Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée qui jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire anti-tumorale. Le concept d’immunothérapie basée sur l’activation des cellules NK a ainsi émergé comme une approche thérapeutique convaincante. Malgré les avancées spectaculaires réalisées ces dernières décennies, les connaissances concernant la biologie des cellules NK restent largement fragmentées. La mise en place de stratégies thérapeutiques anti-tumorales utilisant les cellules NK nécessite donc une compréhension approfondie des mécanismes de résistance développés au sein du microenvironnement tumoral. Les travaux menés au laboratoire ont révélé que certains mécanismes de résistance intrinsèque développés par les cellules tumorales dépendent de l’activation de l’autophagie en réponse à un stress hypoxique. Ces travaux ont démontré que l’activation de l’autophagie en condition de stress hypoxique, diminue la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les cellules NK, qui peut être restaurée par l’inhibition de Beclin1. Ces mêmes travaux ont également démontré in vivo que l’inhibition de Beclin1 diminue la progression tumorale dans des modèles syngéniques murins de cancer de sein et de mélanome.Dans cette étude, nous avons montré dans un modèle murin de mélanome, que la régression des tumeurs déficientes en Beclin1 était corrélée à une augmentation significative d'infiltration des cellules NK. Nous avons établi que cette infiltration accrue est due à une augmentation d'expression et de sécrétion de la chémokine CCL5. De plus, dans les tumeurs déficientes en Beclin1, ayant une forte expression de CCL5, l’inhibition de CCL5 était suffisante pour diminuer l'infiltration des cellules NK et bloquer la régression tumorale.Ayant établi le rôle majeur de CCL5 dans l'infiltration des cellules NK dans les tumeurs de mélanome déficientes en Beclin1, nous avons étudié, dans la deuxième partie, le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) impliqué(s) dans la régulation de CCL5. Nous avons démontré que l’inhibition génétique ou pharmacologique de l’autophagie induit la voie SAPK/JNK dans les cellules tumorales et active par conséquence le cofacteur de transcription c-Jun impliqué dans l'expression de CCL5. Plus précisément, nous avons établi que l'induction de SAPK/JNK est due à un défaut de l'activité phosphatase de la protéine phosphatase 2A (PP2A).Dans la dernière partie, nous avons étudié l'impact clinique de l’expression de CCL5 dans le cas du mélanome. L’analyse de différentes biopsies de mélanomes a montré une corrélation positive et significative de CCL5 avec l’expression du marqueur des cellules NK NKp46. Ce résultat a été validé sur une large collection de mélanomes, disponible dans la base de données TCGA (The Cancer Genome Atlas). La survie à long terme de patients atteints de mélanome ayant une expression élevée de CCL5 est significativement améliorée par rapport à ceux ayant une faible expression de cette chémokine.L'ensemble de nos résultats démontre pour la première fois que la diminution de la croissance tumorale suite l’inhibition de l'autophagie est étroitement liée à une amélioration de l'infiltration des cellules NK dans les tumeurs. Cette infiltration résulte d'une augmentation de l'expression la chémokine CCL5 par les cellules tumorales déficientes en Beclin1. Cette étude souligne l’intérêt de cibler l'autophagie afin d’établir un microenvironnement tumorale favorable à l'infiltration des cellules NK. Ainsi, l'inhibition sélective de l'autophagie dans les cellules tumorales pourrait améliorer les stratégies thérapeutiques anti-tumorales basées sur les cellules NK. / One of the major obstacles to define an efficient cancer immunotherapy protocol is the capacity of hypoxic tumor microenvironment to inhibit the host immune response. In line with this concept, we have shown that hypoxia impairs natural killer (NK) cell-mediated killing of cancer cells. This impairment was not related to a defect in NK cell function, but was strikingly dependent on the induction of the autophagic degradation process in hypoxic tumor cells. Genetic or pharmacological inhibition of autophagy restored NK-mediated killing of hypoxic tumor cells. . We have validated this concept in vivo by showing that targeting autophagy enhanced the NK-mediated regression of breast and melanoma tumors in mice. This regression was related to an increase in NK cells infiltrating autophagy defective tumor as demonstrated by immunohistochemistry staining of NK cells. The present project aims to investigate how autophagy inhibition increases tumor infiltration by NK cells leading to an improvement of NK-mediated anti-tumor immune response et to identify fectors which may be implicated in the infiltration of NK cells into the tumors.

Une pléthore de processus biologiquement pertinents dépend directement de la sécrétion de biomolécules dans le milieu extracellulaire, aux fonctions régulatrices ou composants structurels. L’analyse de processus biologiques complexes nécessite ainsi la mise au point de nouveaux outils de biodétection. Par conséquent, le but de cette thèse est de fournir des stratégies polyvalentes pour la génération de biocapteurs et de biopuces innovants basés sur la Résonance des Plasmons de Surface (SPR). À l’issue de ces travaux, une méthode de photofonctionnalisation indirecte a été mise au point. Ce procédé a permis de générer des micro-réseaux de protéines dans des conditions entièrement aqueuses, et ainsi de préserver la fonctionnalité des protéines greffées. De plus, nous avons créé et évalué une nouvelle biopuce SPR microstructurée pour le suivi en temps réel des sécrétions cellulaires. Cette biopuce microstructurée présente deux phénomènes optiques différents qui peuvent être utilisés pour la détection cellulaire et le suivi de leurs sécrétions. Enfin, de multiples stratégies de fonctionnalisation ont été évaluées pour la conception d’une biopuce SPR nanostructurée à faisceau de fibres optiques. Parmi ces approches, la génération de monocouches photoréactives auto-assemblées a été la plus adaptée à ce système et est en cours d’optimisation. Une fois réalisée, cette biopuce nanostructurée pourrait ouvrir la voie à la poursuite du développement de systèmes prometteurs de biodétection in vivo. / A plethora of biologically relevant processes depends directly on the effective secretion of biomolecules, from regulatory molecules to structural components. Thus, the analysis of complex biological processes requires the development of novel biosensing tools. Therefore, the aim of this thesis is to provide versatile strategies for the generation of innovative biosensors and biochips based on Surface Plasmon Resonance (SPR). As a result from this research, an indirect photofunctionalization method was developed. This procedure allowed the generation of protein microarrays in fully aqueous conditions while preserving the functionality of the grafted proteins. Furthermore, we created and evaluated a novel microstructured SPR biochip for real-time monitoring of cellular secretions. This microstructured biochip presents two different optical phenomena which could be used for cell detection and the monitoring of their secretions. Finally, multiple functionalization strategies were evaluated for the conception of a nanostructured fiber-bundle SPR biochip. Among the approaches, the generation of photoreactive self-assembled monolayers was the most adapted to this system and currently is being optimized. Once achieved, this nanostructured biochip could pave the way for further development of promising in vivo biosensing systems.

Brucella est une bactérie pathogène intracellulaire responsable d'une maladie, la brucellose. Sa capacité à établir une infection chronique est due aux mécanismes qu'elle déploie pour inhiber la réponse immunitaire. Parmi les cellules infectées, les cellules dendritiques (DC) et les macrophages (MO) jouent un rôle primordial dans l'induction de la réponse immunitaire. Nous avons étudié le rôle d'un récepteur des DC, des lymphocytes T (LT), MO : CD150. Il participe à l'activation des LT et il a été montré que CD150 est capable de reconnaître des protéines de l'enveloppe bactérienne, ce qui conduit à une augmentation de son expression à la membrane des MO. Nous avons découvert que l'expression de CD150 sur les DC dérivées de moelle osseuse (BMDC) augmente en présence d'extraits membranaire de Brucella, sauf quand ces derniers proviennent d'un mutant pour Omp25 (∆omp25). L'infection de BMDC par ∆omp25 active les BMDC en termes d'expression de molécules de co-stimulation, d'ARNm pro-inflammatoires (cytokines) et de translocation de NF-κB dans le noyau. En comparant avec une souche sauvage de Brucella, l'activation par ∆omp25 est plus importante. En absence de CD150 la translocation de NF-κB dans les BMDC infectées par la souche sauvage est aussi importante que celle induite par l'infection par ∆omp25. In vivo CD150 contrôle la réplication de Brucella dans la rate de souris infectées. Nous avons démontré que CD150 est capable de lier Omp25. Nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel Brucella inhibe l'activation des DC : la liaison d'Omp25 à CD150. Ce récepteur joue un double rôle puisqu'il est aussi crucial dans le contrôle de la survie de Brucella in vivo. / Brucella is a pathogenic intracellular bacterium responsible for a disease, brucellosis. The ability of Brucella to establish a chronic infection is linked to the mechanism it uses to inhibit immune response. Among Brucella infected cells, dendritic cells (DC) and macrophages play a crucial role in the induction of an immune response. We studied the role of one receptor present at the DC, T cells, macrophages surface: CD150. This molecule participates at the T cell activation and it was shown recently that CD150 can recognize bacterial membrane proteins which lead to its own upregulation. We discovered that CD150 expression onto bone-marrow derived DC (BMDC) is increased when these cells are treated with Brucella membrane extracts, except when those extracts are coming from a mutant for Omp25(∆omp25), a Brucella membrane protein. BMDC infection with ∆omp25 leads to BMDC activation regarding co-stimulatory molecule expression, cytokines and chemokines secretion, pro-inflammatory mRNA expression and NF-κB translocation within the nucleus. In comparison with infection with the wild type strain, ∆omp25 induces a higher activation of BMDC. In absence of CD150, NF-κB translocation within the nucleus of infected-BMDC is the same between the wild type strain and ∆omp25. In vivo, CD150 controls Brucella replication in the spleen of infected mice, and Omp25 infection seems to trigger a higher inflammation in control mice. We finally demonstrate that CD150 binds Omp25. Here, we identified a new mechanism by which Brucella is able to inhibit DC activation: binding of Omp25 to CD150. This receptor plays a dual role since it is also required for controlling Brucella growth in mice.

La réponse immunitaire innée est induite par des infections microbiennes ou des lésions tissulaires. L’étude de sa régulation est l'un des aspects les plus étudiés actuellement en immunologie, et porte notamment sur divers aspects du contrôle des agents pathogènes, du développement de vaccins et de la thérapie contre les maladies inflammatoires chroniques. L’ADN peut jouer le rôle de ligand endogène et induire une réaction immunitaire forte chez les animaux. Des souris déficientes pour la DNaseII lysosomiale accumulent de l’ADN dans leurs macrophages, notamment celui provenant des noyaux expulsés des érythroblastes lors de leur maturation en érythrocytes. Elles n’arrivent pas à les dégrader. Elles produisent en réponse de grandes quantités d’interférons de type I. Les souris meurent d'anémie au stade embryonnaire. Ce phénomène m’a amenée à poser une question importante: Comment les cellules reconnaissentelles l'ADN et comment y répondentelles? Pour savoir comment les cellules reconnaissent et répondent à l'ADN, nous avons visé trois objectifs spécifiques: I. Mise au point un modèle in vivo de drosophile pour étudier la réponse immunitaire innée contre l'ADN II. Dissection génétique de la réponse immunitaire induite par l'ADN III. Trouver des récepteurs de l’AND A l’issu de mon travail de thèse, je peux proposer que (i) la réponse immunitaire induite par l’ADN repose sur la voie IMD chez la drosophile, (ii) IK2 (TBK1), CG1667 (TMEM173), et EYA (EYA4) sont des molécules clés dans la cascade de signalisation en aval de la détection de l'ADN chez la drosophile, (iii) EYA est liée à la voie IMD au niveau de RELISH ou IKKβ, (iv) Orthologue drosophile LRRFIP1 de l'ADN des mammifères capteur est responsable de la détection de l'ADN dans le modèle DNaseII mouche déficiente (v) chez la drosophile CG3800 (CNBP) est un candidat pour la détection d'AND dans les insectes et les mammifères. / Innate immune responses are initiated during infections and tissue damage, and largely impact on various human diseases. DNA has been shown to be a strong innate immune stimulator in animals. For example, DNaseII deficient mice accumulate undigested DNA in macrophages from the expelled nuclei of erythroid progenitor cells, produce large amounts of type I Interferons in DNA-accumulated cells, and die from anemia at the embryonic stage. This phenomenon brought us an important question: How does cells recognize DNA and respond to it? To answer the question, we took three approaches: (1) Establishing in vivo model to study the innate immune response against DNA (2) Genetic dissection of the DNA-mediated immune response (3) Finding DNA sensors In my thesis project, we provide (1) DNA-mediated immune responses relies on the IMD pathway in Drosophila, (2) IK2(TBK1), CG1667(TMEM173, STING), and EYA(EYA4) are key molecules in the downstream signaling cascade of DNA sensing in Drosophila, (3) EYA is linked to the IMD pathway at the level of RELISH or IKKβ, (4) Drosophila orthologue of mammalian DNA sensor LRRFIP1 is responsible for DNA sensing in DNaseII deficient fly model, (5) Drosophila CG3800(CNBP) is a candidate for DNA sensing in both insects and mammals.

Avec une prévalence mondiale de 0,7%, l’infection in utero à cytomégalovirus (CMV) représente la première cause de handicap neurologique congénital d’origine infectieuse. Les modalités de prise en charge de cette infection restent débattues notamment en raison de l’absence de marqueurs pronostics fiables et d’inconnus sur sa physiopathologie notamment celle de l’atteinte du cerveau fœtal. Le premier objectif de notre travail était de décrire et valider des marqueurs immuno-virologiques prédictifs de la transmission verticale et de séquelles néonatales. Le deuxième objectif était d’étudier les corrélats immuno-virologiques in situ de la sévérité de l’atteinte du cerveau fœtal. Nous avons pu établir à partir du bilan virologique maternel (avidité des IgG et ADN CMV sanguin) un score de risque de transmission verticale du virus en cas de primo-infection maternelle. Nous avons montré que le niveau du réservoir viral fœtal, reflété par la charge virale dans le liquide amniotique et dans le sang fœtal, était un marqueur prédictif des séquelles néonatales. Ainsi, la combinaison de la mesure du réservoir viral fœtal avec l’imagerie fœtale a permis d’établir des scores pronostics avec des valeurs prédictives positives et négatives de 80 à 100% respectivement. Nous avons mis en évidence par immuno-histochimie couplée à une analyse quantitative d’images que la multiplication virale ainsi que la réponse immunitaire innée (cellules NK) et adaptative (CD8+ et plasmocytes) étaient significativement plus élevées dans les cerveaux fœtaux les plus sévèrement atteints. Ce résultat paradoxal nous a incité à quantifier la présence du marqueur PD-1 et celle de son récepteur PD-L1. PD-1 était significativement plus exprimé dans les cerveaux sévèrement atteints. L’analyse par cytométrie de flux montrait que PD-1 était exprimé par 96% des CD8+ mais aussi par plus de 70% des lymphocytes B et des cellules NK. Ces résultats témoignent de l’existence dans les cerveaux fœtaux infectés d’un épuisement immunitaire touchant la réponse adaptative mais aussi innée. Enfin, l’analyse par cytométrie de flux montrait la présence d’une réplication virale dans les différents types de cellules neuronales (cellules souches, neurones, astrocytes). En conclusion, les résultats de notre travail ont permis d’améliorer les algorithmes de prise en charge de l’infection à CMV in utero grâce à la validation de marqueurs prédictifs immuno-virologiques. Par ailleurs, le fait qu’un épuisement immunitaire et une forte multiplication virale soient associés à la sévérité de l’atteinte cérébrale est important pour l’élaboration de stratégies thérapeutiques in utero. / CMV congenital infection has a worldwide incidence estimated at about 0.7% of all life births and represents the major cause of neurological handicap of infectious origin. The management of this infection remains highly debated. Several factors contribute to this and among them are the absence of recognized prognostic markers and gaps in the knowledge of its pathogenicity particularly that of the fetal brain. The first objective of this work was to describe and validate immune and virological predictive markers of vertical transmission and of neonatal sequelae. The second objective was to study in situ immune and virological correlates of the severity of fetal brain infection. We first validated a model of materno-fetal transmission based on maternal virological results (IgG avidity and blood CMV DNA). We then showed that the viral reservoir level, estimated by the viral load in the amniotic fluid and the fetal blood, was a predictive marker of neonatal sequelae. Prognosis models combining quantification of the viral reservoir to fetal imaging allow to reach positive and negative predictive values up to 80% and 100% respectively. We showed using immunohistochemistry and quantitative image analysis that viral multiplication as well as both innate immune responses (NK cells) and adaptive immune responses (CD8+ and plasma cells) were significantly higher in the most severely infected fetal brains. This paradox drove us to quantify PD-1 and its receptor PD-L1, PD-1expression was significantly higher in severely affected fetal brains. Cytometry flow analysis evidenced that PD-1 was expressed in 95% of CD8+ cells but also in at least 70% of NK cells and of B cells. These results demonstrate immune exhaustion of both adaptive and innate responses in fetal infected brains. Finally, viral replication was evidenced in stem cells, neurons and mature astrocytes after separation by flow cytometry of these neuronal cell types. In conclusion, the validation of immune-virological markers obtained within this work has usefully improved the algorithms for the clinical management of in utero CMV infection. Moreover, the demonstration that immune exhaustion and high viral multiplication are responsible of severe fetal brain affection is important to elaborate in utero treatment strategies.

La radiothérapie implique de limiter l'irradiation des tissus sains. Dans ce but, des nanocapsules lipidiques chargées en complexes lipophile de rhénium-188 (NCL188Re-SSS) ont été utilisées afin de créer une irradiation localisée après injection intra-tumorale. Nous avons ainsi évalué la faisabilité d'une radiothérapie interne après injection intra-hépatique de NCL188Re-SSS pour le traitement du carcinome hépatocellulaire (CHC) et, dans un deuxième temps, étudié l'efficacité d'un fractionnement de la dose radioactive après injections intra-crâniennes répétées pour le traitement des gliomes. La première partie de ce travail décrit l'intérêt d'une radiothérapie interne via les NCL188Re-SSS pour le traitement du CHC avec une augmentation de la médiane de survie jusqu'à 107% dans un modèle CHC chimio-induit chez le rat. Dans une seconde partie, nous avons pu démontrer un bénéfice majeur, sur un modèle de gliome, avec 83% des animaux long-survivants. Cette efficacité thérapeutique pourrait s'expliquer par la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative avec recrutement local de cellules immunitaires effectrices (CD4+, CD8+...). En revanche, les essais d'une radiothérapie interne nanovectorisée sur un modèle de rat peu immunogène et radiorésistant (modèle tumoral F98) ont montré des bénéfices moindres en terme de survie. Pour stimuler la réponse immunitaire anti-tumorale et optimiser l'efficacité thérapeutique, nous avons évalué la combinaison d'une radiothérapie interne nanovectorisée et d'une vaccination par cellules F98 irradiées. Un recrutement des cellules immunitaires effectrices a été observé, cependant, l'efficacité thérapeutique n'a pas été augmentée. Les perspectives qu'offre ce travail sont de deux ordres : évaluer l'impact du processus angiogénique dans le cas du modèle CHC et stimuler le système immunitaire en association avec la radiothérapie interne pour le modèle de gliome.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le risque de LH est augmenté en cas de déficit immunitaire acquis ou inné. Les déficits immunitaires innés associés à un risque accru de LH, sont les DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), XLP (Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X) et ALPS (Syndrome lymphoprolifératif Autoimmun). L'objectif de notre travail était d'évaluer la prévalence de ces déficits immunitaires chez des enfants atteints de LH. Nous avons reçu, 395 prélèvements de patients atteints de LH au diagnostic. L'âge médian de la population étudiée est de 13 ans, allant de 3 à 18 ans. Le sex-ratio M/F est de 1.1. Il augmente à 3 au dessous de l'âge de 10 ans. Parmi les biopsies (n=84) qui ont été relues, 87% sont de type scléro-nodulaires (SN), 7% à cellularité mixte (CM) et 6% non spécifié. L'EBV est détecté in situ dans 23% des cas de LH. Les patients atteints de LH-EBV+ sont significativement plus jeunes que ceux atteints de LH-EBV- (p=3.10-4). Ce sont plus fréquemment des garçons que des filles (63% ; M/F : 1,7) et fréquemment de sous-type CM (40%). Enfin, ils ont une charge virale EBV significativement plus élevée (p=3.10-3) que les enfants qui ont un LH-EBV-.Parmi les 83 premiers enfants analysés, un immunophénotypage approfondi a montré une diminution de la population lymphocytaire par rapport aux témoins et une lymphopénie B fréquente (31 patients sur 83 soit 37% des patients). La lymphopénie B était corrélée aux facteurs pronostiques connus du LH. Dans un cas parmi les 31, une baisse des immunoglobulines a été mise en évidence ce qui est évocateur de DICV. Nous avons montré que dans les autres cas, les lymphopénies se corrigeaient à distance de la maladie. La recherche de profil cytokinique associé à ces lymphopénies (TGF, BAFF, IL-7) n'a pas permis de mettre en évidence de mécanisme physiopathologique simple pour expliquer ces lymphopénies. Nous émettons l'hypothèse qu'elles sont liées à l'exposition au contact des cellules tumorales à des signaux favorisant l'apopotose.En ce qui concerne la recherche d'autres déficits immunitaires innés, aucun cas évocateur de XLP n'a été mis en évidence sur la base de la quantification des lymphocytes NKT. Cinq cas parmi les 83 (6%) avaient une expansion de lymphocytes T DN (Lymphocytes TCRαβ CD4-CD8-) dans le sang périphérique. Des dosages de Fas ligand et d'IL-10 plasmatiques ont permis d'exclure un ALPS. Au total, nous n'avons pas pu affirmer de défaut qualitatif des sous-populations lymphocytaires évoquant les déficits immunitaires de type XLP et ALPS. Seule une lymphopénie B avec baisse des IgG est évocatrice de DICV. Nous avons étendu l'analyse à l'ensemble des patients (395patients) avec un contrôle à distance du diagnostic pour ceux qui étaient anormaux. Nous avons identifié 4 patients potentiellement atteints de DICV, 1,5%. Parallèlement, nous avons recherché un déficit de la réponse T anti-EBV par cytomètrie de flux et l'Elispot. L'étude de la réponse T anti-EBV par la cytométrie de flux, a montré une tendance vers une baisse de la production d'IL-2 par les CD4 et les CD8 de patients avec une charge virale EBV élevée en réponse à une stimulation par des peptides EBV en présence de lignées autologues. L'étude de la réponse T anti EBV par la technique d'ELISPOT sur 9 patients n'a pas montré globalement de déficit du contrôle de l'EBV sauf pour une jeune patiente de 10 ans ayant une charge virale EBV très élevée sans réponse T anti-EBV efficace. Les résultats que nous avons obtenus restent à approfondir, ce qui permettra d'enrichir les connaissances actuelles sur cette pathologie.

P. aeruginosa est un pathogène opportuniste capable d'infecter un large spectre d'hôtes. Elle possède un vaste arsenal de facteurs de virulence. Le système de sécrétion de type III (SSTT) est un facteur de virulence majeur dont la régulation est complexe pour permettre une adaptation la plus précise possible de la bactérie au cours de l'infection. Nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle potentiel de nouveaux acteurs de l'adaptation de P.aeruginosa au cours de l'infection. La porine OprF qui représente la protéine la plus abondante de la membrane externe de P. aeruginosa lui permettrait d'évaluer l'état d'activation du système immunitaire de son hôte afin d'adapter sa virulence. Chez P. aeruginosa, le tryptophane est le précurseur des kynurenines qui sont également produites par l'hôte à partir du tryptophane et qui, dans ce dernier contexte, sont des immunomodulateurs. Peu ou pas d'études ont été réalisées pour mettre en œuvre un éventuel rôle d'immunomodulation ou dans la virulence des kynurénines bactériennes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à un signal anciennement découvert au laboratoire et qui réprime l'expression du SSTT à haute densité bactérienne. Nous avons montré que ce signal exerce une régulation post-transcriptionnelle en plus d'une inhibition de la transcription des gènes du SSTT. Le métabolisme du tryptophane et de l'anthranilate semble être au cœur de ce processus de régulation. En inactivant des voies du catabolisme du tryptophane, nous avons montré que la production de ce signal dépend partiellement de la voie des kynurénines mais ne dépend pas ni des voies classiques du quorum sensing ni de l'opéron phnAB, impliqué dans la synthèse de l'anthranilate. Cependant, la voie des phénazines pourrait être impliquée dans la production de ce signal. Par CLHP couplée à la spectrométrie de masse, nous avons pu séparer des espèces moléculaires réprimant le SSTT et qui sont contenues dans ce signal, mais l'identification précise nécessite plus d'investigations. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux kynurénines produites par la bactérie. Nous avons confirmé que P. aeruginosa produit des kynurénines et le gène kynA est le gène clé de la voie de synthèse de ces métabolites. En utilisant des fusions transcriptionnnelles, nous avons montré que le tryptophane et la kynurénine régulent positivement la production des kynurénines en agissant sur l'expression des gènes clés. D'autres parts, nous avons remarqué que la bactérie module l'activité de la voie métabolique des kynurénines issue du tryptophane en fonction de son état de croissance. Nous avons montré qu'au cours du dialogue interrègne bactérie/hôte, la voie des kynurénines de P. aeruginosa est stimulée par certains composants du système immunitaire. Grâce à un modèle d'infection pulmonaire aiguë, nous avons prouvé que les kynurénines produites par la bactérie sont importantes pour sa virulence. Selon notre hypothèse les kynurénines pourraient avoir une action sur la réponse immune, mais cela reste à déterminer. Dans un troisième temps, nous nous somme focalisés sur la porine OprF. Nous avons montré que la mutation ∆oprF est à l'origine d'une altération de la production mais vraisemblablement pas de la sécrétion des exotoxines du SSTT. Un ligand connu d'OprF, l'interféron gamma, module la voie des kynurénines. OprF pourrait donc avoir un rôle central dans les différents aspects de la régulation de la virulence. Nous avons donc produit des anticorps monoclonaux anti-OprF. Ces derniers se sont révélés capables de reconnaître spécifiquement la protéine OprF. Afin de vérifier l'efficacité de ces anticorps, des expériences de neutralisation de la bactérie in vitro puis in vivo seront réalisées. Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, Système de Sécrétion de Type III, régulation, catabolisme du tryptophane, kynurénines, OprF.

P. aeruginosa est un pathogène opportuniste capable d'infecter un large spectre d'hôtes. Elle possède un vaste arsenal de facteurs de virulence. Le système de sécrétion de type III (SSTT) est un facteur de virulence majeur dont la régulation est complexe pour permettre une adaptation la plus précise possible de la bactérie au cours de l'infection. Nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle potentiel de nouveaux acteurs de l'adaptation de P.aeruginosa au cours de l'infection. La porine OprF qui représente la protéine la plus abondante de la membrane externe de P. aeruginosa lui permettrait d'évaluer l'état d'activation du système immunitaire de son hôte afin d'adapter sa virulence. Chez P. aeruginosa, le tryptophane est le précurseur des kynurenines qui sont également produites par l'hôte à partir du tryptophane et qui, dans ce dernier contexte, sont des immunomodulateurs. Peu ou pas d'études ont été réalisées pour mettre en œuvre un éventuel rôle d'immunomodulation ou dans la virulence des kynurénines bactériennes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à un signal anciennement découvert au laboratoire et qui réprime l'expression du SSTT à haute densité bactérienne. Nous avons montré que ce signal exerce une régulation post-transcriptionnelle en plus d'une inhibition de la transcription des gènes du SSTT. Le métabolisme du tryptophane et de l'anthranilate semble être au cœur de ce processus de régulation. En inactivant des voies du catabolisme du tryptophane, nous avons montré que la production de ce signal dépend partiellement de la voie des kynurénines mais ne dépend pas ni des voies classiques du quorum sensing ni de l'opéron phnAB, impliqué dans la synthèse de l'anthranilate. Cependant, la voie des phénazines pourrait être impliquée dans la production de ce signal. Par CLHP couplée à la spectrométrie de masse, nous avons pu séparer des espèces moléculaires réprimant le SSTT et qui sont contenues dans ce signal, mais l'identification précise nécessite plus d'investigations. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux kynurénines produites par la bactérie. Nous avons confirmé que P. aeruginosa produit des kynurénines et le gène kynA est le gène clé de la voie de synthèse de ces métabolites. En utilisant des fusions transcriptionnnelles, nous avons montré que le tryptophane et la kynurénine régulent positivement la production des kynurénines en agissant sur l'expression des gènes clés. D'autres parts, nous avons remarqué que la bactérie module l'activité de la voie métabolique des kynurénines issue du tryptophane en fonction de son état de croissance. Nous avons montré qu'au cours du dialogue interrègne bactérie/hôte, la voie des kynurénines de P. aeruginosa est stimulée par certains composants du système immunitaire. Grâce à un modèle d'infection pulmonaire aiguë, nous avons prouvé que les kynurénines produites par la bactérie sont importantes pour sa virulence. Selon notre hypothèse les kynurénines pourraient avoir une action sur la réponse immune, mais cela reste à déterminer. Dans un troisième temps, nous nous somme focalisés sur la porine OprF. Nous avons montré que la mutation ∆oprF est à l'origine d'une altération de la production mais vraisemblablement pas de la sécrétion des exotoxines du SSTT. Un ligand connu d'OprF, l'interféron gamma, module la voie des kynurénines. OprF pourrait donc avoir un rôle central dans les différents aspects de la régulation de la virulence. Nous avons donc produit des anticorps monoclonaux anti-OprF. Ces derniers se sont révélés capables de reconnaître spécifiquement la protéine OprF. Afin de vérifier l'efficacité de ces anticorps, des expériences de neutralisation de la bactérie in vitro puis in vivo seront réalisées. Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, Système de Sécrétion de Type III, régulation, catabolisme du tryptophane, kynurénines, OprF. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogen capable of infecting a wide host range. It possesses a large arsenal of virulence factors. The type III secretion system (TTSS) is a major virulence factor whose regulation is complex to allow the most accurate adaptation of the bacteria during infection. We were interested to determine the potential role of new actors in the adaptation of P. aeruginosa during infection. OprF represents the most abundant protein of the outer membrane of P. aeruginosa. This protein allows bacteria to assess the activation status of the host's immune system to adapt its virulence. In P. aeruginosa, tryptophan is the precursor of kynurenines that are also produced by the host from tryptophan and in the latter context, are immunomodulators. Little or no studies have been done to determine a possible role of bacterial kynurenines in immune modulation or virulence. Initially, we were interested in a signal previously discovered in the laboratory and which suppresses the expression of TTSS at high bacterial density. We have shown that this signal exerts a post-transcriptional regulation in addition to inhibition of TTSS genes transcription. The metabolism of tryptophan and anthranilate appears to be at the heart of this regulatory process. By inactivating pathways of tryptophan catabolism, we showed that production of this signal depends partly on the kynurenines pathway but does not depend neither classical ways of quorum sensing or phnAB operon involved in the synthesis of anthranilate. However, the phenazines pathway could be involved in the production of this signal. By HPLC coupled with mass spectrometry, we were able to separate molecular species suppressing the TTSS and which are contained in this signal, but accurate identification requires further investigation. In a second time, we were interested to kynurenines produced by the bacterium. We confirmed that P. aeruginosa produces kynurenines and KynA is the key gene in the synthesis of these metabolites. We showed that tryptophan and kynurenine upregulate the production of kynurenines by acting on the expression of key genes. Other shares, we found that the bacterium modulates the activity of the kynurenines pathway depending on its state of growth. We showed that during the dialogue bacteria / host, the pathway of kynurenines in P. aeruginosa is stimulated by certain immune system components. With an acute lung infection model, we proved that kynurenines produced by the bacterium are important to its virulence. We hypothesized that the kynurenines could have an effect on the immune response, but this remains to be determined. In a third time, we focused on the protein OprF. We showed that mutation ΔoprF is causing an alteration in production but probably not the secretion of TTSS exotoxins. One known ligand of OprF is the gamma interferon. It modulates the pathway of kynurenines. OprF could therefore have a central role in various aspects of the regulation of virulence. So, we produced monoclonal anti-OprF which recognizes specifically the protein OprF. To verify the effectiveness of these antibodies, neutralization experiments of the bacteria in vitro and in vivo will be realized.