peptidique qu’au niveau protéique, appliquées à une série de problématiques biologiques. Ces optimisations ont été réalisées dans le contexte de l’étude des complexes protéiques, du dosage de prion par SRM, de quantification des glycations d’anticorps monoclonaux thérapeutiques et de l’hémoglobine HbA2 pour la standardisation des méthodes de référence. / The objective of this Ph.D. thesis was to develop and optimize new methodologies and analytical approaches to improve the potential of the mass spectrometry based proteomics.The first part of this work focused on the development of the N-Termini proteomics. This topic was addressed with a specific N-Termini chemical derivatization based on TMPP. We have shown that our method allowed both specific N-Terminomics and classical proteomics studies in the same experiment.This N-Terminus methodology was applied to study the proteolytic cleavages of the exported proteins in P. falciparum, a parasite responsible for the malaria.In order to automatize the complex and tedious informatics processsing of the MS/SM data of ourTMPP based N-Terminomics method, we have introduced a new approach (named dN-TOP), based on the use of a stable isotope labeled TMPP which made now N-Terminome proteomics compatible with high throughput studies.The second part addresses quantitative aspects of proteomics. It describes the optimization of quantitative methods at the peptide level or at the protein level for five different proteomic studies in the context of protein complex subunits, targeted SRM based prion, quantification of monoclonal antibodies glycation and hemoglobin HbA2 for reference measurement methods standardization.