Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen dienten zur Identifizierung von Faktoren, die das Zusammenspiel zwischen dem photosynthetischen Elektronentransport und den Reaktionen im Stroma koordinieren. Hierzu erfolgten Manipulationen von Elektronen- und/oder Metabolit­verfügbar­keit im Chloroplasten. Als Untersuchungsmaterial dienten zunächst isolierte Spinat-Chloroplasten unter sättigendem CO2 und Pi. Durch die Herstellung transgener Kartoffelpflanzen, welche die zentralen Elektronenverteiler Fd I und FTR über- bzw. unterexprimieren, wurde die Elektronenverfügbarkeit im Chloroplasten dann dauerhaft verändert. Auswirkungen von zusätzlichen Elektronenakzeptoren auf den Chloroplastenmetabolismus Die Zugabe von verschieden „starken“ Elektronenakzeptoren zu Chloroplasten während der „steady state“-Photosynthese bei ausreichendem Lichtangebot hatte zwei Effekte zur Folge. Ein moderater Elektronenentzug (0,2 und 2 mM OAA, 0,2 mM Nitrit) beeinträchtigte ausschließlich den Aktivierungszustand der NADP-MDH, während die Aktivierungszustände von NAD(P)-GAPDH, FBPase und PRK nahezu unverändert waren. Auch qN, der stromale Metabolitgehalt und die [14CO2]-Fixierung waren nur geringfügig beeinflußt. qP hingegen war stark erhöht. Im Gegensatz dazu inhibierten Nitrit bzw. Methylviologen in höheren Konzentrationen die [14CO2]-Fixierung. Das ATP/ADP-Verhältnis stieg an und das NADPH/NADP-Verhältnis war nahezu unverändert. Eine extreme Erhöhung war im DHAP/PGA-Verhältnis und der stromalen FBP-Menge meßbar. Die Aktivierungszustände von FBPase und NADP-MDH nahmen nach Zugabe stark ab, während die Aktivierungszustände von NAD(P)-GAPDH und PRK unbeeinflußt blieben. Zusammenspiel von Elektronenangebot und Effektoren auf die Redoxmodulation von Chloroplastenenzymen Eine Veränderung im Elektronenangebot durch variierende Lichtintensitäten verdeutlichte, daß bei höheren Lichtintensitäten ein Großteil der Elektronen nicht für die CO2-Fixierung genutzt werden kann. Parallel zur Sättigung der CO2-Fixierung stiegen FBPase- und NADP-MDH-Aktivierungszustände an, während PRK und NAD(P)-GAPDH schon bei Intensitäten von 50 µE den maximalen Aktivierungszustand erreichten. Die Zugabe von Intermediaten, die positiv bzw. negativ auf den Aktivierungszustand der einzelnen Enzyme wirken, hatten wieder bei NADP-MDH und FBPase die deutlichsten Auswirkungen. Sowohl NAD(P)-GAPDH- als auch PRK-Aktivierungszustände waren nur unter Bedingungen erniedrigt, unter denen der Elektronenfluß stark herabgesetzt ist und im Stroma wenig ATP, Triosephosphate und 3PGA vorhanden sind. Demgegenüber reagiert NADP-MDH sehr sensitiv auf Umlenkung oder Erhöhung des Elektronenflusses. Im Fall der FBPase bestehen lineare Zusammenhänge zwischen FBP-Gehalt oder aktuellem Elektronendruck und dem Aktivierungszustand des Enzyms. Die an Chloroplasten erhaltenen Ergebnisse zeigen: Die Redoxmodulation im Licht spielt weder bei PRK noch bei NAD(P)-GAPDH eine herausragende Rolle. Die Bedeutung dieses grundlegenden Regulationsmechanismus liegt für beide Enzyme im Licht/Dunkel- und Dunkel/Licht-Übergang. Durch die „feed back“-Regulation der NADP-MDH durch NADP erfolgt bei diesem Enzym immer eine direkte Rückkopplung auf die Elektronenverfügbarkeit im Stroma. Aufgrund der sensitiven Reaktion auf Änderungen im NADPH/NADP-Verhältnis stellt das Enzym einen sehr guten Marker für den im Stroma vorherrschenden Elektrondruck dar. Die sensitiven Schritte im Calvin-Zyklus stellen die FBPase und die sehr ähnlich regulierte SBPase dar. Der aktivierende Effekt von FBP auf die FBPase wird durch den Elektronendruck in der Weise beeinflußt, daß eine Erhöhung der Lichtintensität in höheren Enzymaktivitäten unter vergleichbaren FBP-Konzentrationen resultieren. Bei einer Limitierung im Elektronenangebot scheint die Aktivierung dann unabhängig vom FBP-Gehalt zu sein. Restriktionen im Calvin-Zyklus, die zu einer verminderten FBP-Bereitstellung bei hohem Elektronenangebot führen, reichen für eine Aktivierung ebenfalls nicht aus. Somit stellt der aktuelle Aktivierungszustand des Enzyms einen kombinierten Effekt aus Elektronenverfügbarkeit und FBP-Gehalt dar. Manipulation der Elektronenflüsse in vivo durch Veränderugen im Fd-Gehalt Die Transformation von Kartoffelpflanzen mit dem homologen fed 1-cDNA-Klon (diese Arbeit) in „antisense“-Orientierung bewirkte eine maximal 50%ige Reduktion im Fd I-Proteingehalt. Eine weitere Reduktion im Fd I-Gehalt scheint für die Pflanze letal zu sein. Sowohl moderat supprimierte (80-100% des Wildtyp-Gehaltes) als auch stärker supprimierte Linien (50-80%) wiesen verstärkten zyklischen Elektronentransport und eine verringerte CO2-Assimilationsrate auf, zeigten aber kein Anzeichen von O2-Reduktion. Als Schutz gegen oxidativen Stress war in den „antisense“-Linien ein verminderter Elektronenfluß nachweisbar, indem die Effizienz der Lichtnutzung von PSI und PSII vermindert war. Dabei wurden zwei Strategien deutlich, die aber beide zu weniger funktionellem PS II und verringerten Quantenausbeuten führten: In den moderaten Linien war ein extremer DpH für diesen Effekt verantwortlich, während die stärker supprimierten Linien Photoinhibition zeigten. Weiterhin trat in den „antisense“-Linien eine bis zu 25%ige Reduktion im Chlorophyllgehalt bei erhöhten Chlorophyll a/b-Verhältnissen auf. Eine solche Akklimatisierung tritt bei Pflanzen auf, die an schwache Lichtintensitäten adaptiert sind und Starklicht ausgesetzt werden. Eine Überexpression des heterologen fed 1-cDNA-Klon aus Spinat in Kartoffelpflanzen hatte gegenteilige Effekte zur Folge. Die Elektronentransportketten zwischen den Photosystemen waren weniger reduziert, die Transformanten wiesen in Kurzzeitversuchen eine bis zu 10% höhere CO2-Assimilation auf und auch die Effizienz der Lichtnutzung war erhöht. Die im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen stark erhöhten Chlorophyllfluoreszenz-Endsignale deuten darauf hin, daß ein größerer Anteil stromaler Akzeptoren reduziert vorliegt. Gleichzeitig war das Chlorophyll a/b-Verhältnis erniedrigt. In Abhängigkeit von der Fd I-Menge, und im Endeffekt vermutlich durch die im Stroma verfügbare Akzeptor-Menge bedingt, erfolgt eine Erhöhung bzw. Erniedrigung von qP. Der permanent erhöhte Redoxstatus zwischen den Photosystemen scheint in den Fd I-Transformanten eine Adaptation des Chlorophyll a/b-Verhältnisses in die Richtung zu bewirken, daß im Fall der Unterexprimierer eine Anpassung in Richtung Starklicht erfolgt, während die Überexprimierer eine Schwachlichtanpassung zeigen. Ein Hinweis in diese Richtung ist die gute Korrelation zwischen qP und dem Chlorophyll a/b-Verhältnis. Isolierung von ftr a- und ftr b-cDNA-Klonen aus Kartoffel und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen Für eine Manipulation der Elektronenflüsse in Richtung Td erfolgte eine „antisense“-Transformation mit dem ftr b-cDNA-Klon aus Kartoffelblatt (diese Arbeit). Die primären Transformanten wiesen keinen Phänotyp auf. Eine Transformation im heterologen System mit dem „antisense“-ftr b-cDNA-Klon aus Spinat erwies sich als ineffektiv. Eine Überexpression des ftr b-cDNA-Klons aus Spinat in Kartoffel war erfolgreich; Pflanzen mit Cosuppression wurden nicht gefunden. Auch erfolgte in diesen Pflanzen keine Coregulation in der Expression der FTR A-Untereineinheit. Für eine Überexpression von funktioneller FTR könnte der ftr a-cDNA-Klon aus Kartoffelblatt (diese Arbeit) zusammen mit dem ftr b-cDNA-Klon transformiert werden.

Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen dienten dazu, die Eigenschaften und Grundlagen zur Regulation der chloroplastidären NAD(P)(H)-GAPDH im Wechsel zwischen Licht- und Dunkelmetabolismus aufzuklären. Dazu wurden Untersuchungen mit dem System ‘isoliertes Enzym’ und dem System ‘isolierte Chloroplasten’ durchgeführt. Durch die Herstellung proteolysierter NAD(P)(H)-GAPDH und rekombinanter Untereinheiten GapAM, GapBM und GapBMDC, sowie gleichzeitig exprimierter GapAMBM und GapAMBMDC war die Möglichkeit geschaffen, die Funktion der CTE bei der Regulation zu untersuchen. Eigenschaften von NAD(H)-abhängiger plastidärer GapCp konnten mit angereinigtem und rekombinant hergestelltem Enzym aus roter Paprikafrucht ermittelt werden. Regulation von NAD(P)(H)-GAPDH im isolierten intakten Chloroplasten aus Spinat Durch Reduktion von NAD(P)(H)-GAPDH in belichteten isolierten intakten Spinatplastiden, vermutlich durch Thioredoxinf, ist das Enzym sensitiver gegenüber 1,3bisPGA, da der Ka-Wert von 17-21 µM auf ca. 1-2 µM gesenkt wird. Die gleichzeitig steigende Konzentration von 1,3bisPGA auf ca. 0,8 µM im Chloroplasten führt zur Aktivierung und damit verbundener Dissoziation des Enzyms. Die Aktivierung betrifft ausschließlich die NADPH-abhängigen Aktivitäten. NADPH, NADP und ATP scheiden als Aktivatoren in vivo aus, da sie bei im Chloroplasten im Licht und im Dunkeln herrschenden Konzentrationen von 140 µM NAD das Enzym nicht aktivieren und unphysiologisch hohe Konzentrationen der Effektoren zur Aktivierung des Enzyms benötigt würden. Die Inaktivierung im Dunkeln erfolgt durch Absenkung der 1,3bisPGA-Konzentration, und das Enzym wird durch ein bislang nicht bekanntes Oxidationsmittel oxidiert. NAD, sowie möglicherweise auch GAP und NADH sind an der Inaktivierung und gleichzeitigen Aggregation beteiligt. Die CTE der Untereinheit B ist für die Aggregation/Dissoziation von NAD(P)(H)-GAPDH verantwortlich Im Vergleich von NAD(P)(H)-GAPDH-Isoenzymen besitzt ausschließlich GapB aus Chloroplasten höherer Pflanzen eine CTE von 28-32 Aminosäuren Länge. Sie ist gekennzeichnet durch zwei konservierte Cysteine, zwischen denen sich acht Aminosäuren befinden. In der Mitte dieser acht Aminosäuren befindet sich ein Prolin, welches u.a. für den Richtungswechsel bei der Faltung eines Proteins verantwortlich ist, so dass sich zwischen den beiden Cysteinen eine Disulfidbrücke ausbilden könnte. Die CTE aus Spinat besitzt außerdem einen hohen Anteil von sieben negativ geladenen Aminosäuren. In Rahmen dieser Arbeit wurde ein Modell enwickelt, welches beinhaltet, dass die Aggregation von vier (A2B2)-Tetrameren über Salzbrückenbindung negativ geladener Aminosäuren der CTE und nach außen exponierten positiv geladenen Aminosäuren von GapA vermittelt wird. Ergebnisse mit NAD(P)(H)-GAPDH, der die CTE fehlt, d.h. proteolysierte NAD(P)(H)-GAPDH und rekombinant hergestellte GapAM, GapBMDC und GapAMBMDC bestätigen das Modell. Die drei tetrameren Formen, sowie die gleichzeitig exprimierte GapAMBMDC sind nicht fähig, zu aggregieren. Ausschließlich GapB und die gleichzeitig exprimierte GapAMBMC aggregieren in eine hochmolekulare Form von ca. 470 kDa, bzw. eine Mischung von 470 und 300 kDa. Die CTE der Untereinheit B ist für die Redoxmodulation von NAD(P)(H)-GAPDH verantwortlich. NAD(P)(H)-GAPDH höherer Pflanzen besitzt fünf konservierte Cysteine: 18, 149, 153, 274 und 285, wovon sich Cystein 149 und Cystein 153 im aktiven Zentrum befinden. Cystein 153 in nicht an der Katalyse beteiligt. In der CTE von GapB sind zusätzlich zwei Cysteine 355 und 364 konserviert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die lange Zeit prognostizierte intramolekulare Disulfidbrücke zwischen Cystein 18 und 285 nicht vorhanden ist. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass in Algen, deren NAD(P)(H)-GAPDH als redoxmoduliert beschrieben ist, Cystein 285 nicht vorkommt. Weiterhin zeigen eigene Ergebnisse, dass NAD(P)(H)-GAPDH, der die CTE fehlt, d.h. proteolysierte NAD(P)(H)-GAPDH, rekombinant hergestellte GapAM und GapBMDC, weder durch DTTred noch in Kombination mit 1,3bisPGA aktiviert werden. Die tetrameren Formen sind nicht redoxmoduliert. Daraus wird gefolgert, dass die für die Redoxmodulation verantwortliche Disulfidbrücke sich in der CTE von GapB befindet. Die CTE der Untereinheit B ist für die Nucleotidspezifität von NAD(P)(H)-GAPDH verantwortlich Die Bindung von NADPH, bzw. NADH in den verschiedenen Isoenzymen von NAD(P)(H)-GAPDH hängt von der Aminosäurezusammensetzung in den Positionen 32, 33, 187 und 188 ab. Die Aminosäuren 187 und 188 befinden sich auf einem S-loop, der in das aktive Zentrum eines benachbarten Monomers hineinreicht und mit ihm eine funktionelle Einheit bildet. NAD(H) wird in den Positionen 32 und 33 gebunden; eine Bindung von NADP(H) ist durch sterische Hinderung und Ladung des Prolins 188, welches in cytosolischer NAD(H)-GAPDH vorkommt, nicht möglich. Da chloroplastidäre NAD(P)(H)-GAPDH in der Position 188 ein Serin besitzt, kann die Phosphatgruppe von NADP(H) binden. Aufgrund der Affinitäten der inaktiven 600 kDa- und aktiven 150 kDa-NAD(P)(H)-GAPDH für NADPH, bzw. der in Chloroplasten im Licht wie im Dunkeln herrschenden NADPH-Konzentrationen, wäre es theoretisch möglich, dass das Coenzym sowohl bei Belichtung als auch im Dunkeln umgesetzt wird. Während des Licht-Dunkel-Übergangs wechselt das Enzym jedoch zwischen dem Coenzym NADPH und NAD. In dieser Arbeit konnte anhand eines Modells aufgezeigt werden, dass im Dunkel-adaptierten Chloroplasten die Bindung von NADPH an der Aminosäure 188 unterbunden ist, da der S-loop um einige A aus dem aktiven Zentrum gezogen wird. Ursache dafür ist mit großer Wahrscheinlichkeit die CTE, die in der 600 kDa-Form an positiv geladenen Aminosäuren des S-loops bindet. Die Aktivierung von NAD(P)(H)-GAPDH in struktureller Hinsicht. Die 600 kDa-Form von NAD(P)(H)-GAPDH ist mit dem Coenzym NADPH inaktiv, da sich innerhalb der CTE eine Disulfidbrücke gebildet hat. Die strukturelle Änderung der CTE erlaubt es, dass negativ geladenene Aminosäuren der CTE an nach außen exponierten positiv geladenen Aminosäuren eines S-loops von GapA binden können. Dadurch ist eine Bindung von NADPH im aktiven Zentrum an den S-loop nicht möglich. NAD kann ungehindert binden. Bei einsetzender Belichtung wird die Disulfidbrücke der CTE aufgebrochen, ohne dass das Enzym dissoziert. Mit steigenden Konzentrationen von dreifach negativ geladenem 1,3bisPGA wird die Salzbrückenbindung zwischen der CTE und dem S-loop gelöst, so dass NAD(P)(H)-GAPDH in vier Tetramere dissoziiert und gleichzeitig NADPH umsetzen kann.