A DNA double-strand break (DSB) is a severe form of DNA damage. In fastgrowing cells, DSBs are commonly repaired by homologous recombination (HR) and in E. coli they are exclusively repaired by this mechanism. Failure to accurately repair DSBs can lead to genomic instability. Characterising the DNA intermediates formed during DSB repair by HR is key to understanding this process. A system for inducing a site-specific DSB in the E. coli chromosome has previously been described (Eykelenboom et al., 2008). Here, this system has been used to determine the nature of the intermediates of the repair. It was shown that in a Rec+ background the repair process is rapid and efficient. By contrast, in a ruvAB mutant, which is defective for the Holliday junction (HJ) migration and cleavage complex, RuvABC, HJs are accumulated on both sides of the breakpoint. Replication forks also accumulate at defined positions from the DSB, indicating that unresolved HJs are a barrier to efficient replication that is associated with the repair. This suggests that the resolution of HJs needs to occur prior to the establishment of DNA synthesis. Despite the accumulation of HJs in a ruvAB mutant, cell survival occurs when DSBs are induced for short periods, suggesting that HJs can be resolved in a RuvAB-independent manner. In contrast, the RecG helicase is essential for survival. In a recG mutant, replication forks but not HJs are detected in the region of DSB repair. In a ruvAB recG mutant, intermediates in this region are lost. These observations are consistent with a role of RecG in the stabilisation and maturation of D-loops and not the resolution of Holliday junctions. Nevertheless, an additional role for RecG in later stages of repair cannot yet be excluded. This work provides a solid framework for the further study of DSB repair in E. coli.

Ce travail présente tout d'abord l'étude, à l'échelle de la molécule individuelle, de l'intermédiaire<br />de recombinaison formé par l'échange de simples brins entre deux molécules d'ADN homologues : la<br />jonction de Holliday.<br />Nous montrons tout d'abord qu'il est possible, à partir d'un ADN portant une séquence entièrement<br />palindromique, de former une jonction de Holliday en appliquant une torsion négative. Une fois<br />la jonction formée, la torsion permet également de contrôler de façon directe l'échange des simples brins.<br />Cette technique nous a permis d'accéder expérimentalement, avec une très bonne précision, à la valeur<br />en solution du pas hélicoïdal de l'ADN : 3.61 ± 0.03 nm/tr.<br />Ensuite nous avons étudié, en présence d'ions magnésium, la cinétique de migration de la jonction<br />de Holliday sous l'influence des contraintes mécaniques. Une modélisation simple du comportement<br />de la jonction de Holliday vis-à-vis des contraintes mécaniques a été développée permettant d'expliquer<br />leur influence sur le mécanisme de migration.<br />L'échange des simples brins peut également être catalysé par certaines enzymes. Le travail<br />mécanique développé au cours de cette activité catalytique fait de ces enzymes des moteurs moléculaires.<br />La seconde partie de ce travail porte sur l'étude en molécule unique d'un tel moteur : le complexe RuvAB<br />de la bactérie Escherichia coli.<br />Nous avons tout d'abord caractérisé la migration de jonctions de Holliday individuelles sous<br />l'action du complexe RuvAB. Nous avons notamment montré la très grande processivité du complexe et<br />nous avons pu estimer la vitesse de migration à 37◦C et en présence d'1 mM d'ATP : ∼ 43 paires de<br />bases échangées par seconde.<br />D'autre part, et pour finir, nous avons mis en évidence le rôle catalytique de la sous-unité RuvA<br />dans l'échange des paires de bases au niveau du point de branchement.