In this thesis resonance energy transfer between perylene and fluorescein in tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB) solution was studied. The influence of addition of native or modified sodium hyaluronate on resonance energy transfer was also investigated. The addition of native sodium hyaluronate supports energy transfer at lower fluorescein concentrations and the addition of modified sodium hyaluronate influences the maximal value of energy transfer effectivity. Strong influence on the critical micelle concentration (CMC) values with the addition of sodium hyaluronate during CMC of TTAB determination was investigated. The data indicates not only micelles formation, but also formation of aggregates of sodium hyaluronate with TTAB. Aggregation numbers of TTAB with addition of native and modified sodium hyaluronate by the quenching of pyrene by cetylpyridinium chloride (CPC) was investigated. The addition of sodium hyaluronate into the solution of TTAB changes the average mean aggregation number. Solute exchange between micelles of TTAB and the influence of addition of modified sodium hyaluronate on this exchange was also investigated. No solute exchange between micelles in TTAB and in TTAB with added modified sodium hyaluronate was discovered during this experiment.

RésuméLes monocouches auto-assemblées d'ADN immobilisées sur électrodes d'or sont à la base de nombreux biocapteurs électrochimiques. Le contrôle du comportement interfacial de l'ADN par le biais d'un champ électrique est intéressant pour la détection de polymorphisme nucléotidique simple (PNS). La caractérisation in situ de monocouches d'ADN à l'échelle moléculaire est importante pour la fabrication de biocapteurs robustes, fiables et sensibles.La thèse porte sur la détection du PNS dans l'ADN par le biais d'hybridation/dénaturation induite par le champ électrique. La microscopie de fluorescence sous conditions électrochimiques est utilisée comme méthodologie de détection et outil de caractérisation de l'interface d'ADN. À cette fin, des séquences d'ADN marquées par des sondes fluorescentes sont immobilisées sur des électrodes d'or sous forme de monocouches auto-assemblées (SAM) thiolées.Premièrement, les SAMs sont composées de séquences cibles présentant ou non une mutation ponctuelle. La relation entre le potentiel appliqué et la dénaturation du double brin est étudiée. La dénaturation électrochimique est observée à -0,25 V vs Ag / Deoxyribonucleic acid (DNA) self-assembled monolayers (SAMs) immobilized on gold electrodes are the basis of many electrochemical biosensors. Control of the interfacial behavior of DNA by means of an electric field is of interest for sensing applications such as the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs). Moreover, the in situ characterization of immobilized DNA monolayers at a molecular level is important for the fabrication of robust, reliable and sensitive sensors.The thesis aims at studying the discrimination between DNA strands containing SNPs on the basis of electric-field assisted hybridization/denaturation of DNA. In situ electrochemical fluorescence microscopy is used as a detection methodology and characterization tool for DNA interfaces. For this purpose, fluorescently labeled DNA sequences are immobilized at gold electrodes as thiol SAMs.First, the SAMs under investigation were composed of perfect match or SNP-containing target sequences. The relationship between the applied potential and the denaturation of DNA duplexes was investigated. Electrochemical melting was observed at -0.25 V vs. Ag / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Adenylate cyclase (CyaA, ACT) toxin is one of the major virulence factors of Bordetella pertussis. Although CyaA binds to many types of membranes, it is assumed that the integrin CD11b/CD18 is its receptor which is expressed on the surface of myeloid cells. CyaA belongs to the family of RTX toxin-hemolysins. CyaA acts on the host cells by two independent activities. One of them is the conversion of ATP to cyclic AMP, which is catalyzed by adenylate cyclase (AC) domain after its translocation into the cytosol of the host cell, which leads to the entry of calcium cations into the host cell. Translocation is probably initiated by interaction of CyaA monomer with the target membrane. The second activity is the formation of CyaA channel selective for cations, which probably causes colloid osmotic lysis of target cells. The channel forming activity is provided by RTX hemolysin domain which most probably forms oligomers, although it was found that CyaA as a monomer causes leakage of potassium cations from the host cell. It is also not clear whether the oligomerization of CyaA would occur in solution, or after interaction with the host membrane. The aim of this study was to examine the flow of sodium ions on the membrane of murine macrophages J774A.1, which express integrin CD11b/CD18 on their surface....

Les biomarqueurs à base d’acides nucléiques, qui sont impliqués dans le contrôle de l'expression génétique, sont spécifiques de nombreux types de cancers. Les applications basées sur le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) sont parmi les plus prometteuses pour la biodétection d’acides nucléiques. Comme la détection simultanée de plusieurs acides nucléiques est très demandée et que le multiplexage spectral est limité par des interférences (optical crosstalk), le multiplexage temporel est utilisé ici pour ajouter de nouvelles possibilités de multiples détections simultanées. La thèse porte sur le développement de systèmes comprenant différentes distances entre molécules donneuses et acceptrices de FRET (Terbium vers fluorophores) pour créer des signaux d'intensité spécifiques correspondant à différentes séquences d'acides nucléiques. Les distances Tb-to-dye peuvent être arrangées en positionnant spécifiquement le donneur Tb sur des molécules d’ADN de différentes longueurs. Les technologies d'amplification d’acides nucléiques, telles que la réaction d'hybridation en chaîne (HCR) et l’amplification circulaire de l’ADN (RCA), ont été utilisées pour obtenir simplicité, rapidité, sélectivité et sensibilité dans la détection d’acides nucléiques. Le multiplexage temporel du signal de FRET a également été combiné avec le multiplexage spectral (couleur) pour le démultiplier. De plus, la possibilité d'un multiplexage temporel à base de nanoparticules a été démontrée. / Nucleic acid biomarkers, which involve in gene expression control, are found specific for many kinds of cancers. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based applications are one of the most promising for nucleic acid biosensing. As parallel detection of multiple nucleic acids is highly demanded and spectral multiplexing is limited by optical crosstalk, temporal multiplexing is used for opening another dimension of the multiplexing. The thesis focuses on developing different Tb-to-dye FRET distances to create specific intensity signals corresponding to different nucleic acid sequences. The Tb-dye distances can be tuned by specific location of the Tb donor using different lengths of DNA. Amplification technologies, such as hybridization chain reaction (HCR) and rolling circle amplification (RCA), are used to achieve simplicity, rapidity, selectivity, and sensitivity of nucleic acid detection. Temporal multiplexing FRET was also combined with spectral (color) multiplexing for higher order multiplexed detection. Moreover, a single Tb-QD FRET modeling demonstrated the possibility of nanoparticle-based temporal multiplexing.

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La communication cellulaire est un phénomène important pour le maintien de l’homéostasie des cellules. Au court des dernières années, cette sphère de recherche sur la signalisation cellulaire a connue des avancées importantes au niveau de l’identification des acteurs principaux impliqués dans la reconnaissance extracellulaire des signaux, ainsi que la compréhension des voies de signalisation engagées par les cellules pour répondre aux facteurs extracellulaires. Malgré ces nouvelles informations, les diverses interrelations moléculaires entre les acteurs ainsi que les voies de signalisation cellulaire, demeurent mal comprises. Le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permet la mesure d’interactions protéiques et peut être utilisé dans deux configurations, le BRET480-YFP (connu aussi comme le BRET1) et le BRET400-GFP (connu aussi en tant que BRET2). Suite à l’oxydation de son substrat, la luciférase de renilla peut transférer son énergie à une protéine fluorescente, uniquement si elles sont à proximité l’une de l’autre (≤100Å). La combinaison dans un seul essai des BRET480-YFP et BRET400-GFP, a permis de suivre trois paires d’interactions, sur une même population cellulaire. Par contre, l’utilisation de deux substrats pour la réaction de bioluminescence rend impossible la mesure simultanée des différents signaux de BRET, pour ce trois nouvelles configurations de BRET ont été mises au point en utilisant des nouvelles protéines fluorescentes. Ainsi deux des nouvelles couleurs de BRET ayant des émissions résolues, le BRET400-BFP et le BRET400mAmetrine ont pu être combinées pour mesurer l’engagement par un RCPG d’une protéine G, ainsi que l’accumulation du second messager. La combinaison de ces BRET a également permis de révéler la formation d’un complexe entre le récepteur α2A adrénergique (α2AAR), Gαi1, le dimère Gβγ ainsi que la kinase des récepteurs couplés aux protéines G (GRK2), suite à l’activation du récepteur. De plus, seule l’entrée de GRK2 semble être en mesure de causer la désensibilisation du α2AAR, en s’intercalant entre Gαi1 et Gβγ. Par contre, la stabilisation de l’interaction entre α2AAR et la β-arrestine2 semble nécessiter l’activité kinase de GRK2. Une autre étude a révélé l’importance de différentes Gα pour la mobilisation du calcium, suite à l’activation du récepteur aux opioïdes de type delta (DOR). Suite à la surexpression de Gα de la famille Gαq, il a été possible de mesurer une influence de ces Gα sur la mobilisation du calcium. Toutefois, cette réponse calcique mesurée en présence des Gαq demeure sensible aux prétraitements à la toxine de Bordetella pertussis, qui inhibe sélectivement l’activité des Gαi. De plus, la co-expression de Gαi et Gαq permet de potentialiser la mobilisation de calcium, démontrant une interrelation entre ces deux familles de protéine Gα, pour la signalisation du DOR. Afin de démontrer l’interrelation directe, des expériences de BRET ont été réalisées entre différentes Gα. En plus de montrer la formation de complexes sélectifs entre les Gα, les expériences de BRET réalisées en parallèle d’analyses de séquences de Gα, ont également mis à jour un site de sélectivité d’interaction entre les Gα, l’hélice α4. Suite à la transposition de cette hélice α4 de Gα12 sur Gαi1, qui normalement n’interagissent pas, il a été possible de forcer l’interaction entre Gα12 et Gαi1, confirmant ainsi que cette hélice α contient l’information permettant une sélectivité d’interaction. Au cours de cette thèse, il a été possible de générer de nouvelles méthodes de mesure d’interactions protéiques qui permettent de multiplexer différents signaux, ce qui a permis de mettre à jour de nouvelles interactions entre divers effecteurs de la signalisation de RCGP / Cellular communication is an important phenomenon for the maintenance of cellular homeostasis. Recently, important progress has been made in the cell signalling research field concerning the identification of the major actors and the cellular pathways engaged in response to these extracellular factors. However, in spite of this new information, the interrelationships at the molecular level between the various cellular actors and the different signalling pathways remain badly understood. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) monitors interactions between proteins and can be used in two configurations, the BRET480-YFP (also known as BRET1) and the BRET400-GFP (also known as BRET2). Following oxidation of its substrate, renilla luciferase transfers its energy to a fluorescent protein, only if they are in close proximity (≤100Å). By combining the BRET480-YFP and BRET400-GFP in one assay, it is possible to follow three pair-wise interactions in the same cellular population. However, using two bioluminescence reaction substrates limits the possibility of measuring the different BRET signals simultaneously. In order to measure multiple BRET signals simultaneously, three new BRET configurations, based on the BRET400-GFP, were developed using fluorescent proteins with different emission wavelengths. Two of the new BRET colors which have resolved emission wavelengths, the BRET400-BFP and BRET400mAmetrine, were combined for measuring the heterotrimeric G protein engagement by the vasopressin V2 receptor, as well as the accumulation of the second messenger. Combining these new BRET techniques reveals for the first time the formation of a complex between the α2A adrenergic receptor (α2AAR), Gαi1, the Gβγ dimer and G protein-receptor kinase (GRK2) following receptor activation. Moreover, only the entry of GRK2 into the receptor complex is required for the α2AAR desensitization, by inserting between Gαi1 and Gβγ. On the other hand, the stabilization of the interaction between α2AAR and β-arrestin2 requires the kinase activity of GRK2. Another study revealed the importance of multiple Gα subunits for calcium mobilization induced upon activation of the delta opioid receptor (DOR). Gαq subfamily member overexpression altered the DOR-induced calcium mobilization, but this Gαq calcium mobilization remained sensitive to pre-treatement pertussis toxin, through selective inhibition of the activity of Gαi members. Moreover, Gαi and Gαq co-expression potentiated calcium mobilization, suggesting an interrelationship between these two Gα families in DOR signaling. This Gαi and Gαq interrelationship could result from the formation of a complex close to the receptor. In order to test this hypothesis, BRET experiments were performed, with the aim of measuring the presence of complexes between different Gα. In addition to demonstrating complex formation between Gα subunits, the BRET experiments in parallel with sequence analysis, also revealed a selective interaction site between the Gα, the α4 helix. By swapping the a4 helix of Gαi with the α4 helix of Gα12, which doesn’t normally interact with Gα12, it was possible to force the interaction between Gα12 and Gαi to confirm that this α helix contains information concerning the selectivity of interactions between Gα subunits. During this thesis, new methods were to detect protein interactions and multiplexing these methods allowed the detection of novel interactions between signalling effectors of GPCRs.

La communication cellulaire est un phénomène important pour le maintien de l’homéostasie des cellules. Au court des dernières années, cette sphère de recherche sur la signalisation cellulaire a connue des avancées importantes au niveau de l’identification des acteurs principaux impliqués dans la reconnaissance extracellulaire des signaux, ainsi que la compréhension des voies de signalisation engagées par les cellules pour répondre aux facteurs extracellulaires. Malgré ces nouvelles informations, les diverses interrelations moléculaires entre les acteurs ainsi que les voies de signalisation cellulaire, demeurent mal comprises. Le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permet la mesure d’interactions protéiques et peut être utilisé dans deux configurations, le BRET480-YFP (connu aussi comme le BRET1) et le BRET400-GFP (connu aussi en tant que BRET2). Suite à l’oxydation de son substrat, la luciférase de renilla peut transférer son énergie à une protéine fluorescente, uniquement si elles sont à proximité l’une de l’autre (≤100Å). La combinaison dans un seul essai des BRET480-YFP et BRET400-GFP, a permis de suivre trois paires d’interactions, sur une même population cellulaire. Par contre, l’utilisation de deux substrats pour la réaction de bioluminescence rend impossible la mesure simultanée des différents signaux de BRET, pour ce trois nouvelles configurations de BRET ont été mises au point en utilisant des nouvelles protéines fluorescentes. Ainsi deux des nouvelles couleurs de BRET ayant des émissions résolues, le BRET400-BFP et le BRET400mAmetrine ont pu être combinées pour mesurer l’engagement par un RCPG d’une protéine G, ainsi que l’accumulation du second messager. La combinaison de ces BRET a également permis de révéler la formation d’un complexe entre le récepteur α2A adrénergique (α2AAR), Gαi1, le dimère Gβγ ainsi que la kinase des récepteurs couplés aux protéines G (GRK2), suite à l’activation du récepteur. De plus, seule l’entrée de GRK2 semble être en mesure de causer la désensibilisation du α2AAR, en s’intercalant entre Gαi1 et Gβγ. Par contre, la stabilisation de l’interaction entre α2AAR et la β-arrestine2 semble nécessiter l’activité kinase de GRK2. Une autre étude a révélé l’importance de différentes Gα pour la mobilisation du calcium, suite à l’activation du récepteur aux opioïdes de type delta (DOR). Suite à la surexpression de Gα de la famille Gαq, il a été possible de mesurer une influence de ces Gα sur la mobilisation du calcium. Toutefois, cette réponse calcique mesurée en présence des Gαq demeure sensible aux prétraitements à la toxine de Bordetella pertussis, qui inhibe sélectivement l’activité des Gαi. De plus, la co-expression de Gαi et Gαq permet de potentialiser la mobilisation de calcium, démontrant une interrelation entre ces deux familles de protéine Gα, pour la signalisation du DOR. Afin de démontrer l’interrelation directe, des expériences de BRET ont été réalisées entre différentes Gα. En plus de montrer la formation de complexes sélectifs entre les Gα, les expériences de BRET réalisées en parallèle d’analyses de séquences de Gα, ont également mis à jour un site de sélectivité d’interaction entre les Gα, l’hélice α4. Suite à la transposition de cette hélice α4 de Gα12 sur Gαi1, qui normalement n’interagissent pas, il a été possible de forcer l’interaction entre Gα12 et Gαi1, confirmant ainsi que cette hélice α contient l’information permettant une sélectivité d’interaction. Au cours de cette thèse, il a été possible de générer de nouvelles méthodes de mesure d’interactions protéiques qui permettent de multiplexer différents signaux, ce qui a permis de mettre à jour de nouvelles interactions entre divers effecteurs de la signalisation de RCGP / Cellular communication is an important phenomenon for the maintenance of cellular homeostasis. Recently, important progress has been made in the cell signalling research field concerning the identification of the major actors and the cellular pathways engaged in response to these extracellular factors. However, in spite of this new information, the interrelationships at the molecular level between the various cellular actors and the different signalling pathways remain badly understood. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) monitors interactions between proteins and can be used in two configurations, the BRET480-YFP (also known as BRET1) and the BRET400-GFP (also known as BRET2). Following oxidation of its substrate, renilla luciferase transfers its energy to a fluorescent protein, only if they are in close proximity (≤100Å). By combining the BRET480-YFP and BRET400-GFP in one assay, it is possible to follow three pair-wise interactions in the same cellular population. However, using two bioluminescence reaction substrates limits the possibility of measuring the different BRET signals simultaneously. In order to measure multiple BRET signals simultaneously, three new BRET configurations, based on the BRET400-GFP, were developed using fluorescent proteins with different emission wavelengths. Two of the new BRET colors which have resolved emission wavelengths, the BRET400-BFP and BRET400mAmetrine, were combined for measuring the heterotrimeric G protein engagement by the vasopressin V2 receptor, as well as the accumulation of the second messenger. Combining these new BRET techniques reveals for the first time the formation of a complex between the α2A adrenergic receptor (α2AAR), Gαi1, the Gβγ dimer and G protein-receptor kinase (GRK2) following receptor activation. Moreover, only the entry of GRK2 into the receptor complex is required for the α2AAR desensitization, by inserting between Gαi1 and Gβγ. On the other hand, the stabilization of the interaction between α2AAR and β-arrestin2 requires the kinase activity of GRK2. Another study revealed the importance of multiple Gα subunits for calcium mobilization induced upon activation of the delta opioid receptor (DOR). Gαq subfamily member overexpression altered the DOR-induced calcium mobilization, but this Gαq calcium mobilization remained sensitive to pre-treatement pertussis toxin, through selective inhibition of the activity of Gαi members. Moreover, Gαi and Gαq co-expression potentiated calcium mobilization, suggesting an interrelationship between these two Gα families in DOR signaling. This Gαi and Gαq interrelationship could result from the formation of a complex close to the receptor. In order to test this hypothesis, BRET experiments were performed, with the aim of measuring the presence of complexes between different Gα. In addition to demonstrating complex formation between Gα subunits, the BRET experiments in parallel with sequence analysis, also revealed a selective interaction site between the Gα, the α4 helix. By swapping the a4 helix of Gαi with the α4 helix of Gα12, which doesn’t normally interact with Gα12, it was possible to force the interaction between Gα12 and Gαi to confirm that this α helix contains information concerning the selectivity of interactions between Gα subunits. During this thesis, new methods were to detect protein interactions and multiplexing these methods allowed the detection of novel interactions between signalling effectors of GPCRs.