La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

Résumé : Dans la sclérodermie systémique (ScS), les contractures aux mains, pour lesquelles il n'existe aucun traitement prouvé, sont courantes et associées à de l'incapacité de la main, globale et au travail. Toutefois, quelques études sur les effets d'interventions comprenant des techniques manuelles ont montré des résultats prometteurs. Ainsi, le but de l'étude était d'explorer les effets d’un traitement ostéopathique sur la fonction de la main, des symptômes globaux de la maladie et le statut fonctionnel de personnes atteintes de ScS. Une série d'études à cas uniques (A[indice inférieur 1]-B-A[indice inférieur 2]) fut réalisée. Six participantes atteintes de ScS ont été recrutées parmi la cohorte du Groupe de recherche canadien sur la sclérodermie à deux sites (Hôpital général juif de Montréal et Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke). Les participantes ont reçu neuf séances hebdomadaires d’ostéopathie semi-standardisées, ciblées sur les membres supérieurs, le thorax et la base du crâne. Des mesures répétées pendant les trois phases de l'étude ont été prises à une fréquence bihebdomadaire pour la raideur aux mains (RM) et les symptômes de douleur, dyspnée et fatigue; et hebdomadaire pour l'amplitude de mouvement des doigts (AMD), la fonction de la main (FM) et l'incapacité globale (IG). L'épaisseur/rigidité de la peau main/avant-bras (ÉPMA), l'incapacité au travail (IT) et la qualité de vie reliée à la santé (QVS) ont été mesurées à trois temps (avant et après l'intervention, ainsi qu'au suivi à un mois). Les variables à mesures répétées ont été représentées sur des graphiques linéaires soumis à des analyses visuelles, complétées du test Sheward's two Standard Deviation Band. Les différences ont été calculées pour les variables mesurées à trois temps. Toutes les participantes (n=6) ont montré une amélioration des variables reliées à la fonction manuelle (RM, AMD et FM), sauf pour l'ÉPMA (n=4). La majorité des participantes ont montré une amélioration des symptômes (douleur n=6, fatigue n=4 et dyspnée n=3/4) et des variables reliées au statut fonctionnel (IG n=5/5, IT n=4, score résumé physique n=6 et mental n=4 de la QVS). La plupart des effets se sont maintenus au suivi à un mois. Lorsque la comparaison était possible, presque toutes les améliorations observées ont été supérieures aux différences minimales cliniquement importantes suggérées pour cette population. Ces résultats suggèrent que l'ostéopathie pourrait être efficace pour réduire l'incapacité découlant des contractures aux mains de personnes souffrant de ScS, et devraient être vérifiés dans un essai clinique randomisé. // Abstract : In systemic sclerosis (SSc), hand contractures are common and associated with hand, global and work disability. There are no known effective treatments, although there have been a few promising studies with manual therapies. Our aim was to explore the effects of osteopathy on hand function, disease symptoms and functional status in SSc patients. A series of single case studies (A[subscript 1]-B-A[subscript 2] was undertaken. Six female SSc patients with hand contractures were recruited among subjects enrolled in the Canadian Scleroderma Research Group cohort at 2 sites (Jewish General Hospital, Montreal and Centre hospitalier universitaire de Sherbrooke, Sherbrooke). Participants received 9 weekly semi-standardized sessions of osteopathy targetted on upper limbs, thorax and cranial base. Repeated measures were taken during the three phases of the study, twice a week for hand stiffness and disease symptoms of pain, dyspnea and fatigue; and once a week for range of motion of fingers, hand disability and global disability. Upper limbs skin score, work disability and health-related quality of life were measured at baseline, after treatments and at 1-month follow-up. Data for each variable with repeated measures were represented on simple line graphs and visually interpreted, completed by the Sheward's two Standard Deviation Band test. Differences were calculated for variables measured at 3 time points. All participants (n=6) showed improvement in variables related to hand function (hand stiffness, range of motion of fingers and hand disability), except for upper limbs skin score (n=4). The majority of participants showed improvement in disease symptoms (pain n=6, fatigue n=4, et dyspnea n=3/4) as well as variables related to functional status (global disability n=5/5, work disability n=4, physical n=6 and mental n=4 component summary of health-related quality of life). Most improvements were maintained at 4 week follow up. When the comparison was possible, almost all observed improvements were higher than the minimal clinically important differences suggested for this population. These findings suggest that osteopathy may be effective in reducing disability from hand contractures in SSc. A randomized controlled trial is needed to confirm these results.

Le dysfonctionnement endothélial et le dérèglement du système immunitaire sont les deux principaux mécanismes physiopathologiques responsables de la fibrose de la peau et des organes internes dans la sclérodermie systémique (ScS). La pneumopathie interstitielle diffuse (PID) est devenue la principale cause de mortalité de la maladie. L'inflammation pulmonaire est la conséquence de l'activation du système immunitaire, qui stimule la NO synthase inductible (NOS-2) et augmente la production alvéolaire de monoxyde d'azote (NO). L'augmentation de la concentration alvéolaire de NO (CANO) est significativement corrélée à la sévérité de la PID chez les patients atteints de ScS. L'augmentation de la CANO est liée à l'effet inducteur du sérum des malades sur la prolifération des fibroblastes pulmonaires et leur différentiation en myofibroblastes, faisant ainsi le lien biologique entre l'inflammation alvéolaire et la fibrose pulmonaire dans la ScS. Nous avons ensuite testé la valeur prédictive de la CANO dans la détérioration de la PID. Les patients ayant une CANO supérieure à 5,3 ppb présentent un risque élevé (> 6 fois) de voir survenir l'aggravation de la fibrose pulmonaire ou le décès (évènement combiné) par rapport à ceux qui ont une CANO inférieure ou égale à 5,3 ppb. Une valeur de CANO supérieure ou égale à 8,5 ppb permet de détecter les patients avec un risque de 90% de survenue d'évènement combiné dans les trois ans. Ces patients pourraient alors bénéficier d'un traitement approprié précoce. Nous avons évalué l'inflammation pulmonaire dans deux modèles murins de fibrose pulmonaire induite par l'acide hypochloreux et la bléomycine, par la mesure non-invasive du NO expiré (FENO). Le pic d'augmentation de FENO se situe 4 semaines après le début des injections, et précède la fibrose pulmonaire, qui ne devient significative qu'à partir de 6 semaines d'intoxication. L'augmentation de la FENO est liée à l'augmentation de l'expression de la NOS-2 aussi bien aux niveaux des bronches qu'aux niveaux des alvéoles. Enfin, la forte production de NO constatée provoque un effet délétère direct sur le tissu pulmonaire attesté par la présence de 3-nitrotyrosines, marqueurs du stress nitrosatif.Mots-clés: sclérodermie systémique, pneumopathie interstitielle diffuse, monoxyde d'azote, physiopathologie. / Summary not transmitted

La nature du lien qui unit les deux aspects du système immunitaire, que sont la défense de l’hôte contre les agressions extérieures et la genèse des maladies auto- immunes, n’a pas été élucidée. L’axe IL-23/Th17 joue un rôle dans les deux versants, ce qui le place en bonne position pour être un potentiel chaînon manquant. Objectif : connaître l’implication de cet axe dans un modèle infectieux, Mycoplasma hominis, et un modèle de maladie auto-immune, la sclérodermie systémique (ScS), dans lesquels il n’a pas encore été étudié. Les lipoprotéines membranaires de M. hominis sont capables d’induire une maturation des cellules dendritiques humaines. Elle s’accompagne d’une sécrétion d’IL-23 variable selon l’origine clinique des isolats, via TLR2, et d’une polarisation vers la voie Th17. Nous avons observé une augmentation de la fréquence des cellules Th17 et Th22 dans le sang périphérique des patients ScS, potentialisée par l’iloprost, via entre autres la production monocytaire d’IL-23. Dans la peau des patients ScS, il existe une augmentation des cellules produisant l’IL-17 inversement corrélé au score de fibrose cutanée. In vitro, l’IL-17 est capable d’inhiber partiellement l’expression d’α-SMA induite par le TGF-ß et d’induire la sécrétion de MMP1 par des fibroblastes dermiques humains. L’axe IL-23/IL-17 et les cellules Th17 jouent un rôle dans la défense contre M. hominis et dans la physiopathologie de la ScS. / Relationship between both aspects of the immune system, ie host defense against external aggression and genesis of autoimmune diseases, has not been elucidated. IL-23/Th17 axis plays a role in both sides, which puts him in a good position to be a potential missing link. Objective: To understand the implication of this axis in a model of infection, Mycoplasma hominis, and a model of autoimmune disease, systemic sclerosis (SSc), in which it has not yet been studied.
The membrane lipoproteins of M. hominis are capable of inducing human dendritic cell maturation. It occurs along with an IL-23 secretion changing with the clinical origin of isolates, via TLR2, and a T cell polarization towards Th17. Then we observed an increase in the Th17 and Th22 cell frequency in peripheral blood of SSc patients, further enhanced by iloprost via monocyte production of IL-23 among others. In the skin of SSc patients, we showed an increase in IL-17-producing cells with an inverse correlation to the skin fibrosis score. In vitro, IL-17 is able to partially inhibit the expression of α-SMA induced by TGF-ß and to induce the secretion of MMP1 in human dermal fibroblasts. The IL-23/IL-17 axis and Th17 cells play a role in defense against M. hominis and in the pathogenesis of SSc.

Pour beaucoup d’entre nous, y compris pour de nombreux immunologistes, le rôle du système immunitaire est restreint à un rôle de défense contre différents pathogènes, tels que les bactéries et les virus. Pourtant, il devient de plus en plus incontestable que le système immunitaire est impliqué dans de nombreux autres phénomènes que peuvent être le cancer, l’obésité et la réparation tissulaire. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’implication des cellules immunitaires, et plus particulièrement des cellules immunitaires innées, dans le mécanisme de réparation tissulaire. Par la suite, nous avons approfondi ce travail en nous focalisant sur les dérégulations de la réparation tissulaire. Ces dérégulations peuvent donner lieu notamment à des phénomènes de « sur-réparation » telle que la fibrose. La fibrose est définie comme un dépôt excessif de matrice extracellulaire par les fibroblastes en réponse à des molécules profibrotiques tels que le TGFβ ou l’IL-13. Nous nous sommes donc intéressés au rôle de la réponse immunitaire innée dans la fibrose en nous concentrant sur deux types de cellules immunitaires innées : les macrophages et les cellules lymphoïdes innées de type 2 (type 2 innate lymphoïde cells, ou « ILC2 »). Nous avons choisi comme modèle d’étude la sclérodermie systémique, maladie auto-immune caractérisée principalement par la fibrose pouvant toucher la peau et/ou les organes internes. Outre la fibrose, cette pathologie est également associée à des anomalies vasculaires et immunitaires. Les mécanismes liant ces trois caractéristiques sont encore mal définis et mal connus. Il est donc nécessaire de comprendre la physiopathologie de cette maladie et d’établir précisément l’implication de la réponse immunitaire dans la fibrose afin d’offrir un traitement thérapeutique pour les patients sclérodermiques et plus généralement pour toutes les maladies fibrotiques. Dans un premier temps, nous montrons, en cytométrie de flux, une diminution des ILC2 dans le sang des patients sclérodermiques par rapport aux témoins (0,007 ± 0,007% vs. 0,01 ± 0,01%, p=0,001). Chez les sujets sclérodermiques, cette baisse de la fréquence des ILC2 circulantes est inversement corrélée à l’atteinte de la fibrose cutanée définie par le score de Rodnan (R=-0,35, p=0,0062). Nous observons une augmentation de ces cellules dans la peau sclérodermique comparé à celle des contrôles (5,015 ± 2,8% vs. 2,816 ± 1,8%). Ce résultat est positivement corrélé au score de Rodnan (r=0,58, p=0,01). Nous obtenons des résultats similaires en immunofluorescence. Un phénotypage des ILC2 dermales nous a permis d’observer une diminution de l’expression de KLRG1 dans la peau des malades. En collaboration avec l’équipe du Pr. Batteux, nous avons étudié le rôle des ILC2 dans un modèle murin de sclérodermie. Nous observons une augmentation cutanée des ILC2 et cela même avant l’établissement de la fibrose au niveau de la peau des souris sclérodermiques (16677 ± 3068 vs. 9091 ± 474). Puis, nous montrons, in vitro, que les ILC2 stimulées par le TGFb perdent l’expression de KLRG1. Au contact des ILC2 stimulées par le TGFb, les fibroblastes deviennent pro-fibrotique en comparaison à l’incubation avec des ILC2 non stimulées. Ces résultats apportent de nouvelles connaissances dans la physiopathologie de la sclérodermie systémique et plus particulièrement dans la fibrose caractérisant cette maladie, ce qui offre des perspectives thérapeutiques potentielles. L’approche conceptuelle du rôle du système immunitaire dans la réparation tissulaire proposée dans cette thèse renouvelle notre vision de l’immunité et ouvre potentiellement un nouveau champ, encore sous-estimé, de thérapies ciblant le système immunitaire. / For many of us, including many immunologists, the role of the immune system is limited to a defense role against different pathogens such as bacteria and viruses. Yet it is becoming increasingly clear that the immune system is involved in many other phenomena such as cancer, obesity and tissue repair.During this thesis, we were interested in the involvement of immune cells, and more particularly innate immune cells, in the tissue repair mechanism. Subsequently, we deepened this work by focusing on the deregulations of tissue repair. These deregulations can lead to "over-repair" phenomena such as fibrosis. Fibrosis is defined as an excessive deposition of extracellular matrix by fibroblasts in response to profibrotic molecules such as TGFβ or IL-13. We therefore focused on the role of the innate immune response in fibrosis by focusing on two types of innate immune cells macrophages and innate lymphoid cells of type 2 (ILC2). We chose systemic scleroderma, an autoimmune disease characterized mainly by fibrosis that can affect the skin and/or internal organs, as our study model. In addition to fibrosis, this pathology is also associated with vascular and immune abnormalities. The mechanisms linking these three characteristics are still poorly defined and poorly understood.It is necessary to understand the physiopathology of this disease and to establish precisely the involvement of the immune response in fibrosis in order to offer therapeutic treatment for scleroderma patients and more generally for all fibrotic diseases.First, we show, in flow cytometry, a decrease of ILC2 in the blood of scleroderma patients compared to controls (0.007 ± 0.007% vs. 0.01 ± 0.01%, p=0.001). In scleroderma subjects, this decrease in the frequency of circulating ILC2 is inversely correlated with skin fibrosis defined by Rodnan's score (R=-0.35, p=0.0062). We observe an increase in these cells in the scleroderma skin compared to controls (5.015 ± 2.8% vs. 2.816 ± 1.8%). This result is positively correlated to Rodnan's score (r=0.58, p=0.01). We obtain similar results in immunofluorescence. In collaboration with Prof. Batteux's team, we studied the role of ILC2 in a mouse model of scleroderma. We observe an increase in cutaneous ILC2 even before fibrosis is established in the skin of scleroderma mice (16677 ± 3068 vs. 9091 ± 474). Then, we show, in vitro, that ILC2 stimulated by TGFb lose the expression of KLRG1. Upon contact with TGFb-stimulated ILC2, fibroblasts become pro-fibrotic compared to incubation with unstimulated ILC2.These results bring new knowledge in the physiopathology of systemic scleroderma and more particularly in the fibrosis characterizing this disease, which offers potential therapeutic prospects.The conceptual approach to the role of the immune system in tissue repair proposed in this thesis renews our vision of immunity and potentially opens up a new and still underestimated field of therapies targeting the immune system.STAR

La microcirculation cutanée a été proposée comme modèle d’étude de la dysfonction microvasculaire globale dans les maladies cardiovasculaires. Par ailleurs, elle est spécifiquement atteinte dans la sclérodermie systémique (SSc), qui est une maladie dysimmunitaire rare, particulièrement invalidante, caractérisée par une fibrose cutanée et viscérale associée à une atteinte microvasculaire diffuse et la présence d’auto anticorps dirigés contre des antigènes cellulaires. L’exploration de la fonction microvasculaire cutanée suscite donc un réel intérêt, même s’il n’existe pas de technique standardisée pour l’étude de la fonction microvasculaire, en particulier endothéliale.La première partie de ce travail a porté sur l’étude physiologique de la microcirculation cutanée chez le volontaire sain, en utilisant les méthodes les plus récentes adaptées à l’étude fonctionnelle de la microcirculation (tests de réactivité vasculaire couplés à l’enregistrement du flux sanguin cutané par laser speckle contrast imaging). Dans une seconde partie, nous avons étudié la pathologie de la microcirculation cutanée dans la sclérodermie systémique, en utilisant les mêmes d’étude fonctionnelle de la microcirculation. La dernière partie de cette thèse a été consacrée à l’étude d’une nouvelle approche pharmacologique et thérapeutique dans la prise en charge des manifestations vasculaires cutanées périphériques identifiées chez les patients. Nous avons évalué l’effet vasodilatateur du tréprostinil, analogue de la prostacycline, sur le flux sanguin cutané de divers zones anatomiques, chez le volontaire sain, le patient atteint de SSc, le patient diabétique et lors d’un refroidissement local dans la SSc. / Cutaneous microcirculation has been proposed as a model to study the global microvascular dysfunction occurring in cardiovascular diseases. Furthermore, it is specifically impaired in systemic sclerosis (SSc), which is a rare and particularly invalidating auto-immune disease, characterized by a cutaneous and visceral fibrosis, associated with a diffuse microvascular impairment and auto-antibodies targeting some cellular antigens. The study of cutaneous microvascular function provides a real interest despite the lack of available standardized techniques, particularly to explore endothelial microvascular function.In the first part of this work, we aimed to study the physiology of cutaneous microcirculation in healthy volunteers, using the more recent methods in this field, adapted to functional study of microcirculation (vascular reactivity tests coupled with cutaneous blood flow recording by laser speckle contrast imaging). The second part of our work aimed to study the pathology of cutaneous microcirculation in SSc volunteers, by using the same functional exploration methods. The last part of this work has been dedicated to a new pharmacologic and therapeutic approach for the management of peripheral cutaneous vascular manifestations in patients, using innovating technics as cutaneous iontophoresis. We studied the vasodilator effect of treprostinil, a prostacycline analogue, on cutaneous blood flow in several anatomic regions in healthy subject, SSc patient and diabetic patient, and also during a local cooling in SSc.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie autoimmune rare qui se caractérise par une fibrose cutanée et parfois pulmonaire. Nous avons tout d’abord évalué le rôle de BAFF, une cytokine impliquée dans le développement des lymphocytes B (LB), dans la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris. Nous avons démontré que BAFF était augmenté en réponse à la bléomycine et que les souris BAFF-/- ou traitées par le BAFF-R-Ig sont protégées de la fibrose pulmonaire. Ensuite, nous avons évalué si les LB et BAFF pouvaient moduler la production de collagène par des fibroblastes de peau isolés de patients atteints de ScS. Nous avons démontré que les LB augmentent la production de collagène et de cytokines impliquées dans la fibrose cutanée et l’ajout de BAFF augmente cet effet des LB sur les fibroblastes. Enfin, nous avons étudié la régulation de l’expression de BAFF par les microARNs. Nos résultats montrent que les miR-30a*, d* et e* ciblent directement l’ARNm de BAFF. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare autoimmune disease characterized by skin fibrosis and occasionally pulmonary fibrosis. We first assessed the role of BAFF, a cytokine involved in B cell maturation, in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. We showed that BAFF was increased in response to bleomycin and that BAFF-/- mice or BAFF-R-Igtreated mice are protected from pulmonary fibrosis. Then, we assessed whether B cells and BAFF could regulate collagen production by skin fibroblasts isolated from SSc patients. We demonstrated that B cells increase collagen production and cytokines involved in skin fibrosis. The addition of BAFF increases the effect of B cells on fibroblasts. Lastly, we studied the regulation of BAFF expression by microRNAs. Our results show that miR-30a*, d* and e* directly target the BAFF mRNA.

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le déclenchement et le développement de la sclérodermie systémique (ScS). Nous avons mis au point un modèle murin où la maladie est déclenchée par divers types de stress oxydant, puis nous avons exploré les différentes voies d'activation des fibroblastes sous l'effet des formes réactives de l'oxygène, afin de déterminer d'éventuelles cibles thérapeutiques. Pour apprécier les effets d’un stress oxydant chronique, des solutions contenant différents oxydants ont été injectées dans la peau de souris BALB/c et BALB/c SCID. Les solutions contenant le radical hydroxyl OH° ou HOCl ont induit une maladie caractérisée, comme la ScS diffuse, par une fibrose cutanée et viscérale, et des auto-anticorps anti-ADN topoisomérase-1. Les sérums de ces souris contenaient de grandes quantités de dérivés oxydés des protéines et induisaient la prolifération des fibroblastes et la production de formes réactives de l’oxygène par les cellules endothéliales. Une fibrose pulmonaire de moindre importance était induite chez les souris BALB/c SCID. Grâce à ce nouveau modèle murin de SSc, nous avons démontré que le stress oxydant était directement responsable des anomalies observées dans les fibroblastes, les cellules endothéliales et le système immunitaire. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour analyser les voies d’activation fibroblastique dans la ScS. Dans les fibroblastes des souris exposées à HOCl, on observe une dérégulation des voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes, et des récepteurs au PDGF. On observe les mêmes dérégulations ex vivo dans les fibroblastes de patients atteints de SSc diffuse. Nous avons ainsi observé une amélioration clinique significative chez les souris sclérodermiques traitées avec un inhibiteur de l’activation de Notch, avec un agoniste des récepteurs aux cannabinoïdes, et avec des inhibiteurs de tyrosine-kinase ciblant le récepteur au PDGF. Puisque les fibroblastes sclérodermiques ont un phénotype activé et produisent de forts taux de formes réactives de l’oxygène, nous avons enfin mis à profit cette particularité pour induire l’apoptose sélective de ces cellules dans le derme des souris. Le trioxyde d’arsenic, molécule cytotoxique utilisée en thérapeutique humaine, augmente la production cellulaire de formes réactives de l’oxygène au-delà d’un seuil létal et induit ainsi l’apoptose des fibroblastes sclérodermiques. L’utilisation in vivo de cette molécule dans notre modèle murin prévient la fibrose cutanée et viscérale, et les anomalies endothéliales. Le trioxyde d’arsenic a un effet comparable dans le modèle murin de ScS associée à la réaction du greffon contre l’hôte en détruisant les lymphocytes T CD4+ alloréactifs activés et les cellules dendritiques plasmacytoïdes responsables de l’activation du système immunitaire. Les formes réactives de l’oxygène sont donc impliquées dans l’induction des lésions observées au cours de la ScS. Dans notre modèle, le rôle du système immunitaire intervient dans l'auto-entretien et l’extension systémique de la maladie. Le stress oxydant contribue à la dérégulation de diverses voies de signalisation dont les voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes et du PDGF dans les fibroblastes. La modulation de ces voies permet d’obtenir une amélioration clinique chez les souris sclérodermiques, tout comme l’utilisation du trioxyde d’arsenic qui entraîne la délétion spécifique des fibroblastes sclérodermiques surpoduisant des formes réactives de l’oxygène. Le trioxyde d’arsenic montre également une efficacité intéressante dans le modèle de sclérodermie associée à la maladie du greffon contre l’hôte via la délétion des lymphocytes T CD4+ alloréactifs. / We defend the thesis that the oxidative stress plays a major role in the initiation and the development of systemic sclerosis. To demonstrate this thesis, we designed an original mouse model: BALB/c and BALB/SCID mice were injected intra-dermally with prooxidative agents, bleomycin or PBS for 6 weeks. Hypochlorite and hydroxyl radicals induced cutaneous and lung fibrosis in BALB/c mice, in association with anti-DNA topoisomerase-1 auto-antibodies that characterize human diffuse systemic sclerosis. Pulmonary fibrosis was less extensive in BALB/c SCID mice submitted to the same protocol. In this model of HOCl-induced systemic sclerosis, cutaneous fibroblasts display a hyperactivated phenotype that prompted us to investigate several pathways of cellular activation. The NOTCH pathway and the PGDF-receptor pathways were found upregulated in the skin of HOCl-mice. DAPT (a gamma secretase inhibitor that prevents NOTCH cleavage), Sunitinib (an inhibitor of PGDF-receptor phosphorylation), and WIN-55,212, an agonist of the cannabinoid receptors 1 and 2, dramatically improved the clinical, histological and biological signs of systemic sclerosis in the HOCl model.In our model as in patients with SSc, activated fibroblasts produce reactive oxygen species that exert an autocrine effect on their own proliferation and collagen synthesis. By analogy with tumor cells that undergo apoptosis upon cytotoxic treatment that triggers an oxidative stress beyond a lethal threshold, we showed that activated fibroblasts can be selectively killed by the cytotoxic molecule arsenic trioxide (As2O3) that generates intracellular ROS. In the mouse model of sclerodermatous-graft versus host disease (Scl-GVHD), daily intra-peritoneal injections of As2O3 abrogated the clinical symptoms (diarrhea, alopecia, vasculitis, fibrosis of the skin and visceral organs) and specifically induced the apoptosis of activated CD4+ T cells and plasmacytoid dendritic cells. Those data provide a rationale for the evaluation of As2O3 in the management of patients affected by systemic sclerosis or chronic GVHD.

Objectif : Déterminer la prévalence de la Sclérose systémique (SSc) chez les patients atteints de cirrhose biliaire primitive (CBP) et décrire les caractéristiques cliniques, pronostiques, immunologiques et capillaroscopiques chez les patients avec et sans SSc. Méthode : Étude descriptive de 100 patients avec CBP naïfs de SSc référés par les gastroentérologues. Un examen physique ainsi qu’un prélèvement sanguin et une capillaroscopie ont été réalisés. Résultats : Parmi les 22 patients diagnostiqués avec SSc, 13 n’avaient pas d’atteinte cutanée. Trente-neuf patients présentaient un phénomène de Raynaud. Dix-neuf étaient anticentromères (ACAs) positifs dont 18 avaient une SSc. Le groupe de CBP avec SSc avait un score Mayo meilleur et une atteinte histologique moins sévère. Une capillaroscopie anormale était retrouvée chez 29/100 patients. Les patients sans ACAs avaient une hypertension portale légèrement plus fréquente 14/81 (17,28%, p= 0,876) et une atteinte histologique hépatique plus sévère (89,5%, p=0,125). Le score Mayo était globalement meilleur dans le groupe des ACAs positifs. La sensibilité et la spécificité du test immunologique sont 95,45% et 93,59% respectivement. La capillaroscopie a une sensibilité de 78% et une spécificité de 94% pour le diagnostic de la SSc dans la population de CBP.   Conclusion : La SSc est fréquente dans la CBP, d’où l’intérêt de rechercher systématiquement les signes cliniques subtiles de la SSc, notamment le phénomène de Raynaud, et de demander une sérologie spécifique et une capillaroscopie pour identifier une SSc débutante. / Objective : To determine the prevalence of systemic scleroderma (SSc) in patients with primary biliary cirrhosis (PBC) and to describe the clinical, prognostic, immunologic and nailfold capillaropscopy characteristics in patients with and without SSc. Study design : In this descriptive cohort study, 100 patients with PBC who were unknown for any connective tissue disease, in particular for SSc, were referred by their gastroenterologist. Physical examination with collection of serum samples and nailfold capillaroscopy examination were performed. Results : Twenty-two patients had been diagnosed with SSc of which 13 had no cutaneous manifestations of scleroderma. Thirty-Nine patients had Raynaud’s phenomenon. Of the 19 patients with anticentromères antibodies (ACAs), 18 had SSc. Patients with PBC and SSc had a better Mayo score and less severe liver damage. Twenty-nine patients had abnormal nailfold capillaroscopy. More frequent portal hypertension 14/81 (17,28%, p= 0,876) and severe liver tissue damage (89.5%, p=0.125) seen in patients with positive ACAs. Mayo score was better in patients with positives ACAs. The sensitivity and specificity of the immunologic tests were 95,45% and 93,59% respectively. The sensitivity of nailfold capillaroscopy was 78% and specificity was 94% for the diagnosis of SSc in patients with PBC.   Conclusion : SSc is more prevalent in PBC. This study highlights the importance of screening for subtle clinical signs of SSc in patients with PBC, in particular Raynaud’s phenomenon, hence requiring immunologic tests and nailfold capillaroscopy to diagnose scleroderma at earlier stages.

La sclérodermie (SSc) est une maladie rare affectant les personnes génétiquement prédisposées d’une réponse immunitaire défectueuse. Malgré les derniers avancements et développements dans le domaine, l’étiologie et la pathogénèse de la maladie demeurent peu comprises. Par ailleurs, il y a un ralentissement dans la compréhension de cette maladie à cause du manque de modèle animal représentatif de la SSc humaine. Malgré plusieurs lacunes, les souris traitées avec la bléomycine ou portant des modifications génétiques (TSK-1) sont très utilisées dans les études précliniques de la SSc mais elles ne présentent pas toutes les caractéristiques de cette maladie. Pour contribuer à la recherche sur la SSc, la stagiaire postdoctorale Dre Heena Mehta a développé dans le laboratoire du Dre Sarfati en collaboration avec le Dr Senécal, un modèle de souris expérimental induit par l’immunisation de cellules dendritiques (DCs) chargées de peptides de la protéine topoisomérase I (TOPOIA et TOPOIB). Dans le but de caractériser ce modèle murin et d’établir un profil immunitaire, j’ai concentré mes analyses principalement sur les caractéristiques de la SSc telles que la fibrose, l’inflammation, l’hyper-γ-globulinémie polyclonale, la vasculopathie ainsi que de l’expression de cytokines. Brièvement, l’immunisation de souris avec les DCs chargées avec la topoisomérase I (TOPOI) a induit l’inflammation pulmonaire et cutanée, en plus de la fibrose sous forme diffuse (dcSSc). Les souris présentaient également des symptômes de la vasculopathie ainsi que des taux élevés d’anticorps polyclonaux. Les résultats démontraient que les peptides TOPOIA étaient efficaces dans l’induction de la fibrose et de la réponse inflammatoire alors que les peptides TOPOIB étaient surtout impliqués dans la fibrose cutanée. En plus de nos résultats, les observations préliminaires sur le profil de cytokines tissulaires suggéraient que ce modèle pourrait remplacer ou complémenter les autres modèles animaux de SSc. / Systemic sclerosis (SSc) is a rare disease of unknown etiology that affects people that have a genetic predisposition to autoimmunity. Despite the latest advancement and development in the field, the mechanisms underlying disease development remain poorly understood. The lack of animal model that encompasses the cardinal features of human systemic sclerosis is a major cause of the slowdown in the understanding of this disease. In fact, some mouse models such as the bleomycin induced-SSc and TSK-1 mouse are widely used in preclinical studies of scleroderma. However, these models have several shortcomings since these mice do not display all the cardinal features of the disease found in humans. To contribute to the research of SSc, postdoctoral fellow Dre Heena Mehta has developed in Dre Sarfati’s laboratory in collaboration with Dr Senécal, an experimental murine model of SSc induced by dendritic cells loaded with topoisomerase I peptide. In order to characterise the model and establish an immune profile of our experimental mice, my analysis focused mainly on the cardinal features of scleroderma such as fibrosis, inflammation and polyclonal hyper-γ-globulinemia, vasculopathy and cytokines gene expression. Hence, immunization with dendritic cells loaded topoisomerase I peptides (TOPOIA and TOPOIB) induced pulmonary and dermal inflammation together with diffuse form of fibrosis. The mice also showed symptoms of vasculopathy and high levels of polyclonal antibodies. These results showed that TOPOIA peptides are effective in inducing fibrosis and inflammatory response while TOPOIB peptides are involved in skin fibrosis. Together with the results, the preliminary data on cytokine profile in tissue suggested that our mouse model could possibly replace/complement other current animal models of scleroderma.