T cells modified for expression of Chimeric Antigen Receptors (CARs) were the first genemodified cell products approved for use in cancer immunotherapy. CAR-T cells engineered with gammaretroviral or lentiviral vectors (RVs/LVs) targeting B-cell lymphomas and leukemias have shown excellent clinical efficacy and no malignant transformation due to insertional mutagenesis to date. Large-scale production of RVs/ LVs under good-manufacturing practices for CAR-T cell manufacturing has soared in recent years. However, manufacturing of RVs/LVs remains complex and costly, representing a logistical bottleneck for CAR-T cell production. Emerging gene-editing technologies are fostering a new paradigm in synthetic biology for the engineering and production of CAR-T cells. Firstly, the generation of the modular reagents utilized for gene editing with the CRISPR-Cas systems can be scaled-up with high precision under good manufacturing practices, are interchangeable and can be more sustainable in the long-run through the lower material costs. Secondly, gene editing exploits the precise insertion of CARs into defined genomic loci and allows combinatorial gene knock-ins and knock-outs with exciting and dynamic perspectives for T cell engineering to improve their therapeutic efficacy. Thirdly, allogeneic edited CAR-effector cells could eventually become available as “off-the-shelf” products. This review addresses important points to consider regarding the status quo, pending needs and perspectives for the forthright evolution from the viral towards gene editing developments for CAR-T cells.

The triggers for the development of multiple sclerosis (MS) have not been fully understood to date. One hypothesis proposes a viral etiology. Interestingly, viral proteins from human endogenous retroviruses (HERVs) may play a role in the pathogenesis of MS. Allelic variants of the HERV-K18 env gene represent a genetic risk factor for MS, and the envelope protein is considered to be an Epstein–Barr virus-trans-activated superantigen. To further specify a possible role for HERV-K18 in MS, the present study examined the immunogenicity of the purified surface unit (SU). HERV-K18(SU) induced envelope-specific plasma IgG in immunized mice and triggered proliferation of T cells isolated from these mice. It did not trigger phenotypic changes in a mouse model of experimental autoimmune encephalomyelitis. Further studies are needed to investigate the underlying mechanisms of HERV-K18 interaction with immune system regulators in more detail.

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Le premier membre de la famille des rétrovirus humains HTLV (Virus T-lymphotropique Humain), HTLV-1, a été découvert en 1980 et l’on estime aujourd’hui à plus de 10 millions le nombre d’individus infectés à travers le monde. Après une période de latence d’environ 40 ans, 5% des individus infectés développent des leucémies, des lymphomes adultes de lymphocytes T (ATLL) ou encore une myélopathie associée à HTLV-1/ paraparésie spastique tropicale (HAM/TSP). L’apparition de la maladie serait en grande partie orchestrée par deux protéines virales, soit Tax et HTLV-1 bZIP factor (HBZ). L’expression du génome viral se fait à partir d’un transcrit sens de pleine longueur suite à un épissage alternatif, à l’exception du gène HBZ. HBZ est produite à partir d’un transcrit antisens initié dans la séquence terminale longue répétée (LTR)’3. Elle a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en se dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. HBZ a aussi un pouvoir prolifératif et bien que nous ne sachions toujours pas le mécanisme moléculaire menant à l’oncogenèse par HBZ, nous savons qu’elle module une multitude de voies de transduction de signaux, dont AP-1. Nous avons récemment mis en évidence un transcrit antisens nommé Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) chez HTLV-2 qui n’est associé qu’à une myélopathie apparentée au HAM/TSP. Ce n’est qu’en 2005 que HTLV-3 et HTLV-4 se sont rajoutés au groupe HTLV. Cependant, aucune corrélation avec le développement d’une quelconque maladie n’a été montrée jusqu’à ce jour. Le premier volet de ce projet de doctorat avait pour objectif de détecter et caractériser les transcrits antisens produits par HTLV-3 et HTLV-4 et d’étudier les protéines traduites à partir de ces transcrits pour ainsi évaluer leurs similitudes et/ou différences avec HBZ et APH-2. Nos études de localisation cellulaire réalisées par microscopie confocale ont montré que APH-3 et APH-4 sont des protéines nucléaires, se retrouvant sous la forme de granules et, dans le cas d’APH-3, partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ. Les analyses à l’aide d’un gène rapporteur luciférase contenant le LTR 5’ de HTLV-1 ont montré que APH-3 et APH-4 peuvent aussi inhiber la transactivation du LTR 5’ par Tax. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur précédé d’un promoteur de collagénase (site AP-1), ont montré que ces deux protéines, contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants ont montré que le motif fermeture éclair (LZ) atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. En effet, APH-3 et APH-4 modulent la voie Jun-dépendante en se dimérisant via leur LZ atypique avec la famille Jun et semblent activer la voie par un mécanisme ne faisant pas par d’un domaine activateur autonome. Dans un deuxième volet, nous avions comme objectif d’approfondir nos connaissances sur la localisation nucléolaire de HBZ. Lors de nos analyses, nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction, B23 et la nucléoline, qui semblent être associés à sa localisation nucléolaire. En effet, ces interactions sont plus fortes suivant une délétion des domaines AD et bZIP de HBZ qui dans ce cas est localisée strictement au nucléole. De plus, bien que APH-3 et APH-4 puissent se localiser aux nucléoles, HBZ est la seule protéine traduite à partir d’un transcrit antisens pouvant interagir avec B23. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que HTLV-3 et HTLV-4 permettent la production de transcrits antisens comme chez d’autres rétrovirus. Les protéines traduites à partir de ces transcrits antisens jouent d’importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ au niveau de la régulation de la transcription de la voie Jun. HBZ semble aussi jouer un rôle unique dans le nucléole en ciblant les protéines nucléolaires de la cellule. Ces études démontrent que les protéines produites à partir de transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV partagent plusieurs ressemblances, mais démontrent aussi des différences. Ainsi, les APH pourraient, en tant qu’outil comparatif, aider à mieux cibler les mécanismes moléculaires importants utilisés par HBZ pour induire la pathogénèse associée à une infection par HTLV. / The first human T-cell lymphotropic virus (HTLV) family member was discovered in 1980 and it is estimated that approximately 10 million people are infected with HTLV-1 worldwide. After about 40 years, 5% of infected individuals will develop an adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) while another 4% will develop HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). It is believed that two viral proteins, Tax and HBZ, together orchestrate the oncogenic process. The viral proteins are expressed from an alternatively spliced sense transcript except for the HBZ gene. HBZ is translated from an antisense transcript initiated in the long terminal repeat (LTR)’3. This viral protein is capable of inhibiting Tax transactivation of the LTR5’ by dimerizing with cellular transcription factors such as CREB-2 and c-Jun. HBZ also has proliferating capacities and while the molecular mechanisms leading to the disease still need to be elucidated, it is well known that HBZ can modulate a multitude of signal transduction pathways like AP-1. We have recently discovered an antisense transcript termed Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) produced in HTLV-2. HTLV-2 is only associated to myelopathies resembling HAM/TSP. HTLV-3 and HTLV-4 were discovered in 2005 and have not been associated with any type of disease thus far. The first goal of this PhD project was hence to detect and characterize the antisense transcripts produced in HTLV-3 and HTLV-4, to study the functions of these translated proteins and to evaluate their similarities and/or differences shared with HBZ and APH-2. Our localization studies using confocal microscopy demonstrated that APH-3 and APH-4 are found in the nucleus as speckles, and for APH-3, also partially cytoplasmic. These two proteins can also partially colocalize with HBZ. Using a luciferase reporter plasmid bearing the HTLV-1 LTR5’, we demonstrated that APH-3 and APH-4 could inhibit Tax transactivation of the LTR5’. We also used a luciferase reporter plasmid bearing the collagenase promoter, which bears an AP-1 site, and demonstrated that both viral proteins could activate transcription in the presence of any of the Jun family of transcription factors. We generated several mutants and the atypical leucine zipper (LZ) found in APH-3 and APH-4 is crucial for this regulation. In fact, APH-3 and APH-4 using their atypical LZ dimerize with Jun family members and activate this pathway using a mechanism other than an autonomous activation domain. Our next goal was to investigate the significance of the HBZ nucleolar localization. During this project, we identified two new interacting partners, B23 and nucleolin, which seem to be associated with its nucleolar localization. In fact, these interactions are stronger when HBZ is deleted of its AD and bZIP domains and hence when HBZ demonstrates a stronger nucleolar distribution. Moreover, while APH-3 and APH-4 are also found in the nucleolus, HBZ is the only antisense protein able to interact with B23. Finally, this work clearly demonstrates that HTLV-3 and HTLV-4 can produce an antisense transcript alike other retroviruses. The encoded proteins play an important role in retroviral replication and seem to regulate Jun-dependant transcription differently than HBZ. HBZ also seems to have a unique role in the nucleoli by targeting specific cellular nucleolar proteins. Similarities but also differences are shared between the antisense proteins. Thus, the APH proteins represent a good comparative tool in order to better understand the molecular mechanisms involved in HTLV induced diseases.

L’herpèsvirus humain (HHV) 6 est un betaherpèsvirus largement répandu, associé à plusieurs maladies neuroinflammatoires, telles que des encéphalites ou la sclérose en plaques (SEP). Cependant, les mécanismes impliqués dans la neuropathologie induite par les deux espèces d’HHV-6, HHV-6A et HHV-B, sont peu connus. De plus, l’absence de modèle d’infection chez le petit animal a ralenti l’étude de la pathogénèse virale. Dans ce contexte, nous avons développé un modèle d’infection par HHV-6 chez des souris transgéniques, qui expriment la protéine CD46 humaine, identifiée comme récepteur cellulaire pour HHV-6. Nous avons pu démontrer une persistance de l’ADN viral d’HHV-6A, mais pas d’HHV-6B, dans le cerveau de souris transgéniques pendant plusieurs mois. De plus nos résultats montrent qu’HHV-6A induit la sécrétion de chimiokines pro-inflammatoires par les cellules neurales murines et provoque l’infiltration de cellules immunitaires dans le cerveau de souris infectées. Enfin, HHV-6A, mais pas HHV-6B, pourrait induire des réponses cellulaires chez les cellules murines via le récepteur de l’immunité innée TLR9 (toll-like receptor 9). En collaboration avec une équipe de Grenoble, nous avons ensuite montré que l’infection par HHV-6A induit l’expression de rétrovirus endogènes humains (HERV) dans des cellules mononuclées et des lignées neurales humaines. Ces HERV, en particulier leurs protéines d’enveloppe qui présentent des propriétés pro-inflammatoires, sont associés à diverses maladies autoimmunes dont la SEP. HHV-6A pourrait donc participer au développement de pathologies inflammatoires via l’induction de ces HERV. L’ensemble de ces travaux supporte ainsi l’existence d’un lien entre l’infection par HHV-6A et la neuroinflammation, et apporte de nouvelles pistes quant aux mécanismes potentiellement impliqués. / Human herpesvirus (HHV) 6 is a widely spread betaherpesvirus, which has been associated to several neuroinflammatory diseases, such as encephalitis or multiple sclerosis (MS). However, the mechanisms explaining the neuropathology induced by the two species of HHV-6, HHV-6A and HHV-6B, remain to be elucidated. Moreover, the lack of small animal model for HHV-6 infection has considerably hampered the study of viral pathogenesis. In this context, we have generated several lines of mice expressing the human CD46 protein, identified as a cellular receptor for HHV-6, and characterized the infection. We demonstrated that DNA of HHV-6A, but not HHV-6B, can persist in the brain of CD46 transgenic mice for several months after intracranial injection. Moreover our results show that HHV-6A induces chemokine secretion by in vitro cultured murine brain cells and provokes leucocyte infiltration in the brain of infected mice. Finally, HHV-6A, but not HHV-6B, could activate cellular responses in murine cells through binding to toll-like receptor 9. In collaboration with the team of P. Marche in Grenoble, we then showed that HHV-6A and HHV-6B infection induce the expression of envelope genes from human endogenous retrovirus W (HERV-W) in human blood mononucleated cells and human neural cell lines. Envelope proteins of HERV-W are known to exhibit strong pro-inflammatory properties and were associated to various autoimmune diseases, including multiple sclerosis. HHV-6A and HHV-6B could therefore participate in the development of inflammatory disorders via the activation of these HERV genes. Altogether this work supports the hypothesis of a link between HHV-6 infection neuroinflammation and opens new perspectives in the study of the mechanisms potentially involved.

The expression of retroviral genes depends on the establishment of the provirus - the DNA copy of retroviral genome integrated into the host genome. The transcriptional state of provirus is then influenced by the environment at the site of integration. The phenomenon of proviral silencing is an obstacle to the usage of retroviral vectors and a barrier to the eradication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) from infected individuals. Taking advantage of single cell clones bearing one provirus, this diploma thesis investigates the distribution of (epi)genomic features at the sites occupied by stably expressed proviruses. In total, long-term expression profiles of 245 and 255 clones carrying avian sarcoma-leucosis virus (ASLV) and HIV-1, respectively, were obtained. The database-based analysis of 42 integration sites of ASLV and three integration sites of HIV-1 proviruses shows that proviral stable expression highly correlates with the transcriptional start sites (TSS) at the sites of integration. Histone marks characteristic for the proximity of active TSSs and regulatory elements at the sites of integration of stably expressed proviruses confirm this finding. The results presented in this thesis could inspire other analyses investigating the relationship between the integration site and the...

Les études des interactions entre cellules hôtes et rétrovirus ont conduit à définir le concept de restriction virale dont les facteurs constituent une part de l'immunité innée des cellules hôtes. Ces facteurs contribuent au contrôle des rétrovirus endogènes (ERV) dont l'émergence peut être associée à certaines pathologies telles que des leucémies ou des immunodéficiences. Chez le porc, certains ERV (PERV) sont réplicatifs, pourtant aucune pathologie ne leur a, à ce jour, été associée. Les mécanismes de restriction virale impliqués dans ce phénomène ont fait l'objet de nombreuses études. Elles n'ont cependant concerné que certains facteurs. Les protéines porcines à motif tripartite (poTRIM) n'ont ainsi fait l'objet que de peu d'études. Pourtant, de nombreux membres de cette famille participent à la restriction virale chez d'autres organismes que le porc. La présente étude s'intéresse par conséquent aux orthologues porcins de ces protéines et à leur relation avec les PERV. L'élaboration d'une stratégie d'expression de ces protéines dans un modèle humain, sensible à l'infection par le PERV nous a permis d'évaluer et de caractériser les effets des TRIM sur le cycle infectieux du PERV. Cette stratégie a mis en évidence une activité de restriction par TRIM8 tandis que TRIM44 semble au contraire agir en faveur de la réplication virale. En ce qui concerne poTRIM11, elle favorise l'entrée du PERV tout en inhibant son expression. L'étude a également confirmé l'insensibilité du PERV vis-à-vis de poTRIM5α. L'ensemble de ces résultats contribuent à la compréhension de la relation entre la réplication des PERV et le contrôle mené par son hôte. / From studies of pathogens and their host interaction has emerged the concept of viral restriction considered to be part of an innate immune system. These factors contribute to the control of endogenous retroviruses (ERV) whose emergence may be associated with several diseases such as leukemia or immunodeficiency. Three subgroups of the porcine ERV-γ-1 group (PERV) are replicative. Nevertheless, these PERVs are not associated with any pathology in the pig. Several studies have been performed on viral restriction mechanism capabilities of the pig but these covered a very limited number of restriction factors. Regarding the porcine tripartite motif-containing (poTRIM) proteins, knowledge is weak although several members of this family have proved to be implicated in the viral restriction of other species. The purpose of this study is to investigate the relationship between these orthologous poTRIMs proteins and replicating PERVs. In order to explore this potential interaction, a TRIM protein expressing model in human cells, known to be sensitive to the PERV infection, has been developed. It has enabled us to assess and characterize potential TRIMs effects on the PERV infection cycle. We equally identified poTRIM8 as a restriction factor. Conversely, poTRIM44 seems to act as an enhancer of the PERV infection, while, TRIM11 displayed ambiguous effects including an enhancer effect of the early infectious stages and an inhibitor activity of the late infectious stages. In this study, we also confirmed the PERV insensitivity to the porcine TRIM5α protein. Finally, this work aims at contributing to the understanding of the relationship between PERV replication and their control leading by the host cells.