Este trabalho foi dividido em duas seções, a primeira teve o objetivo de avaliar a ação da metformina sobre a expressão proteica e gênica dos receptores de insulina (IR) e IGF-1 (IGF-1R), como também proteínas da via de sinalização destes receptores, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4, em cultura primária de células estromais endometriais hiperandrogênicas e hiperinsulinêmicas, simulando características da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP). A segunda seção verificou a expressão de semaforina da classe 3 (SEMA3A-F) nas fases do ciclo menstrual e a ação da metformina, em diferentes concentrações, na expressão desta semaforina em cultura primária de células estromais endometriais. No primeiro estudo foram realizadas culturas primárias de células estromais endometriais em diferentes grupos estimulados com estrogênio, progesterona, insulina e androgênios (características da SOP), e tratados com metformina por 10 min, 24 e 48 h. Após 14 dias foram extraídos RNA e proteína para realização das técnicas de qRT-PCR, para avaliar IR e IGF-1R, e Western blot, para avaliar IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4. Houve aumento da expressão gênica de IR nos grupos tratados com insulina, e uma potencialização deste efeito quando a metformina foi associada. Enquanto que o androgênio diminuiu a expressão de IGF-1R e a metformina reverteu este efeito. Quanto à expressão proteica, observou-se que a interação da metformina com a insulina aumentou a expressão do IR em relação aos outros grupos. O IGF-1R sofreu efeito principalmente da insulina, que causou o aumento da expressão deste receptor, e a metformina não influenciou em sua expressão. PI3K e GLUT4 apresentaram uma maior expressão nos grupos estimulados com insulina, e ainda maior quando tratados com insulina e metformina. A proteína ERK não sofreu influência da metformina, enquanto a fosforilação da Akt/PKB foi diminuída significativamente pela ação da metformina. No segundo estudo foram coletadas biópsias endometriais nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual e por qRT-PCR e ELISA foi quantificada a expressão de SEMA3A-F comparando estas fases do ciclo menstrual. Também em culturas primárias de células estromais endometriais foi observado o efeito da metformina, em diferentes concentrações, sobre a expressão desta classe de semaforina. Foi observado uma maior expressão das semaforinas 3A, 3C, 3D e 3E na fase proliferativa do ciclo menstrual comparado com a fase secretória. Em cultura de células, altas doses de metformina inibiram a expressão das semaforinas 3A, 3D e 3E. Como conclusão, a metformina tem efeito sobre células estromais endometriais atuando sobre fatores de crescimento e proteínas de suas vias de sinalização, normalmente aumentando sua expressão, quando associada à insulina. A fosforilação da Akt/PKB foi inibida pela metformina possivelmente por sua ação antiproliferativa. A semaforina de classe 3 está relacionada com a proliferação de células endometriais, e a metformina, em altas doses, diminui sua expressão. / This study has two sections, the first aimed to evaluate the effect of metformin on gene and protein expression of insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), as well as proteins of the pathway signaling of growth factors; Akt/PKB, ERK, PI3K and Glut4 in primary cultures hyperinsulinemic and hyperandrogenism of endometrial stromal cells, simulating polycystic ovary syndrome (PCOS). The second section to evaluate the expression of the class 3 semaphorin (SEMA3A-F) on phases of the menstrual cycle, and the effect of metformin on expression of this semaphorin in endometrial stromal cells. Method: At first, primary cultures of endometrial stromal cells were performed in different groups stimulated with estrogen, progesterone, insulin and androgens (PCOS characteristics) and metformin for 10 minutes, 24 and 48 hours. After 14 days were extracted RNA and protein for qRT-PCR to evaluate IR and IGF-1R, and Western blot to assess IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K, and Glut4. In the second, were collected endometrial biopsies in proliferative and secretory phases of the cycle, and by qRT-PCR and ELISA observed the expression of SEMA3A-F comparing these phases of the menstrual cycle. Also in primary cultures of endometrial stromal cells was observed effects of metformin on the expression of semaphorin class. Results: In the first section, the gene expression of IR showed an increase in the groups treated with insulin, and a more effect when metformin was associated, whereas androgen decreased expression of IGF-1R and metformin reversed this state. Regarding protein expression, it was observed that the interaction of metformin with insulin increased the expression of IR; and of IGF-1R, insulin affected mainly by increasing expression of this receptor, and metformin did not affect expression. Glut4 and PI3K showed higher expression in insulin-stimulated groups, and even greater when treated with insulin and metformin. The protein ERK was not affected by metformin, while the phosphorylation of Akt/PKB was significantly decreased by metformin action. In the second section, we observed a higher expression of semaphorin 3A, 3C, 3D and 3E in the proliferative phase of the menstrual cycle compared with the secretory phase. In cell culture, high doses of metformin inhibited the expression of semaphorin 3A, 3D, and 3E. Conclusions: Metformin has an effect on endometrial stromal cell acting on growth factors and their proteins signaling pathways, usually increasing expressions when combined with insulin. Phosphorylation of Akt/PKB was inhibited by metformin possibly for its antiproliferative action. The semaphorin class 3 is related to the proliferation of endometrial cells, and metformin (high doses), decreases its expression.

Este trabalho foi dividido em duas seções, a primeira teve o objetivo de avaliar a ação da metformina sobre a expressão proteica e gênica dos receptores de insulina (IR) e IGF-1 (IGF-1R), como também proteínas da via de sinalização destes receptores, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4, em cultura primária de células estromais endometriais hiperandrogênicas e hiperinsulinêmicas, simulando características da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP). A segunda seção verificou a expressão de semaforina da classe 3 (SEMA3A-F) nas fases do ciclo menstrual e a ação da metformina, em diferentes concentrações, na expressão desta semaforina em cultura primária de células estromais endometriais. No primeiro estudo foram realizadas culturas primárias de células estromais endometriais em diferentes grupos estimulados com estrogênio, progesterona, insulina e androgênios (características da SOP), e tratados com metformina por 10 min, 24 e 48 h. Após 14 dias foram extraídos RNA e proteína para realização das técnicas de qRT-PCR, para avaliar IR e IGF-1R, e Western blot, para avaliar IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4. Houve aumento da expressão gênica de IR nos grupos tratados com insulina, e uma potencialização deste efeito quando a metformina foi associada. Enquanto que o androgênio diminuiu a expressão de IGF-1R e a metformina reverteu este efeito. Quanto à expressão proteica, observou-se que a interação da metformina com a insulina aumentou a expressão do IR em relação aos outros grupos. O IGF-1R sofreu efeito principalmente da insulina, que causou o aumento da expressão deste receptor, e a metformina não influenciou em sua expressão. PI3K e GLUT4 apresentaram uma maior expressão nos grupos estimulados com insulina, e ainda maior quando tratados com insulina e metformina. A proteína ERK não sofreu influência da metformina, enquanto a fosforilação da Akt/PKB foi diminuída significativamente pela ação da metformina. No segundo estudo foram coletadas biópsias endometriais nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual e por qRT-PCR e ELISA foi quantificada a expressão de SEMA3A-F comparando estas fases do ciclo menstrual. Também em culturas primárias de células estromais endometriais foi observado o efeito da metformina, em diferentes concentrações, sobre a expressão desta classe de semaforina. Foi observado uma maior expressão das semaforinas 3A, 3C, 3D e 3E na fase proliferativa do ciclo menstrual comparado com a fase secretória. Em cultura de células, altas doses de metformina inibiram a expressão das semaforinas 3A, 3D e 3E. Como conclusão, a metformina tem efeito sobre células estromais endometriais atuando sobre fatores de crescimento e proteínas de suas vias de sinalização, normalmente aumentando sua expressão, quando associada à insulina. A fosforilação da Akt/PKB foi inibida pela metformina possivelmente por sua ação antiproliferativa. A semaforina de classe 3 está relacionada com a proliferação de células endometriais, e a metformina, em altas doses, diminui sua expressão. / This study has two sections, the first aimed to evaluate the effect of metformin on gene and protein expression of insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), as well as proteins of the pathway signaling of growth factors; Akt/PKB, ERK, PI3K and Glut4 in primary cultures hyperinsulinemic and hyperandrogenism of endometrial stromal cells, simulating polycystic ovary syndrome (PCOS). The second section to evaluate the expression of the class 3 semaphorin (SEMA3A-F) on phases of the menstrual cycle, and the effect of metformin on expression of this semaphorin in endometrial stromal cells. Method: At first, primary cultures of endometrial stromal cells were performed in different groups stimulated with estrogen, progesterone, insulin and androgens (PCOS characteristics) and metformin for 10 minutes, 24 and 48 hours. After 14 days were extracted RNA and protein for qRT-PCR to evaluate IR and IGF-1R, and Western blot to assess IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K, and Glut4. In the second, were collected endometrial biopsies in proliferative and secretory phases of the cycle, and by qRT-PCR and ELISA observed the expression of SEMA3A-F comparing these phases of the menstrual cycle. Also in primary cultures of endometrial stromal cells was observed effects of metformin on the expression of semaphorin class. Results: In the first section, the gene expression of IR showed an increase in the groups treated with insulin, and a more effect when metformin was associated, whereas androgen decreased expression of IGF-1R and metformin reversed this state. Regarding protein expression, it was observed that the interaction of metformin with insulin increased the expression of IR; and of IGF-1R, insulin affected mainly by increasing expression of this receptor, and metformin did not affect expression. Glut4 and PI3K showed higher expression in insulin-stimulated groups, and even greater when treated with insulin and metformin. The protein ERK was not affected by metformin, while the phosphorylation of Akt/PKB was significantly decreased by metformin action. In the second section, we observed a higher expression of semaphorin 3A, 3C, 3D and 3E in the proliferative phase of the menstrual cycle compared with the secretory phase. In cell culture, high doses of metformin inhibited the expression of semaphorin 3A, 3D, and 3E. Conclusions: Metformin has an effect on endometrial stromal cell acting on growth factors and their proteins signaling pathways, usually increasing expressions when combined with insulin. Phosphorylation of Akt/PKB was inhibited by metformin possibly for its antiproliferative action. The semaphorin class 3 is related to the proliferation of endometrial cells, and metformin (high doses), decreases its expression.

Este trabalho foi dividido em duas seções, a primeira teve o objetivo de avaliar a ação da metformina sobre a expressão proteica e gênica dos receptores de insulina (IR) e IGF-1 (IGF-1R), como também proteínas da via de sinalização destes receptores, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4, em cultura primária de células estromais endometriais hiperandrogênicas e hiperinsulinêmicas, simulando características da Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP). A segunda seção verificou a expressão de semaforina da classe 3 (SEMA3A-F) nas fases do ciclo menstrual e a ação da metformina, em diferentes concentrações, na expressão desta semaforina em cultura primária de células estromais endometriais. No primeiro estudo foram realizadas culturas primárias de células estromais endometriais em diferentes grupos estimulados com estrogênio, progesterona, insulina e androgênios (características da SOP), e tratados com metformina por 10 min, 24 e 48 h. Após 14 dias foram extraídos RNA e proteína para realização das técnicas de qRT-PCR, para avaliar IR e IGF-1R, e Western blot, para avaliar IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K e GLUT4. Houve aumento da expressão gênica de IR nos grupos tratados com insulina, e uma potencialização deste efeito quando a metformina foi associada. Enquanto que o androgênio diminuiu a expressão de IGF-1R e a metformina reverteu este efeito. Quanto à expressão proteica, observou-se que a interação da metformina com a insulina aumentou a expressão do IR em relação aos outros grupos. O IGF-1R sofreu efeito principalmente da insulina, que causou o aumento da expressão deste receptor, e a metformina não influenciou em sua expressão. PI3K e GLUT4 apresentaram uma maior expressão nos grupos estimulados com insulina, e ainda maior quando tratados com insulina e metformina. A proteína ERK não sofreu influência da metformina, enquanto a fosforilação da Akt/PKB foi diminuída significativamente pela ação da metformina. No segundo estudo foram coletadas biópsias endometriais nas fases proliferativa e secretória do ciclo menstrual e por qRT-PCR e ELISA foi quantificada a expressão de SEMA3A-F comparando estas fases do ciclo menstrual. Também em culturas primárias de células estromais endometriais foi observado o efeito da metformina, em diferentes concentrações, sobre a expressão desta classe de semaforina. Foi observado uma maior expressão das semaforinas 3A, 3C, 3D e 3E na fase proliferativa do ciclo menstrual comparado com a fase secretória. Em cultura de células, altas doses de metformina inibiram a expressão das semaforinas 3A, 3D e 3E. Como conclusão, a metformina tem efeito sobre células estromais endometriais atuando sobre fatores de crescimento e proteínas de suas vias de sinalização, normalmente aumentando sua expressão, quando associada à insulina. A fosforilação da Akt/PKB foi inibida pela metformina possivelmente por sua ação antiproliferativa. A semaforina de classe 3 está relacionada com a proliferação de células endometriais, e a metformina, em altas doses, diminui sua expressão. / This study has two sections, the first aimed to evaluate the effect of metformin on gene and protein expression of insulin receptor (IR) and IGF-1 receptor (IGF-1R), as well as proteins of the pathway signaling of growth factors; Akt/PKB, ERK, PI3K and Glut4 in primary cultures hyperinsulinemic and hyperandrogenism of endometrial stromal cells, simulating polycystic ovary syndrome (PCOS). The second section to evaluate the expression of the class 3 semaphorin (SEMA3A-F) on phases of the menstrual cycle, and the effect of metformin on expression of this semaphorin in endometrial stromal cells. Method: At first, primary cultures of endometrial stromal cells were performed in different groups stimulated with estrogen, progesterone, insulin and androgens (PCOS characteristics) and metformin for 10 minutes, 24 and 48 hours. After 14 days were extracted RNA and protein for qRT-PCR to evaluate IR and IGF-1R, and Western blot to assess IR, IGF-1R, Akt/PKB, ERK, PI3K, and Glut4. In the second, were collected endometrial biopsies in proliferative and secretory phases of the cycle, and by qRT-PCR and ELISA observed the expression of SEMA3A-F comparing these phases of the menstrual cycle. Also in primary cultures of endometrial stromal cells was observed effects of metformin on the expression of semaphorin class. Results: In the first section, the gene expression of IR showed an increase in the groups treated with insulin, and a more effect when metformin was associated, whereas androgen decreased expression of IGF-1R and metformin reversed this state. Regarding protein expression, it was observed that the interaction of metformin with insulin increased the expression of IR; and of IGF-1R, insulin affected mainly by increasing expression of this receptor, and metformin did not affect expression. Glut4 and PI3K showed higher expression in insulin-stimulated groups, and even greater when treated with insulin and metformin. The protein ERK was not affected by metformin, while the phosphorylation of Akt/PKB was significantly decreased by metformin action. In the second section, we observed a higher expression of semaphorin 3A, 3C, 3D and 3E in the proliferative phase of the menstrual cycle compared with the secretory phase. In cell culture, high doses of metformin inhibited the expression of semaphorin 3A, 3D, and 3E. Conclusions: Metformin has an effect on endometrial stromal cell acting on growth factors and their proteins signaling pathways, usually increasing expressions when combined with insulin. Phosphorylation of Akt/PKB was inhibited by metformin possibly for its antiproliferative action. The semaphorin class 3 is related to the proliferation of endometrial cells, and metformin (high doses), decreases its expression.

Orientador: Pablo Agustin Vargas / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T11:33:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_FelipePaiva_D.pdf: 1634857 bytes, checksum: 43da6be9627bec5197103495826aa6d6 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Tumores de glândulas salivares correspondem a aproximadamente 3% de todas as neoplasias de cabeça e pescoço e as neoplasias malignas derivadas destas estruturas anatômicas ainda representam um grande desafio para a oncologia de cabeça e pescoço devido a sua difícil abordagem cirúrgica e pobre resposta às outras abordagens terapêuticas. Um melhor entendimento do seu perfil molecular contribuiria significativamente para um melhor manejo terapêutico futuro e o estudo do potencial angiogênico dos tumores de glândulas salivares representa um interessante alvo de investigação. Tem sido demonstrado que as semaforinas induzem a apoptose de células tumorais, modulam a migração celular neoplásica e inibem a angiogênese em diferentes neoplasias humanas, competindo com o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) pela ligação aos seus principais receptores, as neuropilinas-1 e -2, desta forma inibindo os efeitos mitogênicos e pró-angiogênicos de VEGF. Assim, o objetivo deste estudo é investigar a expressão das semaforinas de classe 3 A e B (Sema3A e Sema3B), e dos seus receptores neuropilinas-1 e -2 (Np-1 e Np-2) em tumores de glândulas salivares, determinando seus significados clínicos. Duzentos e quarenta e oito tumores benignos e malignos de glândulas salivares selecionados de quatro instituições brasileiras foram organizados em blocos de parafina em microarranjo tecidual em matriz e submetidos a reações de imunoistoquímica contra CD34, Sema3A, Sema3B, Np-1 e Np-2. As imunoreações foram quantificadas utilizando algoritmos digitais e os resultados foram correlacionados com parâmetros clinicopatológicos e índices de sobrevida. Tumores malignos apresentaram uma maior densidade vascular, porém uma menor área vascular do que sua contraparte benigna. Em glândulas salivares normais a expressão de Np-1 e -2 esteve restrita às células ductais, enquanto que Sema3A e Sema3B estiveram principalmente no componente acinar. Tumores benignos e malignos revelaram uma expressão similar de todos os marcadores e a co-expressão de Np-1/Np-2 correlacionou-se significativamente com a ocorrência de parestesias e estágios mais avançados dos tumores. Apesar de não ser estatisticamente significativa, a sobre-expressão simultânea de ambos os receptores também indicou uma menor taxa de sobrevida. Desta forma, Sema3A, Sema3B, Np-1 e Np-2 devem estar envolvidas no desenvolvimento das glândulas salivares normais e na patogênese das neoplasias benignas e malignas derivadas destas estruturas; entretanto, a expressão destas proteínas não apresentou um potencial prognóstico estatisticamente significativo no presente estudo / Abstract: Salivary gland tumors correspond to approximately 3% of all head and neck neoplasms and the malignant neoplasias derived from these anatomic structures still represent a major pitfall in head and neck oncology because of their difficult surgical approach and poor response to other therapies. A better understanding of their molecular basis would significantly aid to an improved future management and the study of salivary gland tumors angiogenic potential represents an interesting target of investigation. It has been shown that semaphorins induce tumor cell apoptosis, modulate tumor cell migration and inhibit angiogenesis in different human neoplasms, competing with vascular endothelial growth factor (VEGF) for biding to their main receptors, the neuropilins-1 and -2, thereby inhibiting mitogenic and pro-angiogenic effects of VEGF. Hence, the objective of this study is to investigate the expression of class 3 Semaphorins A and B, and their receptors neuropilins-1 and -2 in salivary gland tumors, determining their clinical significance. Two hundred and forty eight benign and malignant salivary gland tumors selected from four Brazilian institutions were organized in tissue microarray paraffin blocks and submitted to immunohistochemical reactions against CD34, Sema3A, Sema3B, Np-1 and Np-2. The immunoreactions were quantified using digital algorithms and the results were correlated with clinicopathological parameters and survival rates. Malignant tumors presented an increased vascular density but a lower vascular area than their benign counterparts. In normal salivary glands Np-1 and Np-2 expression was restricted to ductal cells, whereas Sema3A and Sema3B were positive mainly in serous acinar compartment. Benign and malignant tumors revealed a similar expression of all markers and the co-expression of Np-1/Np-2 significantly correlated with the occurrence of paresthesia and higher stages of the tumors. In addition, although not statistically significant, simultaneous overexpression of both receptors also indicated an inferior survival rate. Hence, these results suggest that Sema3A, Sema3B, Np-1 and Np-2 may be involved in the development of normal salivary glands and in the pathogenesis of benign and malignant neoplasms derived from these structures; however, the expression of these proteins did not present a statistically significant prognostic potential in the current study / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia