Sémaphorine 7A est une molécule de guidage axonal pour les neurones dopaminergiques en développement. Elle permet de ségréguer les neurones de la voie nigrostriée et mésolimbique. Nous montrons dans cette étude qu’elle participe également à l’organisation de la voie mésocorticale. L’effet chémorépulsif de la molécule Sémaphorine 7A se fait via sa liaison avec le récepteur membranaire PlexinC1, présent tout au long du développement embryonnaire dans les neurones de l’aire tegmentale ventral. Il se manifeste in vitro par une modulation morphologique du cône de croissance, ainsi qu’une réduction de l’arborisation dendritique. Les kinases de la famille des Src sont les médiatrices de ces effets. En forçant leur inactivation, on peut empêcher l’apparition des effets chémorépulsifs de Sémaphorine 7A. Il est intéressant de noter que les kinases de la famille des Src sont également activées in vivo dans les cônes de croissance de neurones dopaminergiques en développement. La liaison de Sémaphorine 7A à PlexinC1 mène aussi à une inactivation de la protéine de liaison à l’actine cofiline. L’identification de cet acteur moléculaire permet de faire un lien entre l’activation du récepteur et la modulation subséquente du cytosquelette, une étape essentielle afin de médier le mouvement du cône de croissance. En somme, cette étude permet de mettre en évidence certains mécanismes moléculaires agissant au niveau du cône de croissance, et dont l’effet est nécessaire au guidage des neurones dopaminergiques par Sémaphorine7A. / Semaphorin7A is an important axon guidance molecule for developing dopaminergic neurons. It allows to segregate the neurons of the nigrostriate and mesolimbic pathway. In this study, we bring to light its role in the organization of the mesocortical pathway. The chemorepulsive effect of Semaphorin 7A occur via its binding with the PlexinC1 membrane receptor, present throughout embryonic development in the neurons form the Ventral Tegmental Area. These effects include, in vitro a morphological modulation of the growth cone, as well as a reduction of the dendritic arborization. Src family kinases mediate these effects and when inactivated, they prevent both chemorepulsion and growth cone morphology changes induced by Séma7A. Interestingly, Src family kinases are also activated in vivo in growth cones of developing dopaminergic neurons. The binding of Séma7A to PlexinC1 also leads to inactivation of the actin binding protein cofilin. The identificatio; n of this molecular actor links the activation of the receptor and the subsequent modulation of the cytoskeleton, an essential step in order to mediate the movement of the growth cone. In sum, this study reveals the molecular mechanisms acting at the level of the growth cone in midbrain dopaminergic neurons during axonal guidance by Semaphorin7A.

Au cours de la mitose, la ségrégation des chromatides, la partition du matériel cytoplasmique entre cellules filles et leur position relative se fait selon un plan qui est préfiguré par la plaque métaphasique. Ainsi, l'orientation de ce plan est un processus crucial pour le contrôle du destin des cellules, pour la morphogenèse durant l'embryogenèse et pour l'homéostasie tissulaire. Jusqu'à aujourd'hui, les mécanismes intrinsèques impliqués dans le positionnement du plan de division ont reçu beaucoup d'attention. En revanche, peu d'études ont exploré l'implication de signaux extracellulaires dans l'orientation du plan de division. Pourtant, l'axe des divisions cellulaires dont la position est souvent stéréotypée est largement associé aux axes de polarités du tissu. Au cours de ma thèse, je me suis demandé si des signaux extracellulaires capables de délivrer des informations de position spatiale aux cellules dans le cadre de leur migration, de leur différenciation morphologique, ou de leur polarisation, pouvaient influencer l'orientation des divisions cellulaires. En particulier, je me suis intéressée aux facteurs impliqués dans le guidage axonal à travers l'étude des mitoses des progéniteurs neuraux chez l'embryon de souris. Dans la moelle épinière en développement, les progéniteurs neuraux effectuent leur division au contact du canal central, lequel renferme le liquide céphalo-rachidien (LCR), une source de nombreux facteurs extracellulaires comme les morphogènes. Nous avons montré que la présence de molécules du LCR était nécessaire pour une orientation appropriée du plan de divisions des progéniteurs neuraux localisés au contact du canal central. Priver les progéniteurs neuraux de LCR par l'ouverture du tube neural ou provoquer génétiquement l'obstruction du canal central affecte les proportions de divisions planaires et obliques. Nous avons identifié la protéine Sémaphorine 3B, secrétée par les cellules de la plaque du plancher et les plexus choroïdes, comme un signal extrinsèque contrôlant l'orientation des divisions des progéniteurs neuraux dans la moelle épinière. L'invalidation génétique de Sema3B chez la souris phénocopie la perte d'accès au LCR des progéniteurs. Une application exogène de Sema3B sur des embryons dont le tube neural a été ouvert compense la déficience de LCR. Nous avons pu montrer que Sema3B se lie à ses récepteurs Neuropilines à la surface apicale des progéniteurs mitotiques et agit sur l'architecture des microtubules via l'activation de la voie GSK3/CRMP2, voie initialement mise en évidence dans le contexte du guidage axonal. Afin d'identifier de nouveaux facteurs influençant le positionnement du fuseau mitotique en réponse à ce facteur de guidage, une analyse transcriptomique des progéniteurs neuraux des mutants Sema3B-/- a été réalisée et des gènes candidats dérégulés en contexte d'invalidation de Sema3B ont été considérés. Durant la seconde partie de ma thèse, j'ai exploré l'implication du gène Norbin/Neurochondrin. De manière intéressante, le knock- down de Norbin dans les cellules HeLa altère l'orientation du fuseau mitotique. L'ensemble de ces travaux révèle donc la contribution d'une large famille de signaux topographiques jusqu'à présent inexplorée, dans l'orientation des divisions cellulaires et ouvre un large champ d'investigation passionnant concernant leur action moléculaire et cellulaire dans la neurogenèse et la morphogenèse / During development, the orientation of cell division is crucial to correctly organize andshape tissues and organs and also to generate cellular diversity. As cell mitosis proceeds, thesegregation of chromatids and cytoplasmic material occurs along a division axis. Itsorientation largely determines the relative position of daughter cells and the partition ofmother cell subcellular domain between them. The orientation of the cell division isprefigured by the position of a complex microtubule-based scaffold, the mitotic spindle.Until now, the intrinsic molecular machinery positioning the mitotic spindle and its couplingto cell polarities have been study in details. In contrast, the contribution of extracellularsignals to cell division orientation is less characterised. My research shows that these signalsin the CSF contribute to the orientation of cell division in neural progenitors. Removal theCSF cues by opening the neural tube or by genetic engineering affects the proportion ofplanar and oblique divisions. We identified Semaphorin 3B (Sema3B), released from thefloor plate and the nascent choroid plexus, as an important actor in this extrinsic control ofprogenitor division. Knockout of Sema3B phenocopies the loss of progenitor access to CSF.Delivery of exogenous Sema3B to progenitors in living embryos compensates this deficiency.We showed that Sema3B binds to Neuropilin receptors at the apical surface of mitoticprogenitors and exerts its effect through GSK3b activation and subsequent inhibition of themicrotubule stabilizer CRMP2. Thus extrinsic signaling mediated by Semaphorins directs theorientation of progenitor division in neurogenic zones.In order to identify new factors implicated in Sema3B-dependant mitotic spindleposition, we performed a transcriptomic analysis of Sema3B -/- neural progenitors. Severalderegulated candidate genes were considered. In the second part of my thesis, I focus onone of this, Norbin/Neurochondrin. Interestingly, the invalidation of Norbin/Neurochondrinalters the orientation of the mitotic spindle in HeLa cells.My PhD work reveals the contribution of a large family of topographic cues known tofunction in axon guidance has a novel role in the orientation of cell division

L’acquisition de la fertilité chez les mammifères est le résultat d’un long processus de développement et de maturation de l’axe gonadotrope. Cette fonction cruciale à la survie des espèces est orchestrée par une poignée de cellules localisées au niveau de l’aire préoptique hypothalamique chez le rongeur, sécrétant la gonadotropin-releasing hormon (GnRH). La GnRH stimule la sécrétion de LH et de FSH par l’adénohypophyse, qui stimulent à leur tour les gonades. Les cellules à GnRH naissent dans l’épithélium voméronasal pendant le développement embryonnaire et migrent le long des axones voméronasaux pour atteindre l’hypothalamus. A la naissance le système est entièrement en place, toutefois il subira une phase de maturation avant d’atteindre la puberté, signant le début de la fertilité. Chez l’homme, un défaut de sécrétion de GnRH peut conduire à un hypogonadisme hypogonadotrope idiopathique (IHH) caractérisé par une subfertilité et une puberté retardée voire absente, ou même à un syndrome de Kallmann. Dans une grande partie des cas ce défaut de sécrétion est lié à un défaut de développement prénatal et à une diminution du nombre de neurones à GnRH dans dans l’hypothalamus. Depuis peu, la grande famille des semaphorines, déjà connues pour leurs effets chimiotactiques dans certains types cellulaires, et en particulier la semaphorine3A (Sema3A) via son récepteur la Neuropilin-1 (Nrp1), a été décrite comme un facteur indispensable au développement du système à GnRH et décrit comme un « gène Kallmann ». Toutefois son rôle spécifique dans les cellules à GnRH reste à élucider. Le premier objectif de ma thèse a donc été de déterminer le rôle de l’expression du récepteur Nrp1 dans les neurones à GnRH. Le suivi de la maturation sexuelle des animaux Gnrh::cre, Nrp1loxp/loxp (qui n’expriment pas la Nrp1 exclusivement dans les neurones à GnRH) a révélé l’apparition d’une puberté précoce et d’un phénotype de surpoids en comparaison aux animaux contrôles, corrélé à une accumulation des cellules à GnRH dans l’aire préoptique. L’étude de l’embryogenèse du système à GnRH chez ces animaux a démontré une augmentation du nombre de cellules à GnRH pendant leur migration. Nos résultats obtenus in vivo et in vitro suggèrent que la signalisation Nrp1 a un impact sur la survie des neurones à GnRH, et qu’elle module la motilité des cellules en migration et influe leur positionnement dans le cerveau. Le deuxième objectif de ma thèse a été d’étudier le rôle de l’exocytose dépendante du calcium et donc de la neurosécrétion dans les neurones à GnRH sur leur développement. Le suivi de la physiologie d’animaux Gnrh::cre; iBot, dont l’exocytose dépendante du calcium est abolit par clivage de protéine VAMP2/synaptobrevin 2 dans le neurone à GnRH, a révélé l’apparition de deux phénotypes distincts selon la pénétrance du transgène : un groupe ayant une puberté normale et un poids comparable aux animaux contrôles, et un groupe ayant une puberté retardée voire inexistante associé à un surpoids. Ces derniers présentent un IHH, une augmentation du tissu adipeux périgonadique et une hyperleptinémie, alors que la distribution des neurones à GnRH dans le cerveau n’est pas altérée. Ces données mettent en évidence le fait que l’activité de neurosécrétion dans les neurones à GnRH ne serait pas nécessaire pour leur développement embryonnaire, mais qu’elle pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique.Ces deux études mettent en avant un lien étroit entre axe gonadotrope et métabolisme énergétique chez les mammifères et ont dévoilés de nouveaux mécanismes qui pourraient être impliqués dans la physiopathologie de la reproduction chez l’homme. / Fertility in mammals is the result of a long development and maturation process of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The reproductive function is orchestrated by a small population of neurons, located in preoptic area of hypothalamus in rodents, and releasing in a pulsatile manner Gonadotropin-releasing hormon (GnRH) in the portal blood vessels, where it is transported to the anterior pituitary gland. GnRH neuropeptide triggers synthesis and release of the gonadotropins LH and FSH, which in turn stimulates development and function of the gonads. GnRH neurons differenciate extracerebraly in the nasal placode and migrate from the vomeronasal organ to the forebrain along olfactory/vomeronasal nerves. At birth, the system is ready, however it will undergo a maturation phase before reaching puberty, signing the beginning of fertility. Deficiency in GnRH release can lead to idiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH), characterized by a defect in sexual maturation and delayed or no puberty, or even to Kallmann syndrome when the IHH is associated with a deficit in the sens of smell. These phenotypes could be linked to a defect during GnRH neuron migration period and a decrease of GnRH cells located in hypothalamus after birth. Numerous studies have described the influence of different molecules on the migration of GnRH neurons. Recently, the semaphorin family, well known for its chemotactic effects in some cell types, and particularly the semaphorin3A (Sema3A), has been described by our laboratory as an essential factor for the guidance of GnRH neurons during embryogenesis, and characterized as a « Kallmann gene ». However, the role of Sema3A, and its specific receptor Neuropilin-1 (Nrp1) in GnRH neurons remains to be elucidated. The first objective of my thesis was to determine the role of the expression of Nrp1 in GnRH neurons. The analysis of sexual maturation in mice in which Nrp1 expression was selectively knocked out in GnRH neurons revealed a precocious onset of puberty and overweight compared to control littermates, correlated with an accumulation of GnRH neurons in preoptic area. The study of the development of the GnRH system during embryogenesis has shown an increased number of cells during migration. In vivo and in vitro data suggested the involvement of Nrp1 signaling pathway in the survival of GnRH neurons, the control of their motility during migration, and their final positioning in the brain.The second objective of my thesis was to study the role of Calcium-dependent exocytosis, and thus neurosecretion, in GnRH neurons on their development. The monitoring of Gnrh::cre; iBot animals, in which calcium-dependent exocytosis is abolished by cleavage of VAMP2/synaptobrevin2 protein in GnRH neurons, showed the distinction of two different phenotypes. A subpopulation of mice underwent normal puberty onset, with a similar bodyweight than control littermates, and the other one never reached puberty and developed overweight. The later animals exihibited IHH, increase of the volume of perigonadic fat tissue, and hyperleptinemia, with no alteration of GnRH neuron number and distribution. This data established that neurosecretion in GnRH neurons is not a prerequisite for their migration during embryonic development but revealed that it could play an important role in metabolic homeostasis.Together these two studies highlight an intriguing direct connection between GnRH neurons and energy metabolism in mammals as well as new mechanisms that could be implicated in reproductive physiopathology in human.

Les Sémaphorines de classe 3 modulent de nombreux comportement neuritiques lors de la formation du système nerveux central. Leur liaison sur des complexes récepteurs composés de la sous unité obligatoire de liaison au ligand, les Neuropilines1,2 (Nrp1,2) et de la sous unité de signalisation, les PléxinesA1-4, permet d'assurer la spécificité fonctionnelle. Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant la formation de ces complexes récepteurs ne sont pas connus. Au cours de ma thèse, j'ai étudié l'assemblage des complexes récepteurs des Sémaphorines de classe 3 par une approche FRET. J'ai pu montrer que Nrp1,2 forment des homo et hétéro-oligomères à la membrane plasmique. Nrp1 peut former des hétero-oligomères avec les PléxinesA1,2 et 4 mais apparemment pas avec PléxineA3. La délétion du domaine Séma de PléxineA3 (PléxinesA3∆sem) suffit pour induire la formation d'hétéro-complexes Nrp1-PléxinesA3∆sem. Ces résultats suggèrent que le domaine Séma de PléxineA3 adopte une conformation différente des autres PléxinesA et empêche l'interaction entre PléxineA3 et Nrp1. De plus, toutes les PléxinesA peuvent former des homo-oligomères de manière indépendante du domaine Séma. Ces résultats suggèrent que les récepteurs des Sémaphorines de classe 3 pourraient former des complexes oligomériques plus important, composés d'homo-dimères de Nrps et de PléxinesA. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai étudié la spécificité de signalisation des PléxinesA dans les interneurones GABAergiques du cervelet. Au laboratoire, nous avons montré que Séma3A induit la formation de branches des interneurones GABAergiques du cervelet par l'intermédiaire de Fyn. Mais l'identité des complexes récepteurs Séma3A impliquée dans ce processus n'était pas connue. Nous avons montré que les interneurones GABAergiques expriment PléxineA1,A2 A3 mais pas A4. Alors que les PléxinesA1,2 et 3 interagissent avec la protéine Fyn, seule l'activation des voies de signalisation de PléxineA1 et A2 induit la formation de branches in vitro. De manière intéressante, Fyn interagit avec les PléxinesA1 et A2 via son domaine SH3 alors qu'elle utilise son domaine SH2 pour l'interaction avec PléxineA3, suggérant l'importance du mode d'interaction de Fyn avec les PléxinesA pour sa fonction. Enfin nous avons pu montrer que PléxineA1 est la seule Pléxine in vivo capable d'induire un défaut de formation de branches des interneurones GABAergiques du cervelet. / Secreted class 3 Semaphorin (Sema3) modulates a wide variety of axon behavior during central nervous system formation. Sema3 family functions are triggered through binding to specific receptor complexes that include the obligate binding subunit Neuropilins-1 and 2 (Nrp1-2) and the signalling subunit plexin-A1-4. Yet, the exact mechanism controlling Sema3 receptor complex formation is not known. Here, we investigate Sema3 cell surface receptor formation using a time resolved FRET approach. We showed that Nrp-1 and 2 formed homo and hetero-oligomers at the cell surface of leaving cells. Nrp-1 can form hetero-oligomers with PlexinA1, A2 and A4 but not with PlexinA3. Deletion of the Plexin-Sema domain of PlexinA3 (PlexinA3∆sem) induced the formation of Nrp1 and PexinA3∆sem hetero-complexes. These results showed that PlexinA3-sema domain adopts a different conformation from the other PlexinAs and inhibited the interaction with Nrp1. Furthermore, PlexinAs can form homo-oligomers independently of the Plexin-Sema domain. These results further suggest that Sema3 receptors could form higher oligomeric complex that include homodimers of both neuropilins and PlexinAs. Understanding the basic principles of Sema3 receptor assembly will be pivotal to decipher how ligand binding translates into specific pathways of cellular signaling. In the second part of my thesis we investigated PlexinA specific signaling in cerebellar GABAergic interneurons. Sema3A induced GABAergic axonal branching in cerebellar cortex in a Fyn dependent manner (Cioni et al.,2013). However the identity of Sema3A receptor complexes involved in this process needed further investigation. We showed that PlexinA1, A2 and A3, but not PlexinA4, are expressed in GABAergic interneurons. While PlexinA1-3 are associated with FYN, only PlexinA1 and A2 induced axon branching. Interestingly, Fyn interaction with PlexinA1 and A2 is mediated via the SH3 domain while the interaction with PlexinA3 is through the SH2 domain, suggesting that the binding mode of Fyn to PlexinA is important. These results were further supported by in vivo characterization of PlexinA1-4 deficient mice that showed GABAergic axon branch deficit only in PlexinA1 mutant.