Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-24T23:37:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 278034.pdf: 787631 bytes, checksum: 4e1a362ea442a16afcf597e48553d44d (MD5) / O objetivo do presente estudo foi investigar os possíveis mecanismos e mediadores envolvidos na hipernocicepção mecânica muscular induzida pela administração intramuscular (i.m.) de IL-6, no músculo gastrocnêmio de camundongos. Foi demonstrado que a injeção i.m. de IL-6 (3, 6 ou 10 ng/sítio) reduziu significativamente o limiar da resposta mecânica de maneira dose e tempo (1 - 6 h) dependentes em camundongos. Este efeito foi associado com aumento do recrutamento de células inflamatórias, como avaliado através da coloração H&E, além das atividades das enzimas MPO e NAG, e também com o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF-?, IL-1? e KC). Além disso, camundongos nocaute para TNFR1-/-, ou ainda os animais pré-tratados com o antagonista seletivo CXCR2, SB225002, ou com os anticorpos anti-macrófago, anti-TNF-? ou anti-KC, e ainda com o antagonista para o receptor para IL-1 (IL-1ra) demonstraram redução significativa da hipernocicepção mecânica induzida pela IL-6. Ademais, o tratamento sistêmico com inibidores de mediadores inflamatórios, como indometacina, celecoxibe, SC560, ou guanetidina, também reduziram a resposta nociceptiva causada pela administração i.m. de IL-6. A participação de diferentes vias de sinalização intracelular também foi observada, uma vez que o pré-tratamento local com inibidores de fosfolipase A2 (PACOCF3), fosfolipase C (U73122), proteína quinase C (GF109203X), proteína quinase A (KT-5720), ou com fosfatidilinositol 3-quinase (AS605204), reduziram significativamente a hipernocicepção muscular induzida pela IL-6. Similarmente, o tratamento i.m. dos inibidores seletivos de p38 (SB203580), ERK (PD98059) ou JNK (SP60015) também inibiram a hipersensibilidade mecânica induzda pela IL-6. Ainda, ERK, JNK e p38 encontraram-se fosforiladas 5 minutos após a administração i.m. de IL-6. Estes resultados forneceram novas evidências que indicam papel relevante da IL-6 no desenvolvimento e na manutenção da hipernocicepção muscular em camundongos. Ainda, a hipersensibilidade mecânica muscular induzida pela parece promover ativação de células residentes, infiltração de células polimorfonucleares, produção de citocinas, prostanóides e liberação de aminas simpaticomiméticas e ativação de vias intracelulares, especialmente MAPKs.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-22T17:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 227250.pdf: 572606 bytes, checksum: 037342679a93e64a70e5cb772463a0d3 (MD5) / A agmatina é uma amina endógena presente no cérebro que apresenta um efeito antidepressivo. Neste trabalho demonstrou-se que o tratamento crônico com agmatina (1 e 3 mg/kg, i.p.) aumentou a expressão de Bcl2 (no cerebelo) e calbindina-28K (no hipocampo e cerebelo), mas não afetou a expressão de BDNF. A redução do tempo de imobilidade causada pela administração aguda de agmatina (10 mg/kg, i.p.) no teste do nado forçado (TNF) em camundongos foi prevenido pelo pré-tratamento (i.c.v.) com PD98059 (inibidor da MAPK/ERK), KN-62 (inibidor da CaMKII) e queleritrina (inibidor da PKC), mas não pelo H-89 (inibidor da PKA). O efeito antidepressivo da fluoxetina (32 mg/kg, i.p.) no TNF foi revertido pelo H-89, PD98059 e queleritrina, mas não pelo KN-62. O teste do campo aberto mostrou que os efeitos não foram devido a alterações na atividade locomotora. Agmatina (100, 300 e 1000 mM) induziu a liberação de glutamato em sinaptossomas corticais de camundongos, de modo dependente da concentração e do tempo. H89, PD98059 e KN-62, mas não queleritrina, estauroporina e LY204002 bloquearam a liberação de glutamato provocada por agmatina (1000 mM).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:40:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290296.pdf: 2092290 bytes, checksum: 0d72e1b88bfccac79bd8102a0d2f0d6c (MD5) / O envolvimento das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) em lesões do sistema nervoso central já foi demonstrado em alguns estudos. Porém, a implicação da ativação dessas proteínas na medula espinhal após a lesão medular traumática necessita de maior esclarecimento. O presente estudo investigou a participação das MAPKs ERK1/2, p38 e JNK no dano espinhal e funcional induzido pela lesão medular traumática em ratos. A compressão da medula espinhal, através da inserção de um cateter de embolectomia no espaço epidural, resultou em uma lesão espinhal caracterizada histologicamente por resposta inflamatória pronunciada, com edema, infiltração de neutrófilos, produção de mediadores inflamatórios e apoptose, associada com comprometimento locomotor significativo. A lesão medular não alterou a expressão protéica total de quaisquer das MAPKs na medula espinhal. Contudo, os níveis de expressão das isoformas fosforiladas de cada MAPK em amostras espinhais de animais lesados apresentaram-se elevadas, em relação às de amostras de animais falso-operados, nos seguintes momentos após indução da lesão: p38 fosforilada em 2 e 6 h, ERK1/2 fosforilada em 2, 6 e 24 h, e JNK fosforilada apresentou uma elevação significativa em 6 e 24 h. Amostras espinhais de animais lesados apresentaram ainda aumento nos níveis das citocinas IL-1ß em 2, 6 e 24 h após a lesão e de TNF-a em 2 h, atividade aumentada da enzima mieloperoxidase (uma medida indireta da infiltração de neutrófilos) em 6, 24 e 72 h, e do número de células apoptóticas em 24 e 72 h após a lesão. A administração intratecal do inibidor seletivo da proteína JNK, o SP600125 (2 injeções de 150 nmol, 1 e 4 h após a lesão medular), reduziu a expressão da proteína JNK fosforilada (mas não de p-38 ou ERK1/2 fosforiladas) e bloqueou a apoptose em 6 h, sem alterar os níveis espinhais de mieloperoxidase. O tratamento com SP600125 acentuou marcadamente a recuperação da atividade locomotora dos animais no transcorrer das primeiras 4 semanas após a lesão, e atenuou os danos histológicos espinhais. Este estudo demonstra o importante envolvimento das MAPKs na lesão medular e aponta a proteína JNK como um importante alvo terapêutico no tratamento da lesão medular traumática, uma vez que um inibidor seletivo desta proteína foi capaz de inibir a apoptose espinhal e potencializar a recuperação da função locomotora. / Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) have been extensively implicated in injuries of the CNS, however the roles played by spinal cord MAPK activation following spinal cord injury (SCI) still remain elusive. Considering that the therapies currently available for treatment of this condition have limited efficacy, the use of animal models of SCI is still mandatory for development of new more effective approaches. The current study investigates the changes in expression of the three main MAPKs, namely ERK1/2, p38 and JNK following traumatic SCI, as well as the role played by spinal JNK in motor impairment following lesion. SCI induced by inflation of a balloon catheter placed in the epidural space at T9-T10, was associated with a marked spinal inflammatory response, histological changes and a pronounced locomotor impairment which subsided only partially over the first 4 weeks. Spinal expression levels of total p38, ERK1/2 and JNK proteins were unchanged after SCI, but levels of the phosphorylated (phospho) forms of each of the MAPKs were enhanced as follows: phospho-p38 MAPK at 2 and 6 h after SCI, phospho-ERK1/2 at 2, 6 and 24 h after SCI, and phospho-JNK at 6 and 24 h after SCI. SCI also increased IL-1â at 2, 6 and 24 h, TNF-á at 2 h, spinal cord MPO levels at 6, 24 and 72 h and elevated the number of spinal apoptotic cells in the spinal cord at 24 and specially 72 h after the lesion. Notably, intrathecal administration of a specific inhibitor of JNK phosphorylation, SP600125 (2 injections of 150 nmol, given at 1 and 4 h after SCI surgery), reduced the expression of phospho-JNK (but not of phospho-p38 or phospho-ERK1/2) and the number of spinal apoptotic cells at 6 h after SCI, as well as many of the histological signs of spinal injury, but spinal MPO levels were unchanged. Most importantly, restoration of locomotor performance throughout the first 4 weeks following SCI was clearly ameliorated by this same treatment schedule with SP600125. Altogether, the results demonstrate that SCI induces the activation of spinal MAPKs and that, among these, spinal JNK plays a major role in mediating the deleterious consequences of spinal injury, not only at the spinal level, but also those regarding motor function. Moreover, they suggest that inhibition of JNK activation in the spinal cord might hold therapeutic potential for the functional recovery from SCI.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-03-11T16:27:36Z No. of bitstreams: 1 Tese_LuizaFAndrade_CorreçaoPosDefesa.pdf: 6344948 bytes, checksum: 1de902ddabaee335003b09146eee2734 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-11T16:27:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_LuizaFAndrade_CorreçaoPosDefesa.pdf: 6344948 bytes, checksum: 1de902ddabaee335003b09146eee2734 (MD5) Previous issue date: 2012 / Apesar do praziquantel ser uma droga eficiente para o tratamento da esquistossomose, a prevalência da doença não mostrou redução significativa nos últimos anos e, até o momento, não existe uma alternativa eficaz para o tratamento dessa doença. Dessa forma, optamos por utilizar as poderosas ferramentas genômicas para identificar potenciais alvos para o desenvolvimento de um medicamento alternativo. Já que proteínas quinase eucarióticas (ePKs) são consideradas alvos para o desenvolvimento de drogas do ponto de vista médico e químico, e um número crescente de inibidores ePKs foram desenvolvidos e aprovados para o tratamento de diferentes doenças humanas, estas se tornaram o foco de estudo desse trabalho. As ePKs de S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium foram identificadas nos proteomas preditos e classificadas em seus devidos grupos, famílias e subfamílias a partir de abordagens filogenéticas. Utilizando as informações dos ortólogos identificados, foi possível selecionar um grupo de ePKs com função predita essencial nesse parasito. A anotação funcional mostrou ainda que grande parte das ePKs selecionadas são ativadoras/efetoras da via de sinalização MAPK. Dessa forma, proteínas chave da via MAPK (SmRas, SmERK1, SmERK2, SmJNK e SmCaMK2), foram as escolhidas para validação experimental. Após redução significativa no nível de transcrito dos genes selecionados, nenhuma alteração fenotípica visível foi relatada em cultura de esquistossomulos. Contudo, o efeito da diminuição transcricional dos genes no desenvolvimento dos vermes diante do sistema imune do hospedeiro foi avaliado. Evidenciamos que proteínas MAPK JNK quando silenciada causa efeitos devastadores no tegumento de vermes adultos de S. mansoni que leva a morte dos mesmos. E, ePKs da subfamília ERK1 estão relacionadas com a produção de ovos, já que fêmeas com baixos níveis de transcritos SmERK1 e SmERK2 apresentam ovários pouco desenvolvidos e produção de ovos significativamente baixa. Além disso, foi comprovado que o fator de transcrição c-fos está diferencialmente expresso em parasitos silenciados para as proteínas MAPK SmJNK, SmCaMK2 e SmERK1/2. Dessa forma concluímos que o dado genômico, acoplado a ferramentas computacionais preditoras e abordagem experimental, compõem uma metodologia poderosa para o estudo dessa espécie. As proteínas MAPK, SmERK e SmJNK, são alvos de interesse para o desenvolvimento de drogas para tratamento da esquistossomose já que um inibidor contra essas proteínas provavelmente irá interromper o ciclo de vida de Schistosoma e impedir o progresso da doença. / Although praziquantel is an efficacious drug for schistosomiasis treatment, in recent years problems of resistance have arisen and alternatives don’t exist so far. To contribute to a solution, the important information of the recently sequenced genomes of these parasites was used to identify potential targets for the development of an alternative drug. Since eukaryotic protein kinases (ePKs) are good chemical and medical targets for drug development and an increasing number of ePK inhibitors have been approved for the treatment of different human disease, they have become the focus of this study. The ePKs were identified in the predicted proteomes of S. mansoni, S. japonicum and S. haematobium by Hidden Markov Model searches, the genes were classified in their group, family and subfamily by phylogeny approaches, and some ePKs were selected since they has essential function in the parasite. The functional annotation showed that the most selected ePKs are activators/effectors of MAPK signaling pathway, and key proteins of this pathway (SmRas, SmERK1, SmERK2, SmJNK, and SmCaMK2), were chosen for experimental validation. Gene silencing by RNA interference was used to elucidate the functional role of MAPK signaling pathways proteins in S. mansoni. After a significant reduction in the transcription level of the selected genes, no visible phenotypic changes were reported in schistosomula in culture. Therefore, mice were infected with the silenced schistosomulas and the development of adult worms was observed. It was showed that SmJNK has an important role in transformation and survival of the parasites as low number of adult worms was recovered and the tegument of survived worms was damaged. Moreover, SmERK1/SmERK2 was related to egg production, as mice infected with silenced schistosomulas, displayed significantly lower egg production and the recovered female worms had underdeveloped ovaries. Furthermore, it was showed that the c-fos transcription factor was overexpressed in parasites with low expression of SmERK1, SmJNK and SmCaMK2. We conclude that the genome contains valuable information and the functional annotation performed had an important role to improve the annotation of S. mansoni, S. haematobium and S. japonicum ePKs. Furthermore, MAPKs proteins, SmERK and SmJNK, are excellent targets for drug development as an inhibitor against these proteins will probably disrupt the life cycle of Schistosoma and prevent disease progression.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:00:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339552.pdf: 1776510 bytes, checksum: da1705c78b546bdd9cc227ab480ba339 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) é um parasito hemoflagelado que compartilha reservatórios e vetores com o Trypanosoma cruzi, sendo capaz de infectar mamíferos silvestres e domésticos, assim como o ser humano. Dentre as proteínas envolvidas na regulação do metabolismo energético do T. rangeli, avaliamos neste trabalho a expressão e a atividade enzimática da arginina quinase (AK), enzima que possui atividade de fosfotransferase e cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ADP, assim como arginina e ATP, sendo essencial para diferentes processos celulares em tripanosomatídeos, como por exemplo, infecção, multiplicação celular e diferenciação celular. O crescimento dos parasitos em meio LIT foi acompanhado durante nove dias, sendo observada uma menor expressão da AK somente no dia 1, aumentando no dia 2 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK aumentou progressivamente até o 5º dia de cultivo, decaindo gradativamente nos dias subsequentes. Durante a diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas realizada ao longo de oito dias em meio DMEM, a maior expressão da AK foi detectada nas formas epimastigotas (dia 0) e a maior atividade enzimática nas formas de transição (dia 4). Durante a diferenciação de tripomastigotas em epimastigotas foi observada uma menor expressão da AK somente nos dias 3 e 4, sendo aumentada no dia 5 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK se manteve constante nos tripomastigotas recém isolados e no primeiro dia de cultivo, aumentando no segundo dia e se mantendo constante até o sexto dia, quando teve um aumento da atividade, que novamente se manteve constante até o nono dia e então decaindo nos últimos dias. Embora estudo prévio tenha demonstrado uma localização flagelar da TrAK a maior parte da atividade da AK foi encontrada na fração citosólica após purificação do citoesqueleto e flagelo. Na comparação entre diferentes espécies e cepas de tripanosomatídeos, a cepa SC 58 de T. rangeli apresentou uma atividade quase duas vezes maior do que a cepa Choachí. A atividade nas cepas de T. cruzi foi praticamente constante quando comparadas entre si e também com a cepa Choachí. Através destes resultados é possível inferir que a atividade da AK parece estar relacionada à multiplicação celular e a adaptação à condições metabólicas adversas (ex. diferenciação celular), sendo influenciada pela demanda energética do parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as humans, sharing reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi. In this work we evaluate the expression and the enzymatic activity of the T. rangeli arginine kinase (AK), an enzyme with phosphotransferase activity that catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP¸ as the arginine and ATP. AK is essential in trypanosomatids for diferent cellular processes, like infection, cellular multiplication and cellular diferentiation. The AK expression was monitored during the T. rangeli epimastigotes growth in LIT medium for nine days, revealing an increasing expression of AK during the first couple of days and then stabilizing. The enzymatic AK activity have increased up to the fifth day of in vitro culture and then gradually decreased during the subsequent days. During the cellular differentiation in vitro, higher AK expression levels were observed for the epimastigote forms (day 0) but the higher enzymatic activity was detected for the transition forms (day 4). During the in vitro differentiation of bloodstream forms to replicative forms the AK expression have increased up to the fifth day and remained stable up to the ninth day. During this process the AK enzymatic activity revealed a slight increase up to the second day and the stabilised up to the sixth day when a second peak of activity was observed followed by decay up to the ninth day. Although previous studies have demonstrated a flagellar localization for the TrAK, higher AK activity was found on the cytosolic fraction. The AK activity revealed to be distinct among T. rangeli strains, being two times higher for the SC58 strain when compared to the Choachí strain, which revealed similar AK activity as observed for T. cruzi. We conclude that AK activity might be related to the T. rangeli cellular multiplication, differentiation and metabolic adaptation to adverse conditions, being influenced by the parasite?s energetic demands.

Nek1 é uma serina/treonina quinase humana envolvida na ciliogênese, na resposta a danos ao DNA e na regulação do ciclo celular. Devido ao possível envolvimento dessa proteína em patologias como a Doença Policística do Rim (PKD), a Síndrome de Costelas Curtas e Polidáctilia tipo Majewski e no desenvolvimento de tumores, muitos estudos tem sido feitos buscando entender a via de atuação dessa quinase nas células. Em vista disso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da Nek1 em resposta a danos ao DNA, principalmente gerados por agentes indutores de Crosslinks (ICLs), como cisplatina, buscando localizar a Nek1 nas vias de sinalização conhecidas e identificar proteínas que interagem com essa quinase. Para isto, foi utilizado um modelo de silenciamento estável de Nek1 por shRNAi na linhagem celular humana Hek293t. Essas células, quando comparadas à linhagem selvagem expressando a proteína, apresentaram um reparo deficiente de lesões induzidas por cisplatina e ausência de quebras de dupla fita através do ensaio cometa, confirmado pelos baixos níveis de fosforilação da histona H2AX. Entretanto, análises com outro agente indutor de ICLs, Nimustina (ACNU), demonstrou que a Nek1 parece atuar nos mecanismos envolvidos no reparo de lesões induzidas por cisplatina. Isso sugere que essa proteína possa estar agindo no reconhecimento da lesão do DNA e até mesmo regulando vias checagem de ciclo celular, uma vez que a linhagem silenciada apresentou modificações no ciclo celular e na sinalização de Chk1 e Chk2, após a exposição com cisplatina. Além disso, essas células também apresentaram alterações na sinalização das proteínas envolvidas no reparo de ICLs, BRCA1 e FANCD2. O estudo de interação proteica por espectrometria de massas destacou algumas proteínas de reparo, como proteínas da via de Fanconi, e principalmente moléculas relacionadas com o processo de ubiquitinação, sugerindo que este pode ser o mecanismo pelo qual essa molécula está atuando e integrando diferentes sistemas. Esse conjunto de dados indica o papel da Nek1 como uma proteína sensora de danos que atua no início das vias de reparo, regulando diferentes moléculas e interagindo em distintos processos celulares como controle do ciclo celular, reparo e morte. / Nek1 is a human serine/threonine protein kinase involved in ciliogenesis, DNA damage response and cell cycle regulation. Because of its possible involvement in human diseases such as Polycystic Kidney Disease (PKD), Short-Rib Polydactyly Syndrome Type Majewski and development of tumors, many studies have been done to understand how this kinase acts in cells. Therefore, the objective of this study was to evaluate a role for Nek1 in response to DNA damage, mainly generated by agents that induce crosslinks (ICLs), such as cisplatin, identifying pathways in which participate and how proteins interact with this kinase. To accomplish that, a stable silencing of Nek1 by shRNAi in human cell line Hek293t was employed. These cells, when compared to the wild type, showed a deficient repair of lesions induced by cisplatin and absence of double strand breaks, when analysed by comet assay and, confirmed by low levels of histone H2AX phosphorylation. However, analysis with another inducing ICLs agent, Nimustine (ACNU) demonstrated that Nek1 seems to act on mechanisms involved in repair of lesions induced by cisplatin. It suggesting that this protein might be acting on the recognition of DNA damage and even regulating checkpoint pathways, since the silenced strain showed changes in cell cycle and in signaling of Chk1 and Chk2 after exposure to cisplatin. Moreover, these cells also showed changes in signaling of proteins involved in the repair of ICLs FANCD2 and BRCA1. The study of protein interaction by mass spectrometry highlighted some repair proteins, like Fanconi pathway proteins, and protein involved in the ubiquitin-related process, suggesting a possible mechanism of action and integration with different systems. This dataset indicates the role of Nek1 as a DNA damage sensor protein that acts at the beginning of the repair pathways regulating and interacting with distinct molecules in different cellular processes such as cell cycle control, repair and death.

Yeast cells are exposed to a wide variety of environment stresses, among them changes in the osmotic conditions. An osmolar upshift leads to fast loose of intracellular water, so living cells have developed mechanisms to counteract this lost. In Saccharomyces cerevisiae changes in the osmotic conditions are sensed by the HOG pathway. The HOG pathway is a MAPK signalling pathway and the functional homolog of the stress activated MAPK JNK MAPK and p38 present in mammals. Because there is a high degree of conservation of these cascades, the HOG pathway is a good model to study osmotic adaptation processes.Recent reports have shown that the Hog1 MAPK can regulate several processes such as cell cycle control, metabolic adaptation or regulation of gene expression.At the beginning of this work, the mechanisms by which the Hog1 MAPK was controlling gene expression were unclear because transcription factors under the control of the MAPK were not well characterized. Our goal was the identification of new transcription factors under the control of the MAPK. Therefore, we designed a genetic screen and selected clones from a multicopy genomic library that were able to induce the expression of Hog1 dependent genes in non stress conditions. One of these clones was the SMP1 gene. Smp1 encodes for a MEF2-like transcription factor. Its overexpression induced the expression of osmoresponsive genes such as STL1, whereas smp1 cells were defective in their expression. smp1 cells showed reduced viability upon osmotic shock. Smp1-Hog1 interaction was checked by coprecipitation. Moreover, Smp1 was phosphorylated upon osmotic stress in a Hog1-dependent manner and in vitro phosphorylation experiments showed that Hog1 phosphorylated Smp1 at the C-terminal region. This phosphorylation was important for Smp1 osmoadaptation functions.Moreover Hog1 was implicated in cell adaptability to stationary phase through Smp1.On the other hand, microarrays studies showed that HXT1 hexose transporter was upregulated upon an osmotic shock in a Hog1 dependent manner. Expression of the HXT1 gene, which encodes a low affinity glucose transporter in Saccharomyces cerevisiae, is induced in response to glucose by the general glucose induction pathway, involving the Snf3/Rgt2 membrane glucose sensors, the SCF-Grr1 ubiquitination complex and the Rgt1 transcription factor. In addition to the glucose signalling pathway, we have found that, regulation of HXT1 expression also requires the HOG pathway. Deletion of components on both pathways results in impaired HXT1 expression. Genetic analyses identified Sko1 as the transcription factor under the control of Hog1 that was modulating HXT1 expression.Our studies here have shown that both Smp1 and Sko1 are transcription factors under the control of the MAPK.

A pré-eclâmpsia (PE) é causa importante de mortalidade fetal e materna. Existem evidências que a resistência à insulina esteja implicada em sua fisiopatologia. A via Akt/PKB (Akt/ Proteína quinase B) é estimulada pela insulina e exerce várias funções vitais como crescimento, sobrevivência e metabolismo celular. O objetivo do trabalho foi comparar a expressão da Akt/PKB em placentas de pacientes normais e com pré-eclâmpsia estimuladas com insulina. Foram utilizadas amostras de placenta de 12 pacientes normais e de 12 pacientes com PE foram coletadas, estimuladas com insulina e analisadas por Western blot para quantificação da expressão da proteína Akt/PKB basal e fosforilada em serina473. Como resultados, a estimulação das amostras com a insulina foi comprovada quando comparamos grupos estimulados (1,14 ± 0,10) e não estimulados (0,91 ± 0,08), P< 0,001. A atividade da via da Akt/PKB fosforilada em serina473 foi semelhante entre placentas de mulheres normais (1,26 ± 0,16) e com PE (1,01 ± 0,11), P = 0,237. Concluímos que não há diferença de fosforilação na via da Akt/PKB, após estimulação com insulina, em placentas de pacientes com PE e normais. Contudo, não podemos descartar alterações desta via de sinalização na PE sem analisarmos os substratos da Akt/PKB quando estimulados. / Preeclampsia (PE) is an important cause of fetal and maternal mortality around the world and there are evidences that insulin resistance has been implicated in the pathophysiology of preeclampsia. Akt/PKB pathway is stimulated by insulin and performs several vital functions as growth, survival and cellular metabolism. Objective: to investigate stimulates expression of Akt/PKB pathway in the placenta, of normal and preeclampsia parturient. Method: samples were collected from 12 normal patients and 12 PE patients, stimulate and analyzed by Western blot to quantify the proteins expression in signaling of Akt/PKB. Results: stimulation of insulin samples was confirmed when comparing stimulated groups (1.14 ± 0.10) and non-stimulated (0.91 ± 0.08), P <0.001. The Akt/PKB phosphor (Ser473) was not different in placenta of the normal (1.26 ± 0.16) and PE (1.01 ± 0.11) groups, with P = 0.237. Conclusions: there was no difference of phosphorylation in Akt/PKB pathway, after stimulation with insulin, in placentas of normal and PE patients. However, we cannot discard effects in this signaling pathway as pathophysiology of PE, because it is still necessary to analyze the substrates stimulation of this pathway.