Hypertrophie bezeichnet eine zelluläre Anpassungsleistung, die durch vermehrte Arbeitsbelastung ausgelöst wird und durch Zunahme von Zellgröße und Proteinsynthese sowie durch Veränderungen der Genexpression bei konstanter Zellzahl gekennzeichnet ist. Beim Ubiquitin-Proteasom-System handelt es sich um den wichtigsten intrazellulären Proteinabbaumechanismus eukaryontischer Zellen. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle im regulierten Abbau zellulärer Signalmediatoren und Transkriptionsfaktoren. In einem Hypertrophiemodell mit neonatalen Rattenkardiomyozyten wurde die Wirkung von Proteasominhibitoren auf die Ausbildung einer Hypertrophie untersucht. Behandlung mit Proteasominhibitoren (MG132, MG262) führte dabei zu einer dosisabhängigen Reduktion des Effekts der eingesetzten hypertrophieinduzierenden Agonisten (Isoproterenol, Angiotensin II, Phenylephrin). So konnte mit Hilfe morphometrischer Analysen Phalloidin-gefärbter Kardiomyozyten eine Verringerung des Zellwachstums gezeigt werden. Western Blots belegten eine verringerte Expression von Hypertrophiemarkerproteinen (beta-myosin heavy chain, alpha-sarcomeric actin, alpha-smooth muscle actin). Analog zu diesen Befunden konnte in einem Reportergenassay die Abnahme der Expression des brain natriuretic peptide (BNP) gezeigt werden. Eine reduzierte RNA- und Proteinsynthese konnte mit Hilfe der Inkorporation radioaktiver Substrate nachgewiesen werden. Als Nachweis für die effiziente Inhibition des Proteasoms durch MG132 dienten Western Blots akkumulierter, polyubiquitinierter Proteine, die reduzierte proteasomale Degradation fluorogener Substrate sowie die Akkumulation eines grün fluoreszierenden Proteins nach Transfektion mit einem Ubiquitin-GFP-Konstrukt. Als mögliche Mechanismen des antihypertrophen Effekts der Proteasominhibitoren konnten eine verringerte Aktivierbarkeit der MAP Kinasen ERK 1/2 (Western Blots) sowie eine reduzierte Aktivität des Transkriptionsfaktor NFkappaB (Reportergenassay) identifiziert werden. / Myocardial hypertrophy is an important adaptive response of the heart to increased workload. It is characterized by an increase in cell size and protein synthesis, and alterations in gene expression. The ubiquitin-proteasome-system is the major pathway for intracellular protein degradation in eucaryotic cells. It plays a major role in the regulated degradation of central signal mediators and transcription factors. In a model system of neonatal rat cardiomyocytes we investigated the effects of proteasome inhibitors on myocardial hypertrophy. Treatment with specific proteasome inhibitors reduced the hypertrophic effects of all used agonists (e.g. isoproterenol, phenylephrin) dose-dependently: 0.05-1 µM MG132 resulted in a marked reduction of cell size as determined by morphometric analysis of phalloidin-stained myocytes. Moreover, western blot analysis showed a concentration-dependently reduced expression of hypertrophic marker proteins (beta-myosin heavy chain, alpha-sarcomeric actin, alpha-smooth muscle actin). This correlated well with a suppressed expression of brain natriuretic peptide in reportergene assays. Reduced RNA and protein synthesis was determined by incorporation of radioactively labeled substrates. Efficient inhibition of the proteasome by MG132 was confirmed by increased accumulation of multi-ubiquitinated proteins in western blot analysis, by reduced degradation of fluorogenic substrates and by accumulation of a ubiquitin-conjugated variant of the green fluorescent protein. Suppression of cardiomyocyte hypertrophy by proteasome inhibition corresponded to reduced ERK 1/2 activation (determined by phospho-specific antibodies) and decreased NFkappaB activation (determined by luciferase assays).

Das Humane Cytomegalievirus (HCMV) ist ein ubiquitäres Pathogen, welches den Metabolismus der Wirtszelle auf vielfältige Weise manipuliert, um seine eigene Vermehrung zu begünstigen. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass auch das Ubiquitin-Proteasom-System in die HCMV-Replikation involviert ist. So konnte zunächst gezeigt werden, dass die Chymotrypsin-ähnliche (CT-L) Aktivität des konstitutiven Proteasoms in HCMV-infizierten Zellen signifikant erhöht ist. Wurde die CT-L Proteasomaktivität durch Proteasominhibitoren (PI) blockiert, so hatte dies die Hemmung der HCMV-Replikation zur Folge. Die Charakterisierung des Einflusses von PI auf die virale Proteinexpression ergab, dass bei niedriger MOI (MOI 0.1) deutlich verringerte Mengen der sehr frühen Proteine vorlagen, dieser Effekt jedoch bei hoher MOI (ab MOI 1) aufgehoben war. Die Expression früher Proteine war MOI-unabhängig reduziert. Hingegen war die Expression der späten Proteine MOI-unabhängig vollständig unterdrückt. Studien mit dem Nukleosidanalogon BrdU ergaben zudem, dass die de novo Synthese viraler DNA blockiert war. Um erste Hinweise auf den Wirkungsmechanismus von PI zu erhalten, wurde untersucht, ob der Transkriptionsfaktor NF-kappaB oder zelluläre Transkriptionsrepressoren wie z.B. hDaxx am anti-HCMV-Effekt beteiligt sind. Durch die Charakterisierung einer Virusmutante mit Deletion der NF-kappaB-Bindestellen im MIE-Enhancer/Promotor konnte gezeigt werden, dass der antivirale Effekt von PI nicht auf der Hemmung der Aktivierung von NF-kappaB beruht. Experimente mit hDaxx-knockdown Zellen ergaben hingegen, dass die Stabilisierung des Transkriptionsrepressors hDaxx partiell zum anti-HCMV-Effekt von PI beiträgt. Darüber hinaus müssen jedoch weitere virale oder zelluläre Zielproteine existieren, deren Beeinflussung durch PI kritisch für die Virusreplikation ist. Zusammenfassend stellt das Proteasom somit einen neu identifizierten potentiellen Angriffspunkt für die anti-HCMV-Therapie dar. / The Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous pathogen that manipulates many aspects of the host cell metabolism to enhance viral replication. This work demonstrates that the ubiquitin-proteasome system is also involved in HCMV replication. First of all, the chymotrypsin-like (CT-L) activity of the constitutive proteasome was significantly increased in HCMV infected cells. In the presence of proteasome inhibitors (PI) viral replication was efficiently blocked. Characterisation of the influence of PI on viral protein expression showed that immediate early protein expression was clearly reduced at low MOI (MOI 0.1); however, this effect was abolished at high MOI (starting from MOI 1). Expression of early proteins was significantly decreased independently of the MOI used for infection. In contrast, late protein expression was completely suppressed at both low and high MOI. Additionally, studies using the nucleoside analogue BrdU showed that PI block the de novo synthesis of viral DNA. In order to gain insight into the working mechanism of PI the involvement of the transcription factor NF-kappaB and cellular repressors of transcription (e.g. hDaxx) in the antiviral effect of PI was examined. Studies using a mutant virus carrying deletions of the NF-kappaB binding sites in the MIE-enhancer/promoter revealed that the anti-HCMV effect of PI is not due to inhibition of NF-kappaB activation. Analyses using hDaxx-knockdown cells showed that stabilisation of the transcriptional repressor hDaxx partially contributes to the antiviral effect of PI. However, the existence of additional viral or cellular target proteins of PI is very likely. In summary, the proteasome thus represents a newly identified and promising target for anti-HCMV therapy.