Toxoplasma gondii, protozoaire intracellulaire obligatoire, est l’agent responsable de la toxoplasmose, infection qui revêt un caractère sévère au cours de toxoplasmoses cérébrales ou congénitales en médecines humaine et vétérinaire. Aucun vaccin n’est actuellement disponible ; le développement de stratégies vaccinales efficaces est donc d’actualité. Le potentiel vaccinant de deux protéines de rhoptries de T. gondii, RON4 et ROP18, protéines injectées dans la cellule au site de l’invasion lors de l’étape d’attachement à la cellule, a été évalué dans deux stratégies vaccinales contre la toxoplasmose chronique chez la souris: vaccination ADN par voie intramusculaire et vaccination par voie nasale avec des protéines recombinantes. L’immunisation avec des plasmides optimisés exprimant RON4, la partie N-terminale ou la partie C-terminale de RON4 co-administrés avec un plasmide exprimant l’adjuvant GM-CSF ou l’immunisation par voie nasale avec une protéine recombinante RON4 associée à la toxine cholérique, induit des réponses systémiques humorale et cellulaire (mixte Th1/Th2) mais ne confère pas de protection. Dans nos conditions expérimentales RON4 n’est pas un candidat vaccin potentiel. Des stratégies pour augmenter son immunogénicité par voie nasale et pour orienter la réponse cellulaire vers un profil Th1 pourraient cependant être envisagées. L’immunisation avec des plasmides bicistroniques exprimant à la fois ROP18 sous forme sécrétée et le GM-CSF ou ROP18 cytosolique et le GM-CSF, induit des réponses humorales et cellulaires (Th1) similaires et ne confère pas de protection significative. La co-administration d’un plasmide exprimant l’IL-12 n’augmente pas les réponses immunes avant infection mais a néanmoins contribué à augmenter la réponse cellulaire après infection. L’immunisation par voie nasale avec une protéine recombinante ROP18 associée à la toxine cholérique, induit une réponse systémique humorale (Th1/Th2) et confère une protection significative (réduction de la charge parasitaire de 50%). La co-administration de l’adjuvant poly I:C augmente la réponse cellulaire mais n’a pas d’effet sur la protection. Nos résultats suggèrent que ROP18 est un candidat vaccin potentiel, des stratégies pour améliorer son effet protecteur sont à envisager. / Toxoplasma gondii, an obligate intracellular protozoan, is the etiologic agent of toxoplasmosis. This infection has severe consequences during cerebral or congenital toxoplasmosis both in human and veterinary medicines. No vaccine is currently available, so the design of efficient vaccine strategies is still a topical question. In this study, RON4 and ROP18, two rhoptry proteins of T. gondii which are discharged into the host cell at the invasion site, immediately following intimate contact with the host cell, were evaluated in two vaccine strategies against chronic infection in mice: DNA vaccination by the intramuscular route and recombinant protein vaccination by the nasal route. DNA immunization with optimized plasmids encoding full length RON4, or only the N-terminal, or the C-terminal part of RON4 plus a plasmid encoding the adjuvant GM-CSF or nasal immunization with a recombinant RON4 protein plus cholera toxin induced systemic humoral and cellular responses (mixed Th1/Th2) but failed to confer protection. Strategies intended to enhance the immunogenicity of RON4 by the nasal route and to enhance the Th1 immune response against RON4 could be more effective.DNA immunization with ROP18 expressed as a secreted or a cytosolic form by bicistronic vectors which encode both the antigen and the adjuvant GM-CSF induced similar humoral and cellular (Th1) responses but did not confer significant protection. Co-administration of a plasmid encoding the adjuvant IL-12 did not enhance the immune responses before challenge but was able to prime a cellular immune response that was boosted by the parasite infection. Nasal immunization with a recombinant ROP18 protein plus cholera toxin induced systemic humoral responses (mixed Th1/Th2) and conferred partial protection (50% brain cysts reduction). Co-administration of the adjuvant poly I:C enhanced the cellular response but did not potentiate the protection. Our data suggest that ROP18 is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis. Strategies to improve the protective effect of ROP18 should be investigated.

Toxoplasma gondii est un protiste apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Ce parasite intracellulaire obligatoire possède des organites sécrétoires apicaux dont les rhoptries qui contiennent des facteurs de virulence essentiels à l'invasion et à la modulation de la cellule hôte qu'il infecte. Au cours de la division cellulaire de T. gondii, les protéines de rhoptries sont synthétisées selon la même cinétique. Dans le but d'identifier de nouvelles protéines dont la fonction est potentiellement liée aux rhoptries, nous avons recherché à partir des bases de données du génome de T. gondii, les protéines présentant ce profil particulier d'expression. La localisation subcellulaire de 12 candidats a été réalisée puis une caractérisation phénotypique de quatre d'entre eux a été entreprise. Nous avons identifié une nouvelle protéase de rhoptries, DegP, essentielle à la virulence du parasite in vivo. Nous montrons que DegP contrôle la phase aigüe de l'infection en modulant la réponse immune de l'hôte contribuant ainsi à la dissémination du parasite in vivo. Nous identifions également deux protéines homologues, Claw1 et Claw2, présentant une localisation atypique à l'extrémité apicale du parasite. Notre incapacité à déléter ces gènes pourrait indiquer un rôle essentiel de ces protéines au niveau du complexe apical de T. gondii. Enfin, bien que n'étant pas reliée aux rhoptries, ce crible a permis d'identifier la première protéine associée aux jonctions des vésicules constituant le complexe membranaire interne de Toxoplasma. La délétion de cette protéine, SIP, affecte la forme du parasite, entrainant un défaut de motilité, d'invasion et de virulence in vivo. / Toxoplasma gondii is an apicomplexan protist and the causative agent of toxoplasmosis. This obligate intracellular parasite harbors apical secretory organelles such as rhoptries that contain essential virulence factors responsible of the invasion and the modulation of the infected host cell. Along the cell cycle of T. gondii, rhoptry proteins share the same timing of expression. In order to identify new proteins involve in rhoptry content, biogenesis or secretion, we screened the genome database of T. gondii to isolate proteins that present this particular profile. We obtained the subcellular localization of 12 candidates and we investigated the biological functions for 4 of them. We showed that DegP, a rhoptry protease is essential for the in vivo virulence of T. gondii. DegP controls the acute phase during infection and modulate the host immune response leading to better parasite dissemination in vivo. Also, we identified Claw1 and its paralog Claw2 that present an atypical localization at the apical end of the parasite. To date, we were unable to disrupt the genes encoding these proteins suggesting that they may have an essential function related to the apical complex in T. gondii. Finally, we also examined a ‘hit' of this screening that was not related to rhoptries and we identified SIP, the first protein associated with the transversal junctions of the inner membrane complex in T. gondii. The disruption of SIP affects the shape of the parasite leading to an aberrant motility, defect in invasion and impaired parasite virulence in mice.