FELIX, Wagner Pereira. Produção heteróloga de frutalina em Pichia pastoris. 2008. 113 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:13:10Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_wpfelix.pdf: 3013919 bytes, checksum: 5ad2f9b358ba8740f49b54a25064ab73 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:44:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_wpfelix.pdf: 3013919 bytes, checksum: 5ad2f9b358ba8740f49b54a25064ab73 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_wpfelix.pdf: 3013919 bytes, checksum: 5ad2f9b358ba8740f49b54a25064ab73 (MD5) Previous issue date: 2008 / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 οC and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag. / A frutalina, lectina α-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterólogo para expressão de proteínas utilizando a levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas três estratégias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genômico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptídicas da frutalina, otimizando-o para a expressão em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenção do cDNA utilizando a técnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratégia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratégias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratégia que mostrou melhor expressão da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenção do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresão foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presença do peptídeo de ligação e da cauda de histidina.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A frutalina, lectina α-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterÃlogo para expressÃo de proteÃnas utilizando a levedura metilotrÃfica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas trÃs estratÃgias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genÃmico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptÃdicas da frutalina, otimizando-o para a expressÃo em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenÃÃo do cDNA utilizando a tÃcnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratÃgia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratÃgias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratÃgia que mostrou melhor expressÃo da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenÃÃo do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresÃo foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presenÃa do peptÃdeo de ligaÃÃo e da cauda de histidina. / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 οC and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os genes sintÃticos das lectinas das algas marinhas vermelhas Hypnea musciformis (HML) e Bryothamnion triquetrum (BTL) foram clonados em diferentes vetores e transformados em diferentes cÃlulas bacterianas de expressÃo. As lectinas recombinantes foram obtidas a partir da fraÃÃo solÃvel das culturas bacterianas de Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) para rHML e BL21 (DE3) para rBTL. Os testes de hemaglutinaÃÃo mostraram que rHML e rBTL sÃo capazes de aglutinar eritrÃcitos de coelho tratados com diferentes enzimas proteolÃticas. As propriedades hemaglutinantes de rHML e de rBTL confirmam o enovelamento correto e o estado funcional das proteÃnas. A caracterizaÃÃo da especificidade de ligaÃÃo a carboidratos da HML, BTL e da rBTL por glycan array mostrou uma especificidade restrita por oligossacarÃdeos complexos contendo o nÃcleo de fucosilaÃÃo (α1-6), com uma preferÃncia particular por N-glicanos nÃo bisectados, bi e tri-antenados de cadeia curta. A presenÃa de Ãcido siÃlico na extreminada nÃo-redutora dos glicanos favorece o reconhecimento. Essa foi a primeira caracterizaÃÃo de lectinas de algas vermelhas por glycan array. Experimentos de STD-RMN com a BTL mostraram uma interaÃÃo com um octassacarÃdeo contendo o nÃcleo de fucosilaÃÃo (α1-6). A atividade tÃxica das lectinas selvagens e recombinantes foi avaliada contra Artemia sp. e contra cÃlulas de adenocarcinoma de pulmÃo (A549). Nos ensaios de citotoxicidade, HML, rHML, BTL e rBTL nÃo mostraram nenhuma toxicidade contra Artemia sp. e somente HML e rHML mostraram uma baixa toxicidade contra cÃlulas de adenocarcinoma de pulmÃo (A549). O primeiro cristal de rBTL foi obtido a um nÃvel de microescala com a ajuda de um robÃt de cristalizaÃÃo e difratou a 15 Ã de resoluÃÃo. / Synthetic genes from the red marine algae Hypnea musciformis (HML) and Bryothamnion triquetrum (rBTL) were cloned into differents vectors and transformed into several bacterial expression strains. The recombinant lectins were obtained from the soluble fraction of bacterial cultures using Escherichia coli Rosetta-gami 2 (DE3) strain for rHML and E. coli BL21 (DE3) strain for rBTL. Haemagglutination tests showed that rHML and rBTL are able to agglutinate rabbit erythrocytes with strong haemagglutination activity only after treatment with papain and trysine indicating that their ligands are not directly accessible at the cell surface. The haemagglutinating properties of rHML and rBTL confirm the correct folding and functional state of the proteins. A study of the specificity of these lectins by glycan array was conducted. HML, BTL and rBTL showed a restricted specificity for complex N-glycans with core (α1-6) fucose. A more detailed analysis of the specificity of these lectins showed a preference for non bisecting N-glycans, bi- and tri-antennary branching sugars with short chains. Addition of Sialic acid at the non-reducing end of N-glycans favors their recognition by the lectins. This is the first characterization of lectins from red algae by glycan array. An interaction between BTL and a core (α1-6) fucosylated octasaccharides was also observed by STD-NMR. The toxic activity of wild and recombinant lectins were evaluated against Artemia sp. and the human lung adenocarcinoma cell line (A549). In cytotoxicity assays, HML, rHML, BTL and rBTL showed no toxicity against Artemia sp. Only HML and rHML showed a low cytotoxic activity against cell line (A549). The first crystal of rBTL was obtained in micro-scale level using a robot and diffracted at 15 Ã.