Pour beaucoup d’entre nous, y compris pour de nombreux immunologistes, le rôle du système immunitaire est restreint à un rôle de défense contre différents pathogènes, tels que les bactéries et les virus. Pourtant, il devient de plus en plus incontestable que le système immunitaire est impliqué dans de nombreux autres phénomènes que peuvent être le cancer, l’obésité et la réparation tissulaire. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’implication des cellules immunitaires, et plus particulièrement des cellules immunitaires innées, dans le mécanisme de réparation tissulaire. Par la suite, nous avons approfondi ce travail en nous focalisant sur les dérégulations de la réparation tissulaire. Ces dérégulations peuvent donner lieu notamment à des phénomènes de « sur-réparation » telle que la fibrose. La fibrose est définie comme un dépôt excessif de matrice extracellulaire par les fibroblastes en réponse à des molécules profibrotiques tels que le TGFβ ou l’IL-13. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de la réponse immunitaire innée dans la fibrose en nous concentrant sur deux types de cellules immunitaires innées : les macrophages et les cellules lymphoïdes innées de type 2 (type 2 innate lymphoïde cells, ou « ILC2 »). Nous avons choisi comme modèle d’étude la sclérodermie systémique, maladie auto-immune caractérisée principalement par la fibrose pouvant toucher la peau et/ou les organes internes. Outre la fibrose, cette pathologie est également associée à des anomalies vasculaires et immunitaires. Les mécanismes liant ces trois caractéristiques sont encore mal définis et mal connus. Il est donc nécessaire de comprendre la physiopathologie de cette maladie et d’établir précisément l’implication de la réponse immunitaire dans la fibrose afin d’offrir un traitement thérapeutique pour les patients sclérodermiques et plus généralement pour toutes les maladies fibrotiques. Dans un premier temps, nous montrons, en cytométrie de flux, une diminution des ILC2 dans le sang des patients sclérodermiques par rapport aux témoins (0,007 ± 0,007% vs. 0,01 ± 0,01%, p=0,001). Chez les sujets sclérodermiques, cette baisse de la fréquence des ILC2 circulantes est inversement corrélée à l’atteinte de la fibrose cutanée définie par le score de Rodnan (R=-0,35, p=0,0062). Nous observons une augmentation de ces cellules dans la peau sclérodermique comparé à celle des contrôles (5,015 ± 2,8% vs. 2,816 ± 1,8%). Ce résultat est positivement corrélé au score de Rodnan (r=0,58, p=0,01). Nous obtenons des résultats similaires en immunofluorescence. Un phénotypage des ILC2 dermales nous a permis d’observer une diminution de l’expression de KLRG1 dans la peau des malades. En collaboration avec l’équipe du Pr. Batteux, nous avons étudié le rôle des ILC2 dans un modèle murin de sclérodermie. Nous observons une augmentation cutanée des ILC2 et cela même avant l’établissement de la fibrose au niveau de la peau des souris sclérodermiques (16677 ± 3068 vs. 9091 ± 474). Puis, nous montrons, in vitro, que les ILC2 stimulées par le TGFb perdent l’expression de KLRG1. Au contact des ILC2 stimulées par le TGFb, les fibroblastes deviennent pro-fibrotique en comparaison à l’incubation avec des ILC2 non stimulées. Ces résultats apportent de nouvelles connaissances dans la physiopathologie de la sclérodermie systémique et plus particulièrement dans la fibrose caractérisant cette maladie, ce qui offre des perspectives thérapeutiques potentielles. L’approche conceptuelle du rôle du système immunitaire dans la réparation tissulaire proposée dans cette thèse renouvelle notre vision de l’immunité et ouvre potentiellement un nouveau champ, encore sous-estimé, de thérapies ciblant le système immunitaire. / For many of us, including many immunologists, the role of the immune system is limited to a defense role against different pathogens such as bacteria and viruses. Yet it is becoming increasingly clear that the immune system is involved in many other phenomena such as cancer, obesity and tissue repair.During this thesis, we were interested in the involvement of immune cells, and more particularly innate immune cells, in the tissue repair mechanism. Subsequently, we deepened this work by focusing on the deregulations of tissue repair. These deregulations can lead to "over-repair" phenomena such as fibrosis. Fibrosis is defined as an excessive deposition of extracellular matrix by fibroblasts in response to profibrotic molecules such as TGFβ or IL-13. We therefore focused on the role of the innate immune response in fibrosis by focusing on two types of innate immune cells macrophages and innate lymphoid cells of type 2 (ILC2). We chose systemic scleroderma, an autoimmune disease characterized mainly by fibrosis that can affect the skin and/or internal organs, as our study model. In addition to fibrosis, this pathology is also associated with vascular and immune abnormalities. The mechanisms linking these three characteristics are still poorly defined and poorly understood.It is necessary to understand the physiopathology of this disease and to establish precisely the involvement of the immune response in fibrosis in order to offer therapeutic treatment for scleroderma patients and more generally for all fibrotic diseases.First, we show, in flow cytometry, a decrease of ILC2 in the blood of scleroderma patients compared to controls (0.007 ± 0.007% vs. 0.01 ± 0.01%, p=0.001). In scleroderma subjects, this decrease in the frequency of circulating ILC2 is inversely correlated with skin fibrosis defined by Rodnan's score (R=-0.35, p=0.0062). We observe an increase in these cells in the scleroderma skin compared to controls (5.015 ± 2.8% vs. 2.816 ± 1.8%). This result is positively correlated to Rodnan's score (r=0.58, p=0.01). We obtain similar results in immunofluorescence. In collaboration with Prof. Batteux's team, we studied the role of ILC2 in a mouse model of scleroderma. We observe an increase in cutaneous ILC2 even before fibrosis is established in the skin of scleroderma mice (16677 ± 3068 vs. 9091 ± 474). Then, we show, in vitro, that ILC2 stimulated by TGFb lose the expression of KLRG1. Upon contact with TGFb-stimulated ILC2, fibroblasts become pro-fibrotic compared to incubation with unstimulated ILC2.These results bring new knowledge in the physiopathology of systemic scleroderma and more particularly in the fibrosis characterizing this disease, which offers potential therapeutic prospects.The conceptual approach to the role of the immune system in tissue repair proposed in this thesis renews our vision of immunity and potentially opens up a new and still underestimated field of therapies targeting the immune system.STAR

L'exoenzyme S, une toxine de type III, de Pseudomonas aeruginosa possède un domaine GAP (GTPase Activating Protein) (ExoSGAP) inhibant les Rho GTPases (Rho, Rac, Cdc42) et la phagocytose dans les cellules de Mammifères en culture. J'ai utilisé une approche de transgenèse chez Drosophila melanogaster en utilisant un système d'expression tissu-spécifique inductible (UAS-Gal4) afin d'exprimer ExoSGAP. Nous avons montré qu'ExoSGAP cible in vivo les Rho GTPases Rho, Rac1, Rac2 et Cdc42. ExoSGAP affecte la résistance des mouches aux infections en inhibant la phagocytose des bactéries par les plasmatocytes, des cellules de type macrophage, mais n'a pas d'effet sur les voies NF-kB. Une approche génétique a permis d'identifier de nouvelles cibles de la toxine, en recherchant des gènes dont la dérégulation modifie le phénotype d'œil ou d'aile induit par l'expression d'ExoSGAP. Nous avons identifié plusieurs gènes pouvant avoir un rôle dans les voies des JNK et NF-kB Ces résultats valident une stratégie d'étude des toxines de type III par transgenèse chez la drosophile.J'ai parallèlement montré la spécificité de la GTPase Rac2 dans la résistance des mouches aux infections bactériennes. Rac2 participe notamment à la phagocytose.<br />Les travaux du Dr. H. Tricoire ont permis d'identifier 180 gènes dont la dérégulation modifie la réponse des mouches à un stress oxydant. J'ai testé 105 de ces lignées pour leur résistance aux infections, afin d'étudier une corrélation possible entre la réponse aux stress oxydant et infectieux. Ce crible a permis de montrer l'implication d'une protéine à domaine lectine PSLR (Pseudomonas Sensitive Lectin Receptor) dans la réponse immunitaire de la drosophile.

Cette thèse s'intéresse à la diversité génétique de six races locales de poulet à Taiwan. Le premier objectif est de combiner les données de performances d'élevage (croissance, réponse immunitaire) et les données moléculaires (marqueurs microsatellites, ADN mitochondrial, gène MC1R, marqueur LEI0258 pour le CMH) pour analyser la diversité génétique de six races de poules conservées à l'Université nationale de Chung-Hsing depuis 1982. Une méthode d'analyse multivariée est proposée pour combiner les variables continues (performances) et les fréquences alléliques (données moléculaires). L'analyse combinée discrimine clairement toutes les races à l'exception des races Ju-chi et Quemoy qui apparaissent très semblables sauf pour la réponse immunitaire. Un processus de sélection est mis en évidence sur le gène MC1R, contrôlant la couleur du plumage. Le second objectif cible le polymorphisme du complexe majeur d'histocompatibilité, décrit par le marqueur hypervariable LEI0258, et ses effets sur la réponse immunitaire. Sur un total de dix-sept allèles, sept allèles sont nouveaux. Le polymorphisme du CMH peut être un indicateur utile pour la surveillance de la diversité génétique de petites populations. Une épreuve d'infection expérimentale par un virus d'influenza aviaire faiblement pathogène a montré des différences significatives entre races, avec une réponse immunitaire plus rapide pour la race Quemoy, qui montre un effet significatif du CMH, et une sensibilité relativement plus forte à l'infection pour la race Hsin-Yi. Les races différaient aussi pour la réponse secondaire à plusieurs vaccins, avec une réponse généralement plus forte dans la race Quemoy. Une caractérisation des allèles du CMH avec une puce SNP dédiée est recommandée.

La réponse immunitaire se produit en réaction à une infection, c'est- à-dire à l'introduction d'un pathogène dans l'organisme. Nous nous intéressons à une population de cellules spécifique de la réponse, les lymphocytes T CD8. Nous avons développé un modèle non linéaire structuré en âge des dynamiques de cette réponse, à l' échelle cellulaire. Nous avons étudié l'existence et la stabilité des états d' équilibre, et obtenu des propriétés mettant en évidence, sous certaines conditions, des dynamiques à long terme correspondant à la situation biologiquement attendue. Nous avons ensuite réalisé une estimation systématique des valeurs de paramètres du modèle, afin de déterminer un ensemble de valeurs pour chaque paramètre qui permet de reproduire convenablement des données expérimentales. Cette démarche permet d'obtenir des informations sur l'influence des paramètres dans le modèle, et sur leurs variations selon la nature du pathogène. Enfin, nous nous sommes intéressés aux dynamiques de la réponse à l'échelle moléculaire, en écrivant un réseau des événements de signalisation clés depuis l'activation de la cellule en présence d'un antigène, jusqu'à l'entrée en cycle ou l'apoptose de la cellule. Nous avons déterminé un sous-modèle centré sur les choix entre survie et apoptose, que nous avons étudié mathématiquement et numériquement. Ce modèle a permis d' étudier les dynamiques de concentrations des protéines impliquées dans la signalisation intra-cellulaire de la réponse T CD8.

La pneumonie est la première cause de mortalité chez l'enfant dans le monde. Elle peut être provoquée par un certain nombre d'agents pathogènes connus mais 15 à 35% des pneumonies de l'enfant restent encore non renseignées d'un point de vue étiologique. L'utilisation d'un test moléculaire de découverte de nouveaux pathogènes nous a permis de découvrir de nouvelles espèces de Torque Teno Mini Virus (TTMV, Anelloviridae), nommées TTMV-LY, dans trois épanchements pleuraux provenant d'enfants hospitalisés avec une pleuro-pneumopathie, dont l'étiologie demeurait inconnue. Les TTMV sont des virus ubiquitaires dont l'implication dans une pathologie reste à déterminer. Les voies respiratoires ayant précédemment été décrites pour être un site d'infection des anellovirus, nous avons entrepris de caractériser ces nouveaux virus, ainsi que d'étudier leur potentiel rôle dans la pathogénèse.Les génomes complets de TTMV-LY ont été isolés, caractérisés puis répliqués in vitro. La réponse des cellules épithéliales alvéolaires, ainsi que des cellules présentatrices d'antigènes (CPA), impliquées dans l'inflammation, a été étudiée après infection par les virions néo-synthétisés.Ces travaux ont démontré que : i) les TTMV-LY peuvent coloniser les poumons en profondeur, ii) les cellules pulmonaires sont permissives aux TTMV-LY et permettent une réplication virale efficace, iii) l'infection virale module les réponses cellulaires et immunitaires des cellules pulmonaires en induisant des dérégulations de l'expression génique et la production de médiateurs inflammatoires, iv) les TTMV-LY seraient capables d'interagir avec les CPA et de réguler ainsi différentiellement le processus inflammatoire.L'ensemble de ces résultats ont permis de mettre en évidence une implication potentielle des TTMV-LY dans la pathogénèse des pneumopathies, et souligné la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu lors de l'infection par les virus de cette famille.

Seconde espèce de mollusque bivalve la plus exploitée au monde, la palourde japonaise Venerupis philippinarum représente un intérêt économique majeur. A l'échelle du bassin d'Arcachon, la maladie du muscle marron ou BMD (pour Brown Muscle Disease), pathologie émergente découverte en 2005 inquiète tout particulièrement le secteur de la pêche. Cette pathologie affecte le muscle adducteur postérieur de la palourde et perturbe l'ouverture-fermeture des valves. Cette perturbation entraine la remontée des individus à la surface du sédiment et la mort.Ces travaux de thèse ont porté d'une part sur l'épizootiologie de la maladie et son impact sur l'hôte et d'autre part sur l'identification de l'agent responsable de la maladie.Une étude sur la distribution des palourdes dans le bassin d'Arcachon (littoral Atlantique français) montre que la prévalence de la BMD a diminué entre 2010 et 2012. Toutefois cette baisse ne concerne pas les individus ayant atteint la taille légale de pêche (> 35mm). De plus, la maladie semble apparaitre chez des individus de plus en plus petit et risque donc d'accroitre la mortalité aux plus jeunes stades. L'analyse des facteurs environnementaux impliqués dans la distribution de la maladie souligne la corrélation entre la prévalence de la BMD et un hydrodynamisme relativement " calme ".La BMD affecte tout particulièrement le métabolisme énergétique de l'hôte, les mécanismes de réponse au stress oxydant et également le système immunitaire. De nombreuses fonctions sont surexprimées chez les hôtes malades mais d'autres voies comme celle de l'apoptose sont régulées négativement par l'agent infectieux.Si l'origine virale est maintenant une hypothèse solide (microscopie électronique, transcriptomique), la nature exacte de l'agent étiologique (famille virale) ne peut à ce jour être déterminée avec certitude. Des particules virales ont bien été observées dans les tissus malades mais pas dans les tissus sains, et ont pu être purifiées sur gradient de sucrose. Toutefois, les essais pour provoquer la maladie chez des individus sains ont échoué.

Les fièvres hémorragiques à virus Lassa (LASV) et Ebola (EBOV) représentent un important problème de santé publique en Afrique. Les réponses immunes et la pathogenèse associées à ces maladies sont peu connues. Les cellules NK ont un rôle important dans la réponse immune innée par leurs propriétés cytotoxiques, mais également dans l'induction des réponses adaptatives par leur production de cytokines et leurs interactions avec les cellules dendritiques (DC) et les macrophages. Ce projet s'attache à comprendre le rôle des cellules NK dans le contrôle de la réplication virale et dans l'induction des réponses immunitaires au cours de ces infections. Un modèle in vitro de coculture de cellules NK humaines avec des DC et macrophages autologues a été développé. L'activation des cellules NK et leurs fonctions ont été analysées après l'infection par LASV et EBOV. Par ailleurs, les réponses des cellules NK en réponse à LASV ont été comparées avec celles induites lors de l'infection par le virus Mopeia (MOPV), très proche de LASV mais non pathogène pour l'homme. Les macrophages, mais pas les DC, infectés par LASV ou MOPV induisent l'activation et l'augmentation des capacités cytotoxiques des cellules NK. Toutefois, les cellules NK ne sont pas capables de lyser les cellules infectées et ne produisent pas d'IFN-γ. Les cellules NK s'activent et sont capables de lyser les cellules infectées en présence de macrophages mais également de DC infectés par des LASV mutants. Cependant, les IFN de type I sécrétés en grande quantité en réponse à ces virus ne sont pas impliqués dans l'activation des cellules NK. L'infection par EBOV n'induit qu'une très faible activation des cellules NK en présence de DC ou macrophages et ne conduit pas à la sécrétion de cytokines, ni à la modification du potentiel cytotoxique.Ces résultats permettent d'améliorer la compréhension des réponses immunes et des mécanismes de pathogenèse mis en place lors des fièvres hémorragiques Lassa et Ebola.

L’interféron-α pegylé en combinaison avec la ribavirin est le seul traitement approuvé pour le traitement de l’infection au virus de l’hépatite C (VHC). L’efficacité est de 50-75%, la thérapie est coûteuse et induit beaucoup d’effets secondaires. Il est impératif d’avoir une meilleure compréhension de la pathogenèse du VHC afin de développer des traitements plus efficaces ou un vaccin. À cette fin, notre approche est de caractériser la réponse immunitaire cellulaire induite par ARFP, un antigène nouveau et conservé chez le VHC, et de cartographier les épitopes de la réponse immunitaire cellulaire d’un patient infecté au génotype 3a ayant résolu spontanément. Le génotype 3a, étant prévalant chez les utilisateurs de drogues intraveineuses (IDUs) constitue 60% des nouvelles infections. Peu d’épitopes furent identifiés auparavant pour ce génotype, ce qui rend l’étude de la réponse immunitaire difficile chez cette population. Dans cette étude, pour la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre ARFP, nous n’avons pas observé de différence significative entre les patients ayant résolu spontanément comparativement avec ceux ayant développé une infection persistante. Ceci suggère fortement que ARFP ne joue pas un rôle majeur lors de la résolution de l’infection aigue au VHC. Pour la caractérisation de la réponse immunitaire cellulaire chez un des patients infectés au génotype 3a, nous avons identifié et caractérisé 5 épitopes spécifiquement reconnus par des lymphocytes T, CD3+, CD4+ et CD8- : E2504-521, NS31064-1081, NS4b1759-1776, NS5a2074-2091, NS5b2421-2436. Nous avons comparé avec ceux connus pour le génotype 1a. Nous avons identifié 4 nouveaux épitopes. Enfin, l’épitope NS4b1759-1776, identifié auparavant, pourrait s’avérer être un candidat intéressant dans la mise au point d’un vaccin à base de peptides immunogéniques contre le VHC. / Interferon-α combined with ribavirin is the only approved treatment of hepatitis c virus (HCV) infection. The efficiency is between 50-75%, the therapy is expensive and has numerous side-effects. It is imperative to have a better understanding of HCV pathogenesis to develop better treatments or a vaccine. To this end, our approach is to characterize the immune cellular response against ARFP, a newly identified and conserved antigen of HCV; and to characterize and fine map cellular immune response of a patient infected with genotype 3a that spontanously resolved. Genotype 3a is most prevelant in intravenous drug users (IDUs) where nearly 60% of all new HCV infections happen. Very few epitopes are known for genotype 3a which makes it difficult to study HCV-specific immune responses in this population. In this study, for ARFP specific cellular responses, we observed no significant difference between patients that spontanously resolved compared to those who developped persistent infection. This strongly suggests that ARFP does not play a major role in acute HCV infection resolution. For the charaterization of immune cellular response developped against genotype 3a, we identified and characterized 5 epitopes recognized by lymphocytes T, CD3+, CD4+, CD8-: E2504-521, NS31064-1081, NS4B1759-1776, NS5A2074-2091, NS5B2421-2436. We compared them with epitopes known for genotype 1a. We have identified 4 novel epitopes. Finally, NS4B1759-1776, previously identified, could be a good candidate in the developement of a peptide based vaccine against HCV.

Candida albicans est un pathogène opportuniste présent à l'état commensal chez 75% de la population. Il s'agit du premier pathogène d'origine fongique (4ème cause d'infections nosocomiales) responsable d'infections superficielles chez les personnes immunocompétentes ou d'infections profondes chez les personnes immunodéprimées. Les protéines à ancre GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol) de C. albicans, situées à l'interface entre la levure et les cellules de l'hôte, semblent être les plus aptes à moduler la réponse immunitaire. Au cours de cette étude, une banque de surexpression et de sécrétion d'une vingtaine de domaines fonctionnels putatifs issus de protéines à ancre GPI potentiellement exposées à la surface a été construite. Le crible réalisé a permis d'identifier sept polypeptides impliqués dans la modulation de la réponse des cellules macrophages et trois polypeptides ayant des propriétés immunogènes. Dans un deuxième projet, nous avons démontré que la protéine à ancre GPI Rbt1 spécifique des hyphes de C. albicans avait des propriétés d'adhésines aux substrats abiotiques et contribuait à la formation de biofilm et d'agrégats. La caractérisation de cette protéine a permis d'apporter des données nouvelles concernant l'exposition en surface de protéines membranaires suivant la forme morphologique de C. albicans.

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