Memoria para optar el título de Bioquímico / La enzima piridoxal quinasa (PLK) pertenece a la familia de quinasas sin dominio menor de la superfamilia de la riboquinasa y cataliza la formación de piridoxal-5’-fosfato (PLP) a partir de piridoxal (PL) y de un complejo metal divalente–ATP (Me+2-ATP), siendo fundamental en la vía de salvataje de PLP en diversos organismos. PLP es la forma activa de la vitamina B-6 y es el segundo cofactor más usado en la naturaleza, luego del ATP, principalmente relacionado con el metabolismo de los compuestos aminos, como los aminoácidos. A partir de análisis filogenéticos se infirió que existen cuatro clados de PLK bien diferenciados, tres de los cuales corresponden al dominio de las bacterias y uno al dominio de los eucariontes, estando ausente el dominio de las arqueas, las que sólo poseen una vía de biosíntesis de novo de PLP. En el caso de las bacterias, uno de los clados corresponde a las proteínas que son homólogos cercanos del gen pdxK y los otros dos clados son homólogos cercanos del gen pdxY, donde en uno se encuentran las PLK de firmicutes, bacteroidetes, espiroquetas, fusobacterias y termotogales, mientras que en el otro se encuentran las PLK de proteobacterias, actinobacterias y deinococos-thermus. Además, se distinguieron tres motivos de secuencia conservados, los cuales corresponden a DPV, NXXE y GXGD, asociados a la unión de sustratos, unión de Mg+2 y la catálisis. La estructura de PLK de origen humano (hPLK) posee una alta similitud estructural con PLKs de otras fuentes, como de Ovis aries y Escherichia coli, salvo en algunos loops de la estrucura. hPLK, que fue expresada en E. coli, se purificó y caracterizó cinéticamente. En cuanto al uso de diferentes metales divalentes (Me+2), se observó que la mayor velocidad inicial se obtiene a bajas concentraciones de Zn+2 libre. En relación a los parámetros cinéticos, la Vmax fue de 4789 U/mg y la kcat de 3,2 s-1, en tanto, la Km para PL fue de 490 μM, mientras que para ZnATP-2 fue de 20 μM. El pH óptimo de hPLK fue de 6,4 en las condiciones usadas. Respecto a la regulación de la actividad enzimática, se determinó que hPLK es inhibida por PL, ZnATP-2 y Zn+2 libre, mientras que las especies ATP-4 y HATP-3 no generan cambios en la actividad de la enzima. La inhibición por Zn+2 libre posee un IC50 de 37 μM, en tanto que la Kd para Zn+2, determinada por fluorescencia intrínseca, es de 266 nM. El Zn2+ libre presenta un patrón de inhibición complejo: cuando se varía el sustrato ZnATP-2 los datos se ajustan a un modelo de inhibición denominado sistema C1 de tipo mixto lineal, mientras que cuando se varía el sustrato PL, los datos se ajustan a dos modelos, debido a que se observa un perfil de inhibición dual dependiendo de la concentración de Zn+2 libre. El primer modelo, que explica el comportamiento inhibitorio hasta una concentración de Zn+2 libre de 50 μM, es lo que se denomina sistema C5 de inhibición de tipo mixto hiperbólico, en tanto que el segundo modelo, que explica el comportamiento inhibitorio desde 50 μM a concentraciones mayores, corresponde a un modelo de inhibición incompetitiva modificado, en el cual se incluye la unión de un Zn+2 adicional a la enzima libre

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La proteína quinasa CK2 es una quinasa ubicua que fosforila serinas y treoninas de un gran grupo número de proteínas celulares. La holoenzima CK2 existe como un tetrámero (CK2a2b2) donde CK2a es la subunidad catalítica con actividad proteína quinasa y CK2b es la subunidad regulatoria que modula la actividad y confiere estabilidad a CK2a. CK2 es una enzima muy conservada en diferentes especies, es esencial para la viabilidad celular y está presente en distintos compartimientos y organelos celulares. Además, CK2 ha sido encontrada unida a la cara externa de la membrana plasmática, actuando como ectoquinasa, catalizando la fosforilación de distintas proteínas extracelulares y regulando distintos procesos como migración, adhesión y proliferación celular. Estudios previos utilizando la transfección de células HEK293T en cultivo, han demostrado que es necesaria la expresión de ambas subunidades a y b para la aparición de actividad ectoquinasa en la superficie celular. La ectoquinasa se libera de la membrana en la presencia de sustratos específicos. El presente trabajo exploró la posibilidad de que la subunidad regulatoria CK2b pudiera exportar al medio extracelular otra proteína unida covalentemente a su cadena polipeptídica. El modelo experimental consistía en la cotransfección de células HEK293T en cultivo celular, con DNAs que codifican para las proteínas de fusión a CK2b y la CK2a. Se utilizó dos tipos de de proteínas de fusión: la glutathion S-transferasa unida a CK2b (GST-CK2b) y la proteína fluorescente verde también unida a CK2b (GFP-CK2b), en ambos casos la unión fue al extremo amino-terminal de CK2b. Se observó que estas proteínas de fusión se expresan, junto con CK2a, a niveles de actividad catalítica parecidos, pero siempre menores a los observados con la expresión de CK2b no modificada. Los resultados mostraron consistentemente a la proteína de fusión en los lisados celulares, pero no fue posible de detectarlas en el medio extracelular. Para estos análisis se utilizaron técnicas muy sensibles como inmunoprecipitación específica, ensayos de actividad catalítica e inmunoblot (western blot). Se concluye que la fusión de CK2b con otra proteína no altera per se el proceso de expresión de la proteína ectópica, pero si inhibe su traspaso por la membrana plasmática hacia el medio extracelular, posiblemente debido a la orientación estérica de las moléculas recombinantes usadas

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína CK1 es una familia de proteínas quinasa a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas: CK1α, CK1β, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, CK1δ y CK1ε. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para esto, analizamos los patrones de expresión de estos genes mediante RT-PCR e hibridización in situ. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera similar en cuanto a su temporalidad, ya que ambas se detectan desde la primera hora post fecundación (h.p.f). CK1δ1 presenta un patrón ubicuo hasta las 8 h.p.f y limitándose después al sistema nervioso central. Por su parte, la expresión de CK1δ2 presenta ubicuidad hasta las 24 h.p.f, restringiéndose posteriormente a la zona cefálica y al primordio de las aletas pectorales. Para analizar la función de ambas isoformas se efectuaron estudios de sobre expresión, mediante la inyección en embriones de pez cebra de los mRNAs codificante para CK1δ1 y CK1δ2, y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección en embriones de los mRNA de las formas Dominantes Negativas de cada uno de los genes estudiados. Estos experimentos se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula y posteriormente incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores específicos de desarrollo embrionario, en embriones inyectados con una cantidad conocida de mRNA de CK1δ1 y CK1δ2, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podrían estar involucradas estas isoformas. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que la sobre expresión de ambas isoformas, CK1δ1 y CK1δ2, inducen distintos grados de malformación en cerebro anterior y ojos, siendo el fenotipo principal observado con la inyección de CK1δ1 los embriones sin ojos. El bloqueo de función mediante Dominantes Negativos indujo, en ambas isoformas, embriones dorsalizados y ciclópicos. Se puede concluir, que las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 están participando en la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente cerebro anterior y ojos. / FONDECYT N° 1020753 y por Millenium Nucleus in Developmental Biology

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína quinasa CK1 es una familia de proteínas a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas (α, β, δ, ε, γ-1, γ-2 y γ-3). En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1α y CK1ε en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para ello, hemos analizado los patrones de expresión de estos genes mediante hibridización in situ y RT-PCR. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera diferencial temporal y espacialmente durante el desarrollo embrionario. CK1α se detecta desde la primera hora post fertilización y presenta un patrón de expresión ubicuo en los primeros estadíos para luego restringirse a la región cefálica y a las aletas pectorales, mientras que CK1ε no presenta un componente materno y el mRNA cigótico es detectado después de las 12 horas post fertilización con un patrón de expresión restringido exclusivamente al cerebro. Para analizar la función de ambas isoformas se realizaron estudios de sobrexpresión mediante la inyección del mRNA codificante para CK1α y CK1ε y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección de las dominantes negativas de cada isoforma. Para CK1α también se utilizó la inyección del morfolino oligo antientido que silencia específicamente la actividad de éste gen. Estos experimentos anteriormente mencionados se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula. Posteriormente los embriones fueron incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores en embriones inyectados con el Morfolino Anti CK1α, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podría estar involucrada esta ultima isoforma. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que CK1α, a diferencia de CK1ε, está involucrada en los procesos que regulan la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente en las que se encuentran ubicadas en el límite entre cerebro medio y posterior (cerebelo y cuarto ventrículo). En cambio, CK1ε solo tendría participación en la formación de estructuras cerebrales sin afectar la formación de los ejes en el embrión en desarrollo / La realización de esta tesis fue financiada en parte por el proyecto FONDECYT N° 1020753

Cartas al editor

En este trabajo de tesis se ha investigado la relación de las enzimas esfingosina quinasa 1 (SphK1) y hemoxigenasa 1 (HO-1) con el cáncer. En el caso de la primera de estas enzimas se ha podido demostrar que se encuentra sobre expresada en carcinomas escamosos de cabeza y cuello y que su presencia se correlaciona con una menor sobrevida de los pacientes. Se ha aportado evidencia indicando que dicha correlación puede ser la manifestación de una relación de causa y efecto en la que esta quinasa estimula la proliferación celular disminuyendo los niveles de p21Cip1, e inhibe la apoptosis al disminuir los niveles de caspasa 3 clivada e incrementar los de p-Bad. En cuanto a HO-1 se ha explorado su relación con el cáncer en el carcinoma escamoso de cabeza y cuello y en cáncer de pul-món y de mama, tanto en tumores humanos como en modelos animales. En carcinomas escamosos de cabeza y cuello se ha demostrado que HO-1 se encuentra sobre expresada y que se correlaciona con el grado tumoral. Se ha comprobado que la enzima presenta localización nuclear además de su típica localización citoplasmática, que dicha localización es mayor en las células tumorales que en los tejidos epiteliales adyacentes y que se correlaciona con tumores más agresivos y de peor pronóstico y con la progresión tumoral. En cáncer de pulmón HO-1 se detectó en las células epiteliales del tumor mos-trando una localización principalmente citoplasmática en comparación con tejidos pulmonares de aspecto normal donde los niveles de expresión fueron menores y con localización nuclear más frecuente. También se observó que se correla-cionaba con estadios más avanzados de la enfermedad, con el tamaño tumoral y con la presencia de metástasis ganglionares. En cáncer de mama se han realizado por primera vez estudios de expresión de HO-1 en tumores humanos comprobándose que se correlaciona con una mayor sobrevida de los pacien-tes. Se ha identificado un modelo animal adecuado para estu-diar la relación de la enzima con este tipo de cáncer. Utilizan-do este modelo se ha comprobado que la activación de la misma conduce a un menor desarrollo tumoral. Se ha aportado evidencia indicando que los mecanismos que conducen a esta disminución del volumen tumoral, y tal vez también a la mayor sobrevida global de los pacientes, son la disminución en la supervivencia celular, debida a un efecto pro apoptótico, y la inhibición de la migración celular producidas por esta enzima. También se ha comprobado en este carcinoma la localización nuclear de la enzima y se ha aportado evidencia indicando que una forma truncada en el extremo carboxilo terminal se localiza en el núcleo. Esta localización nuclear no se correla-ciona con la sobrevida global de los pacientes. Finalmente, los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que ambas enzi-mas pueden ser de potencial interés como factores pronós-ticos y/o blancos terapéuticos y señalan la necesidad de continuar investigando los mecanismos celulares y moleculares que la desregulación de estas enzimas podría estar afectan-do contribuyendo así al desarrollo del cáncer. / In this thesis the relation between the enzymes sphingosine kinase 1 and heme oxygenase 1 with cancer has been inves-tigated. In the case of the former one it has been demons-trated that it is over expressed in head neck squamous cell carcinoma and that its presence correlates with a shorter patient survival. Evidence has been provided showing that such correlation could be due to a cause-effect relationship in which this kinase stimulates cellular proliferation by down regulation of p21Cip1 levels and inhibits apoptosis through a decrease in the levels of cleaved caspase 3 and an increase in p-Bad. Regarding heme oxigenase 1, its relation with cancer has been investigated in head neck squamous cell carcinoma, lung and breast cancer both in human tumors and animal models. In head and neck squamous cell carcinoma the enzyme was shown to be over expressed and to correlate with tumor grade. Furthermore, nuclear localization of the enzyme has also been demonstrated. It has also been detec-ted that such nuclear localization is more frequent in tumor cells that in adjacent non malignant tissues. Furthermore this nuclear localization correlates with lower differentiation gra-des and with tumor progression. In lung cancer the heme oxygenase 1 has been detected mainly in the cytoplasm of epithelial cells whereas it was more frequently localized in the nucleus in normal lung tissues. Additionally, enzyme levels have been demonstrated to be higher in tumor tissues than in non malignant adjacent ones and to correlate with advanced stages of the disease, with tumor size and with lymph node metastasis. This is the first study showing heme oxygenase 1 protein expression in human breast tumor tissues and its correlation with longer patient survival. This research has also identified an adequate animal model to study the relation between the enzyme and this type of cancer. In this animal model the enzyme activation leads to a decrease in tumor burden. Evidence has also been provided showing that the mechanisms responsible for this decrease in the tumor volume are the reduction in cellular survival due to a pro apoptotic effect and the inhibition of cellular migration. A nuclear locali-zation of the enzyme in this tumor type has also been de-monstrated. Evidence has also been provided that this nuclear heme oxygenase 1 is a C-terminal truncated protein. This nuclear localization does not correlate with patient sur-vival. Finally, the results obtained in this thesis suggest that both enzymes could be potentially interesting as prognostic factors and/or therapeutic targets and they encourage future investigations regarding the cellular and molecular mecha-nisms modulated by these enzymes and whose deregulation could contribute to cancer development.

Memoria para optar al título de Bioquímico / El uso de elevadas dosis de testosterona produce hipertrofia cardiaca, sin embargo los mecanismos celulares no son completamente entendidos. La proteína quinasa GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) es una quinasa que regula una amplia gama de procesos celulares como la síntesis proteica y actividad de factores transcripcionales, siendo el factor nuclear de células T activadas, NFAT, uno de los más importantes. La GSK3-β ha sido descrita como el principal regulador anti-hipertrófico celular. En este trabajo se estudió si los efectos hipertróficos de la testosterona son mediados, en parte, por la actividad de la vía de transducción de señales GSK3-β/NFAT en cultivo primario de cardiomiocitos de rata neonata. Los resultados muestran que dosis de testosterona que provocan la hipertrofia del cardiomiocito (100 nM) inducen el aumento la fosforilación de GSK3-β, determinado mediante western blot. GSK3-β puede ser fosforilada a través de las vías de señalización intracelulares PI3K/Akt y ERK1/2. En nuestro laboratorio hemos descrito que la testosterona activa ambas vías. Para evaluar si estas quinasas modulan la actividad de GSK3-β se utilizaron inhibidores específicos para ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) y Akt (Akt-inhibitor-VIII). La inhibición de la PI3K o de Akt bloqueó la fosforilación de GSK3-β inducida por testosterona, mientras que la inhibición de ERK1/2 no tuvo efectos significativos, lo que sugiere que la vía PI3K/Akt está involucrada en la inhibición de la GSK3-β. El mecanismo de acción de la testosterona involucra la unión de la hormona al receptor intracelular para andrógenos (AR). Para evaluar la contribución del AR en la inhibición de la GSK3-β, los cardiomiocitos fueron pre-incubados con ciproterona, un inhibidor del AR. La inhibición del AR no provocó cambios en el aumento de la fosforilación de la GSK3-β, lo que sugiere que el AR no participa en la inhibición de la GSK3-β inducida por testosterona. Para determinar los efectos de la testosterona sobre los principales efectores río abajo de la GSK3-β se evaluó tanto el cambio en el estado de fosforilación del eIF2Bε y el cambio en la actividad de NFAT. La estimulación de los cardiomiocitos con la hormona disminuyó la fosforilación de eIF2Bε, lo que se asocia al aumento de su actividad traductora y aumento de la síntesis proteica. Además, utilizando el inhibidor específico de GSK3-β, 1-Azakenpaulona (1-Azk), se indujo la desfosforilación de eIF2Bε, lo que sugiere que la inhibición de GSK3-β modula la activación del factor eIF2Bε inducida por testosterona. Por otra parte, la testosterona aumento la actividad transcripcional de NFAT, medida como actividad luciferasa. Al estimular con testosterona cardiomiocitos tratados con diferentes dosis de 1-Azk se observa un efecto aditivo sobre la activación de NFAT-luc, lo que sugiere una relación entre la inhibición de la GSK3-β y el incremento de la actividad de NFAT inducida por testosterona. La testosterona aumentó el tamaño celular y la expresión de la cadena pesada de la β-miosina (β-MHC) y la α-actina esquelética (SKA), considerados como parámetros hipertróficos. El tratamiento con el inhibidor de NFAT, ciclosporina A (CsA, 1 μM), evitó el aumento en del área célula inducido por testosterona. Además, el bloqueo del receptor para IP3 inhibió el aumento de los marcadores de hipertrofia β-MHC y SKA, lo que en conjunto sugiere que la vía Cn/NFAT participaría en la hipertrofia de la célula cardiaca inducida por testosterona. Por otra parte, el uso de 1-Azk por sí sólo incrementó ambos parámetros hipertróficos, lo que sugiere que la inhibición de la GSK3-β participaría en la hipertrofia del cardiomiocito. El tratamiento en conjunto con testosterona y 1-Azk no incremento los efectos hipertróficos de la hormona, lo que se podría deber a que la célula cardiaca en cultivo primario crece hasta un límite definido. La evidencia experimental de este trabajo sugiere que la testosterona induce la inhibición de GSK3-β a través de la vía PI3K/Akt, lo que se traduce en un aumento de la actividad de NFAT y de eIF2Bε. Además, la inhibición de NFAT bloquea la hipertrofia inducida por testosterona. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la vía GSK3-β/NFAT podría participar en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por la testosterona / Elevated doses of testosterone produce cardiac hypertrophy. However, the cellular mechanisms are not fully understood. The GSK3-β (glycogen synthase kinase 3-β) is a protein kinase that regulates several cellular processes like protein synthesis and transcription factors activity. Moreover, this kinase has been described as an anti-hypertrophic regulator. In this study we examined whether the hypertrophic effects of testosterone are mediated, in part, by GSK3-β in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes. The results from this study show that hypertrophic testosterone concentrations (100 nM) increased GSK3-β phosphorylation. GSK3-β can be phosphorylated by upstream signaling pathways as PI3K/Akt and ERK1/2. Previously, we have described that testosterone activates both signaling pathways. To evaluate the contribution of these kinases on GSK3-β activity specific inhibitors for ERK1/2 (PD98059), PI3K (LY294002) and Akt (Akt-inhibitor-VIII) were used Inhibition of either PI3K or Akt completely blocked the GSK3-β phosphorylation induced by testosterone, while inhibition of ERK1/2 had no effect, suggesting that PI3K/Akt pathway is involved in the inhibition of GSK3-β. Testosterone exerts most effects through the direct binding to specific intracellular androgen receptor (AR). To assess the contribution of AR in the GSK3-β inhibition, cardiomyocytes were prei-ncubated with cyproterone an inhibitor of AR. Inhibition of AR did not modifies testosterone-induced GSK3-β phosphorylation, suggesting that the AR is not involved in this event. To determine the effects of testosterone on the main downstream GSK3-β effectors both eIF2Bε phosphorylation and NFAT activity were determined. The hormone decreased eIF2Bε phosphorylation which is associated with translation activity and protein synthesis increase. Moreover, testosterone increased NFAT transcriptional activity, which is associated with gene expression. The specific inhibitor of GSK3-β, 1-Azakenpaullone (1-Azk), induced both eIF2Bε dephosphorylation and increase in the NFAT activity. In cardiomyocytes treated with 1-Azk, testosterone produced eIF2Bε activation and NFAT over-activation. Testosterone increased cell size and expression of β-MHC and SKA, both hypertrophic parameters. Treatment with the upstream NFAT phosphatase calcineurin (Cn) inhibitor cyclosporin A (CsA, 1 mM) prevented the cell area increase induced by testosterone. Furthermore, the IP3 receptor (IP3R) blockade inhibited the increase of β-MHC and SKA, which together suggest that the IP3R/Cn/NFAT pathway modulates the cardiac cell hypertrophy. Moreover, 1-Azk alone increased both hypertrophic parameters, showing that GSK3-β is involved in cardiomyocyte hypertrophy. The combined treatment of testosterone and 1-Azk did not increase the hypertrophic effects on cardiomyocytes, suggesting that cardiac cell grows until a defined limit. Experimental evidence of this work suggests that testosterone induces the inhibition of GSK3-β through the PI3K/Akt pathway, resulting in an increase in the activity of NFAT and eIF2Bε. Furthermore, inhibition of NFAT blocks testosterone-induced hypertrophy. Taken together, these results suggest that the GSK3-β/NFAT pathway is involved in cardiomyocyte hypertrophy induced by testosterone

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus herpes felino es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en el Complejo Viral Felino. Posee distribución mundial y afecta a gatos domésticos provocando lesiones tanto oculares como del tracto respiratorio superior. Su casuística en Chile es común, pese a ello su diagnóstico es sólo clínico, a diferencia de otros países donde se utilizan diversas técnicas para ello, siendo la reacción en cadena a la polimerasa (PCR) la más recomendada y con mejores resultados. El objetivo de este estudio fue implementar un método diagnóstico molecular en Chile, para ello se seleccionaron gatos menores de un año con signología clínica sugerente de la infección con herpes felino, para la detección del gen de la proteína Timidin Kinasa del virus, altamente específico y conservado, mediante la técnica de PCR anidado y posterior determinación del porcentaje de identidad nucleotídica del amplificado obtenido respecto de la base de datos genómica GenBank®. Como resultado se obtuvo una tasa de detección del 100% de las muestras y el control positivo, y una identidad nucleotídica de un 92 % comparado con la base de datos genómica del GenBank® (número de acceso E12463.1), probando que los amplificados corresponden al virus herpes felino. De esta forma se logra implementar un método diagnóstico efectivo para ser utilizado en complementación al diagnóstico clínico

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctora en Farmacología / Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno gástrico humano asociado al desarrollo de cáncer gástrico. En células epiteliales gástricas, la infección con H. pylori promueve la activación de diversas vías de señalización asociadas tanto a la progresión como al arresto del ciclo celular. Por otro lado, H. pylori ha demostrado inducir los niveles del Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α), un factor transcripcional relacionado con la expresión de genes necesarios para la progresión tumoral. Fuera de sus funciones canónicas, se ha descrito que, en el contexto de la hipoxia, HIF-1α es capaz de promover arresto del ciclo celular en la fase G1 como parte de una acción no transcripcional. No obstante esto, HIF- 1α puede ser inducido por la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, vía de señalización relacionada con progresión del ciclo celular que ha sido asociada también a la acción de H. pylori. Aunque se ha descrito que la infección con H. pylori promueve la inducción de HIF-1α, actualmente no hay antecedentes precisos acerca de la vía de señalización precedente a este fenómeno, así como tampoco de su efecto sobre el destino de las células epiteliales gástricas. En este trabajo se buscó determinar si HIF-1α representa una transición desde señales que promueven un progreso del ciclo celular hacia un arresto del ciclo celular en la infección con H. pylori. En consecuencia, se propuso estudiar si H. pylori, al activar la vía PI3K/Akt/mTOR, podría llevar a un aumento de los niveles de HIF-1α y éste, a su vez, llevar a una respuesta de arresto del ciclo celular. Para estudiar esto, se utilizó un modelo in vitro basado en células humanas derivadas de cáncer gástrico MKN45 y AGS y la cepa de H. pylori 26695. Los resultados indican que H. pylori induce un aumento transitorio de HIF-1α con localización principalmente nuclear. Al inhibir farmacológicamente la vía PI3K/Akt/mTOR, se obtuvo que la inhibición de PI3K con LY294002 y de mTOR con Rapamicina fueron capaces de prevenir la inducción de HIF-1α por H. pylori. Al silenciar HIF-1α se obtuvo una reducción del arresto del ciclo celular en G0/G1 promovido por la bacteria. Consecuente con esto, los niveles de la proteína ciclina D1, importante para lograr la transición G1/S del ciclo celular, fueron diminuidos por la infección con H. pylori, sin embargo, esta diminución fue menos severa en las células que se silenció HIF-1α. En cuanto a su actividad transcripcional, se observó que al silenciar HIF-1α se previno el aumento del mRNA de GLUT-1 promovido por H. pylori sólo a tiempos tempranos de infección, pero éstos no fueron afectados a tiempos mayores. Por lo demás, el análisis bioinformático mostró que la infección con H. pylori no incrementó significativamente la expresión de genes blancos clásicos de HIF-1α en la mucosa antral. Finalmente, al analizar la acción de los componentes solubles o de la pared de H. pylori sobre la inducción de HIF-1α, se obtuvo que ninguno de ellos fue capaz de promover este efecto, sólo el contacto directo entre el patógeno vivo y el hospedero fue necesario para promover un aumento de los niveles de la proteína. En resumen, los resultados sugieren que H. pylori promueve un aumento de HIF-1α a través de la activación de PI3K y mTOR, y que esta inducción permite el arresto de células gástricas en la fase G0/G1 del ciclo celular. Además, HIF-1α tendría una participación menor en la expresión de su gen blanco GLUT-1. Finalmente, los datos sugieren que el factor de virulencia posiblemente implicado en este fenómeno requiere de la interacción directa entre H. pylori y la célula gástrica para ejercer su función / Helicobacter pylori (H. pylori) is a human gastric pathogen whose presence is linked to gastric carcinogenesis. In gastric epithelial cells, H. pylori infection promotes activation of several signaling pathways associated with both cell cycle progression and cell cycle arrest. On another hand, H. pylori has been linked to the induction of Hipoxia Inducible Factor -1α (HIF-1α), a transcription factor involved in the expression of several genes required for tumor progression. In addition to its canonical functions, in the context of hypoxia, HIF- 1α has been shown to promote cell cycle arrest in G1 phase as a nontranscriptional mode of action. HIF-1α induction in normoxia by activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway has been described, and signaling via this pathway related to cell cycle progression also has been linked to H. pylori infection. However, although H. pylori reportedly promotes HIF-1α induction, currently little data is available concerning the signaling pathway(s) by which H. pylori promotes HIF-1α induction, as well as the consequences of such induction for cell fate. In this study, we sought to determine whether HIF-1α mediates the transition from cell cycle progression to cell cycle arrest observed following H. pylori infection. Thus, we evaluated whether activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway increases HIF-1α levels and whether this leads to cell cycle arrest. To do so, these studies employed as in vitro models the human gastric cancer cell lines MKN45 and AGS as well as the H. pylori 26695 strain. The results indicate that H. pylori induces transient HIF-1α increases and enhances nuclear localization of the transcription factor. Pharmacological inhibiton of the PI3K/Akt/mTOR pathway revealed that the PI3K inhibitor LY294002 and the mTOR inhibitor Rapamycin precluded H. pylori-enhanced HIF-1α induction. HIF-1α silencing prevented H. pylori-induced cell cycle arrest in G0/G1 phase. Consequently, cyclin D1, an important protein for G1-S phase transition, decreased following H. pylori infection, and this decrease was less dramatic in HIF-1α knockdown gastric cells. With respect to HIF-1α transcriptional activity, we observed that HIF-1α silencing precluded increases in GLUT-1 mRNA promoted by H. pylori at early stages of infection only. Furthermore, bioinformatic analysis revealed that H. pylori infection was not associated with an increase in the expression of classical HIF-1α target genes in antral mucosa. Finally, analysis of the contribution of soluble components or components from the bacterial wall to HIF-1α induction, revealed that none of them individually were sufficient to promote the effect. Rather, the direct interaction between live bacteria and gastric cells was neccessary for H. pylori to increase HIF-1α protein levels. In summary, the results obtained in this thesis suggest that H. pylori increases of HIF-1α protein levels in normoxia through PI3K and mTOR activation, and that this induction promotes cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Furthermore, HIF-1α appears to participate to some extent in modulating the expression of the target gene GLUT-1. Finally, the putative virulence factor involved in these events requires the direct interaction between bacteria and the host cell to exert its effect / Conicyt; Fondecyt; Fondap

En els darrers anys s´ha consolidat l´enfoc translacional en l´abordatge del càncer. Aquest es basa en la voluntat de comprendre la biologia tumoral i implementar clínicament aquest coneixement dissenyant nous fàrmacs capaços d´inhibir específicament molècules oncogèniques.En aquest context, s´han descobert els receptors tirosina-quinasa (RTK) com a proto-oncogens crucials en la diferenciació i proliferació cel·lular i com a molècules amb un gran paper en carcinogènesi. KIT i PDGFR són dos exemples paradigmàtics de RTK pels que s´han desenvolupat fàrmacs inhibidors, amb gran èxit terapèutic en aquells tumors, com el GIST, on aquestes proteïnes tenen un paper patogenètic crucial.L´enfoc translacional ha tingut un gran impacte en el camp dels tumors renals que representen un 3% dels tumors de l´economia i dels quals s´en reconeixen diferents subtipus. Els avenços en biologia molecular han permès definir la patogènia d´algunes entitats, sobretot del Carcinoma renal de cèl·lula clara (CRCC), un dels subtipus tumorals freqüents i més agressiu per l´alt nombre de pacients que desenvolupen malaltia metastàtica (30-50%) i pels quals s´estan buscant noves eines terapèutiques.Pel valor oncogènic i com a dianes terapèutiques del KIT i PGFR, aquest treball té com a objectiu estudiar l´expressió d´aquestes proteïnes per immunohistoquímica sobre teixit de tumors de cèl·lules renals. A més a més, en base a aquests resultats i la literatura es pretén discutir el seu valor com a dianes terapèutiques.En el nostre estudi es va demostrar expressió de KIT de forma específica en Carcinoma renal Cromòfob (ChRCC) i Oncocitoma (OR). També es va trobar sobreexpressió de KIT i PDGFRα en la diferenciació sarcomatoide de carcinomes renals (SRCC) sense que aquesta s´associès amb mutacions en els exons 9, 11, 13, 17 del KIT ni en els exons 11, 12, 17, 18 de PDGFRα; que són els més freqüent mutats en el GIST .Alhora vam observar expressió inespecífica en cèl·lules tumorals de PDGFRα i PDGFRβ en un baix nombre de casos i de forma dèbil en diferents subtipus de tumors renals. Per contra, vam evidenciar sobreexpressió de PDGFRβ vascular de forma característica en un alt percentatge de CRCC. En base als nostres resultats, proposem la utilitat de KIT com a marcador en el diagnòstic diferencial de diferents subtipus tumorals. Alhora, hem demostrat que l´expressió de KIT i PDGFRα en els SRCC no segueix el mateix model patogenètic que el GIST. La literatura sosté la necessitat de demostrar la implicació patogènica d´una proteïna en un tumor per plantejar l´efectivitat de la seva inhibició selectiva, essent l´expressió immunohistoquímica per si mateixa insuficient per sostindre aquest principi.Fins al moment, no es coneix si KIT i PDGFR tenen un paper oncogènic en el ChRCC, OR i en SRCC.Per tant, no hi ha suficients dades per proposar l´us d´inhibidors proteics contra aquestes proteïnes en ChRCC i SRCC disseminats.Per altra banda l´expressió vascular de PDGFRβ en CRCC si que té una base patogenètica ja que el seu lligand (PDGF) s´ha implicat directament en la seva biologia. Alhora aquesta expressió vascular és coherent amb els estudis que relacionen la isoforma beta del PDGFR amb la maduració dels pericits i en la promoció de l´angiogènesi.Per tant, els nostres resultats sostenen la relació del PDGFRβ en la patogènia del Carcinoma renal de cèl·lula clara i el valor terapèutic dels fàrmacs contra aquest receptor amb finalitat antiangiogènica.En conclusió, en el context de l´enfoc translacional del càncer i la necessitat d´implementació de nous fàrmacs inhibidors proteics pel tractament del carcinoma renal metastàtic, l´anàlisi d´expressió de RTK en tumors renals permet juntament amb la integració d´altres estudis, la discussió del valor diagnòstic i sobretot terapèutic d´aquestes dianes moleculars. / Renal Cell Neoplasms (RCN) represent 3% of cancer incidence and comprise different clinicopathologic entities. Malignant subtypes, specially the most frequent one Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CRCC), remain the most lethal of urologic cancers due to the high rate of patients (30-50%) developing metastatic disease for whom new therapies are needed.Great advances in molecular biology have led to the identification of tyrosine-kinase receptors (TKR) as relevant proteins in tumorigenesis. Moreover the advent of selective inhibitors against them has raised interest on its expression in different tumors.PDGFR and KIT are two examples of TKR that have an oncogenic role in numerous neoplasms and can be inhibited pharmacologically. Because of its potential role as proto-oncogens and therapeutic targets; We aimed to study its immunohistochemical expression in RCN and to discuss its possible role as molecular targets.Our results highlight specific expression of KIT in Chromophobe renal cell carcinoma (ChRCC) and Renal Oncocytoma (RO). Overexpression of KIT and PDGFRα was found in sarcomatoid differentiation of renal tumours (SRCC) without mutations in KIT exons 9,11,13,17 nor PDGFR exons 11,12,17,18 which are the most commonly mutated in GIST.Moreover inespecific and low expression of PDGFRα and PDGFRβ was evidenced in tumoral cells in different RCN. In contrast, vascular expression of PDGFRβ was seen caracteristically in half of CRCC cases.According to our results, we propose KIT as a useful marker for differential diagnosis among RCN.Moreover we demonstrate that expression of KIT and PDGFR in SRCC doesn´t follow the same pathogenetic mecanism as GIST.Scientific community claims that immunohistochemical expression of a protein in a tumor is not enough to propose it as a therapeutic target and that demonstation of its pathogenetic role is needed. So as, there is still no evidence of participation of KIT-PDGFR in ChRCC, OR nor SRCC oncogenesis, there is not enough data to propose them as therapeutic targets.Conversely, in different studies PDGFRβ has been involved in CRCC pathogenesis and has been related to tumor angiogenesis by perycite recruitment. So that, vascular expression of PDGFRβ in CRCC favours its consideration as a therapeutic target in this tumor subtype.