Master of Science / Department of Clinical Sciences / Maria S. Ferrer / Presence of anti-sperm antibodies (ASA) is associated with infertility in many species, including bulls but there is no standardized direct technique that allows detection of ASA bound to the sperm surface. The overall objective was to standardize a flow cytometric technique for detection of IgG and IgA directly attached to bovine sperm. The effects of fixation using phosphate buffer solution (PBS) or diluted formalin buffer solution (dFBS), exclusion of dead cells from the analysis, and aliquot variability were assessed using healthy bulls classified as Satisfactory Potential Breeders (SPB, n=9) and bulls with experimentally induced ASA (n=4) (Experiment1). The effect of freezing on the percentage of IgG- and IgA- bound sperm was assessed in samples from immunized bulls (n=4) (Experiment 2). Anti-sperm antibodies on the sperm surface were induced in yearling bulls by intramuscular injection of autologous semen and an adjuvant. Fixation of sperm cells did not affect the percentage of IgG- or IgA-bound sperm in any group of bulls. Exclusion of dead cell from the analysis did not affect the percentage of IgG-bound sperm (p= 0.0922 and p= 0.1525 for immunized and reproductively normal bulls, respectively). The exclusion of dead cells significantly increased the percentage of IgA-bound sperm in semen samples from immunized bulls (p= 0.0152) and significantly decreased the percentage of IgA- bound sperm in semen samples from reproductively normal bulls (p= 0.0012). Variability was < 10% in samples from immunized and reproductively normal bulls for percentage of IgG- and IgA-bound sperm. Freezing did not affect the percentage of IgG- (p=0.1287) or IgA-bound sperm (p=0.4175). Based on these results, fixation is neither necessary nor detrimental for analysis, and the percentage of antibody-bound cell should be calculated gated on the population of live cells only, especially when evaluating IgA binding. The percentage of ASA-bound sperm can be assessed on frozen-thawed samples. The development of this technique allows for further studies on ASA-bound sperm in populations of normal and abnormal bulls.

M.Sc. (Zoology) / Please refer to full text to view abstract

The aim of this master thesis was the finding out of potential of growing the soybeans in the area with not so suitable growing conditions. The next aim was to perform the experiment with application of leaf fertilizer EGT Fulhum which increases root system volume. In the years 2016 and 2017 was in the altitude 395 m established the field experiment with the variety Amandine and since the year 2017 was also joint the experiment with the very early variety Abeline. Within these cultivars of soybean were evaluated these parameters: Seed yield, the 1000 seed weight, seed oiliness, plant height, number of pods on one plant, number of the early branches and weight of roots. The seed yield was very variable from the point of view of the year. The yield in the year 2016 was above-average, the control variant reached the yield 2,93 tons per hectare and variant treated by Fulhum 2, 78 tons per hectare. One of the studied parameter was the nitrogen content and based on the results of this parameter was noticeable reduction of nitrogen content of the treated variant in the comparison with control variant. In the further year were two compared two varieties - Amandine and Abeline. Within the both varieties were involved to the experiment the control variant and the variant treated by plant auxiliary substance. In the year 2017 was confirmed the influence of the crop area establishment on the yield quality parameters. The progress of weather confirmed the high requirements of soybean on the good rainfall conditions. Seed yield of the variety Amandine was 1,07 tons per hectare in the case of the treated variant, by control variant it was 0,88 tons per hectare. The difference of the seed yield between both variants of the variety Abeline was very little, it was 0,90 tons per hectare by the treated variant and 0,93 tons per hectare by the control variant. The application of the plant auxiliary substance didn't cause, on average, the improvement of the studied parameters so the using of this substance, for the improvement of these parameters almost doesn't make any sense.

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: Lia de Alencar Coelho / Banca: Sony Dimas Bicudo / Resumo: A nutrição é um dos principais fatores que afetam diretamente o metabolismo produtivo e reprodutivo dos animais. Dentre os fatores nutricionais a proteína é um dos elementos mais importantes. Este estudo objetivou a análise de possíveis alterações no sistema reprodutivo de carneiros mediadas pela diferença de proteínas fornecidas na dieta total. Foram instituídas quatro dietas com distintos níveis protéicos: A- (controle) 13,4% PB; 210 g/dia PM; B- 11,4% PB e 187 g/dia PM; C- 17,5% PB e 231 g /dia PM; D-22,4% PB e 215,0 g/dia PM. As coletas de dados foram realizadas em D0; D20; D40; D80; D120. Durante o experimento os animais foram pesados e avaliados quanto a condição corporal; foi feita coleta de sêmen e avaliação em sistema computadorizado (CASA), ultrassonografia e citologia testicular; e dosagem de testosterona, T3 e T4. Os dados obtidos neste estudo, mostraram que a dieta A, não provocou alterações no sistema reprodutivo, portanto foi considerada a mais indicada a carneiros em atividade reprodutiva. / Abstract: Nutrition is one of the main factors that directly affect the productive and reproductive metabolism of animals. Among nutritional factors, protein is one of the most important elements. The objective of this study was to analyze the possible alterations in the reproductive system of rams mediated by the difference of proteins provided in the total diet. Four diets were established, with distinct protein levels: A- (control) 13,4% CP (Crude Protein); 210 g/day MP (Metabolized Protein); B- 11,4% CP and 187 g/day MP; C- 17,5% CP and 231 g /day MP; D-22,4% CP and 215,0 g/day MP. Data collections were performed in D0; D20; D40; D80; D120. During the experiment, animals were weighted and evaluated concerning body condition; semen collection and evaluation were carried out in computer system (CASA); ultrasound examination and testicular cytology; and hormonal count of testosterone, T3 e T4. The results obtained in this study showed that diet is A did not cause changes in the reproductive system of rams. Therefore, it was considered the most appropriate for rams in reproductive activity. / Mestre

Os ovinos domésticos (Ovis aries) estão entre os primeiros animais domesticados para lã, leite, carne e pele. Novas biotecnologias de avaliação e manipulação do sêmen estão sendo estudadas para a elucidação de causas de infertilidade em machos. Sabe-se que danos causados na membrana espermática diminuem a qualidade seminal. Considerando que as membranas são compostas por uma bicamada de fosfolipídios e que a peroxidação lipídica é uma das principais causadoras de lesão celular, explica-se a importância de estudos sobre os lipídios constituintes do sêmen. A peroxidação lipídica é conseqüente da reação entre os lipídios e as espécies reativas de oxigênio que são fisiologicamente produzidas pelo metabolismo celular. Esse quadro pode ser diminuído pela presença de antioxidantes no sêmen, como a vitamina E. O sêmen foi coletado através da técnica da vagina artificial e após análise imediata e mediata, foi centrifugado para a obtenção de duas frações: plasma seminal e pellet de espermatozóide. Ambas tiveram seus lipídios extraídos por dois métodos diferentes e foram qualificados e quantificados pela especificidade e sensibilidade da Cromatografia Liquida de Alta Eficiência e assim pudemos escolher qual o melhor processo de extração. A análise estatística dos dados foi realizada através do programa SAS for Windows. O AG saturado predominante no espermatozóide é o mirístico e o AG insaturado predominante é o DHA, em ambas as extrações. No plasma seminal, nos dois métodos, o AG saturado que prevalece é o palmítico e o insaturado é o oléico. Dentre os métodos Folch (1957) modificados estudados, o que obtivemos melhores resultados na identificação e quantificação dos AG foi a extração 1. / The domestic sheep (Ovis Aries) is one of the first domesticated animals for wool, milk and meat production. The study of technologies for assessment and handling of semen are in course for the elucidation of male infertility causes. It is well known that damage to the sperm membrane decreases semen quality. Considering that the membranes are composed by a phospholipid bilayer, lipid peroxidation is a major cause of cell damage and explains the importance of studies on lipid components of semen. Lipid peroxidation is a consequence of the reaction between lipids and reactive oxygen species that are physiologically produced by cellular metabolism. This event may be reduced in the presence of antioxidants in semen, such as tocopherol. Semen was collected by artificial vagina and, after sperm evaluation, samples were centrifuged resulting in two fractions: seminal plasma and spermatozoa pellet. Both had their lipids extracted by two different methods and were qualified and quantified for the sensitivity and specificity to the high performance liquid chromatography in order to determine the most efficient extraction technique. Statistical analysis was performed using SAS software for Windows. The predominant saturated fatty acid in sperm is the myristic and the most abundant insaturated fatty acid in both extractions was DHA. In seminal plasma, in both methods, the prevailing fatty acid is the saturated palmitic and the unsaturated oleic. Among the methods evaluated, we obtained the best results of identification and quantification of fatty acids in extraction 1.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade da refrigeração do sêmen bovino comparada com a criopreservação. Este estudo foi realizado em dois experimentos. No primeiro experimento foram comparados os efeitos in vitro do sêmen refrigerado em três meios diluidores comerciais a 5&deg; C por até 48 horas, e criopreservado em dois meios. Para este experimento foram utilizados ejaculados de 10 touros da raça Nelore. Cada ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo diluídas nos meios Botubov&reg;, Steridyl&reg; e Bovidyl&reg;. Após a diluição o sêmen foi envasado em palhetas e refrigerado nos três diluidores e criopreservado utilizando somente os meios Botubov&reg; e Steridyl&reg;. A refrigeração do sêmen foi realizada a 5&deg; C por até 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex&reg; e a criopreservação realizada em sistema automatizado TK 4.000&reg;. O sêmen foi avaliado nos tempos 0, 24, 36 e 48 horas após a refrigeração e após a descongelação, para cada diluidor. Foram realizadas análises dos padrões de cinética espermática pelo sistema computadorizado de análise espermática (CASA, programa SCA - Sperm Class Analyser), integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e estresse oxidativo por sondas fluorescentes, sob microscopia de epifluorescência e morfologia espermática por microspcopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Notou-se efeito de tempo de refrigeração para os três diluidores para de 0 para 24h, se mantendo semelhante até 48 h. Os diluiores Botubov&reg; e Steridyl&reg; preservaram as características espermáticas de forma semelhante até 48 horas de refrigeração diferindo apenas na variável de velocidade curvilianear; no entanto, ambos foram superiores ao diluidor Bovidyl&reg;, para as variáveis, motilidade total, motilidade progressiva, células rápidas, velocidade curvilinear, velocidade progressiva, velocidade do trajeto, retilinearidade, integridade da membrana plasmática, alto potencial de mitocondrial e espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial. O segundo experimento foi realizado, baseado nos resultados do primeiro experimento, para avaliar os efeitos da refrigeração e da criopreservação do sêmen sobre a fertilidade in vivo. Foram utilizados ejaculados de três touros das raças Brangus, Braford e Angus, com idade entre 5 e 7 anos. O sêmen foi colhido por meio de vagina artificial, o ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo duas alíquotas para refrigeração e uma para criopreservação. Para a refrigeração o sêmen foi diluído nas concentrações de 15x106 (R15) e 30x106 (R30) espermatozoides/palheta e para a criopreservação diluído na concentração de 30x106 espermatozoides/palheta (CRIO). Para todas as diluições foi utilizado o meio Botubov&reg; e o sêmen armazenado em palhetas de 0,5 mL. A refrigeração foi realizada a temperatura de 5&deg; C por 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex&reg; e a criopreservação em sistema automatizado TK&reg;. Foram sincronizadas 552 vacas da raça Brangus em programas de inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados da taxa de prenhez para os grupos de vacas inseminadas foram de 49,4% para R15, 43,38% para R30 e 47,59% para o sêmen criopreservado. Pode-se concluir que a refrigeração do sêmen a 5&deg; C por 48 horas resulta em taxa de prenhez semelhante às obtidas com o sêmen criopreservado, sendo que esses resultados indicam que a refrigeração por até 48 horas pode ser uma opção de uso para IATF. / The objective of the present study was to evaluate the viability of cooling bovine semen compared to cryopreservation. This study was carried out in two experiments. In the first experiment, the in vitro effects of cooled semen were compared in three commercial extenders at 5&deg; C for up to 48 hours, and cryopreserved in two extender. For this experiment were used ejaculates of 10 Nellore bulls. Each ejaculate was divided into three aliquots, being diluted in the Botubov&reg;, Steridyl&reg; and Bovidyl&reg; extenders. After dilution, the semen was cooled into three extenders and cryopreserved using the Botubov&reg; and Steridyl&reg;. Semen refrigeration was performed at 5&deg; C for up to 48 hours in BotuFlex&reg; passive refrigeration system and cryopreservation performed in TK 3.000&reg; automated system. Semen was evaluated at 0, 24, 36 and 48 hours after refrigeration and after thawing, for each diluent. The sperm kinetics of the spermatic kinetics (CASA, SCA - Sperm Class Analyzer), plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential and oxidative stress by fluorescent probes were analyzed under epifluorescence microscopy and sperm morphology By Differential Interference Contrast Microscopy (DIC). The Botubov&reg; and Steridyl&reg; diluents were very similar after 48 hours of cooling differing significantly only in the Curvilianear Velocity (VCL) 106.04 m/s and 124.56 m/s. The Bovidyl&reg; diluent yielded results significantly lower than the 48 hours of refrigeration for the variables: total motility (MT), progressive motility (MPRO), fast cells (RAP), curvilinear velocity (VCL), progressive velocity (AP), plasma membrane integrity (PI), high mitochondrial potential (AP), and spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes and high mitochondrial potential (PIAIA). The second experiment was carried out, based on the results of the first experiment I, to evaluate the effects of cooled and cryopreservation of semen on in vivo fertility. We used ejaculates of three bulls of the Brangus, Braford and Angus breeds of a IA center, aged between 5 and 7 years. The semen was collected by artificial vagina, the ejaculate was divided into three aliquots, two aliquots for refrigeration and one for cryopreservation. For cooling, the semen was diluted in the concentrations of 15x106 (R15) and 30x106 (R30) spermatozoa/straw, for cryopreservation diluted in the concentration of 30x106 spermatozoa / vane (CRIO). For all dilutions, the Botubov&reg; medium and the semen stored in 0.5 mL vial were used. Refrigeration was carried out at a temperature of 5&deg; C for 48 hours in BotuFlex&reg; passive refrigeration system and cryopreservation in an automated TK&reg; system. 552 Brangus cows were synchronized in fixed-time artificial insemination programs. The results of the pregnancy rate for the groups of inseminated cows were 49.4% for R15, 43.38% for R30 and 47.59% for cryopreserved semen. It can be concluded that the cooling of the semen at 5&deg; C for 48 hours results in pregnancy rate similar to those obtained with cryopreserved semen, and these results indicate that refrigeration for up to 48 hours may be an option of use for FTAI.

Amostras espermáticas provenientes do epidídimo podem ser utilizadas com diversas finalidades tais como: modelo experimental para pesquisa com sêmen, aproveitamento do sêmen de animais de alto valor genético que vierem a óbito e possibilidade da coleta e aproveitamento do sêmen de animais em perigo de extinção. No entanto, para a utilização desta técnica é necessário o estudo de diversos fatores que poderiam influenciar sua eficiência, como por exemplo, as formas de armazenamento dos testículos, efeitos da criopreservação, diluidores utilizados, entre outros. O presente estudo teve como objetivos: 1- determinar a temperatura mais adequada para o armazenamento do testículo após o abate do animal (4 ou 34ºC) levando-se em consideração testes funcionais e fecundação in vitro; 2- avaliar o efeito desta temperatura de armazenamento no sêmen epididimário fresco e criopreservado e; 3- verificar a eficiência do tratamento com ácido decosaexanóico (DHA) e antioxidantes adicionados ao diluidor. Para isso, amostras espermáticas foram coletadas da cauda do epidídimo de touros provenientes de abatedouros. Para testar o efeito da temperatura de acondicionamento dos testículos, os mesmos foram armazenados entre 2 e 4 horas após o abate, à temperatura de 4 ou 34º C. O sêmen foi então coletado da cauda do epidídimo, submetido ou não à criopreservação e avaliado quanto a análise computadorizada da motilidade espermática (CASA), integridade de membrana e potencial mitocondrial (iodeto de propídeo, SYBR e JC1), fertilização in vitro e susceptibilidade ao estresse oxidativo (TBARS). Visto que os resultados deste experimento indicaram que a temperatura de 4ºC era a mais indicada, a mesma foi utilizada para a avaliação do efeito da suplementação com DHA e antioxidantes adicionados ao diluidor. Nesta fase, o sêmen foi avaliado quanto à integridade de membrana e acrossomo (eosina/nigrosina e fast green/rosa bengala, respectivamente), atividade mitocondrial (diaminobenzidina), integridade do DNA (ensaio da estrutura da cromatina espermática SCSA) e susceptibilidade ao estresse oxidativo (TBARS). Os resultados do presente estudo indicam que o tratamento com o DHA tornou os espermatozóides mais susceptíveis aos danos causados pelo estresse oxidativo. Por outro lado, resultados diversos foram encontrados com a associação entre DHA e antioxidantes. A associação entre DHA e superóxido dismutase (SOD) e DHA e glutationa reduzida (GSH) apresentaram os melhores resultados em relação à motilidade espermática e à integridade de membrana, respectivamente. No entanto, o DHA, quando associado à Vitamina E, apresentou resultados negativos para a atividade mitocondrial. Os resultados do presente estudo indicam que o tratamento com DHA e SOD ou DHA e GSH em amostras espermáticas coletadas de epidídimos armazenados a 4ºC por até 4 horas, pode melhorar a qualidade espermática pós criopreservação. / Sperm recovery from the cauda epididymis can be very advantageous, for example: in case of the unexpected death of a genetically highly valuable animal, as an experimental model for research on semen and for the use in endangered species. However, the efficiency of this technique demands the study of several issues such as the storage conditions of the testicles prior semen collection, the effects of cryopreservation and semen extenders, among others. The objective of the present study was: 1- to evaluate the ideal temperature for testicles storage after slaughter (4 or 34ºC) based on functional tests and on in vitro fertility; 2- to evaluate the effect of storage temperature on fresh and cryopreserved semen samples, and; 3- to test the addition of decosaexanoic acid (DHA) and antioxidants to the semen extender. Sperm samples were collected from the caudae epididymides of testicles collected from abattoirs. To test the effect of temperature of storage, testicles were kept under 4 or 34ºC, between two to four hours after slaughter. Semen was then collected from the caudae epididymides and cryopreserved or not. Samples were then evaluated for computer assisted sperm analysis (CASA), membrane integrity and mitochondrial potential (propidium iodide, SYBR and JC1), in vitro fertilization outcomes, and susceptibility to the oxidative stress (TBARS). Results of this study indicated that, with no doubt, storage of testicles under 4ºC is the most appropriate in order to improve post-thaw sperm quality and in vitro fertility. Therefore, this temperature was used in the rest of the study to test the effect of DHA and antioxidant treatments to the semen extender. In this part of the study, semen was evaluated for membrane and acrosome integrities (eosin/nigrosin and fast green/bengal rose stain, respectively), mitochondrial activity (diaminobenzidine stain), DNA integrity (sperm chromatin structure assay SCSA) and, sperm susceptibility to the oxidative stress (TBARS). Results of the present study indicate that due to the treatment with DHA, epididymal sperm became more susceptible to the oxidative stress. On the other hand, different results were found regarding the association between DHA and antioxidant. The association between DHA and superoxide dismutase (SOD) and between DHA and reduced glutathione (GSH) showed better results on sperm motility and membrane integrity, respectively. On the other hand, when associated to the Vitamin E, the DHA showed poor results on mitochondrial activity. Results of the present study indicate that the treatment with DHA and SOD or GSH to epididymal sperm samples collected from testicles stored at 4ºC for up to 4 hours, may improve post-thaw sperm quality.

Um dos fatores responsáveis pela diminuição expressiva da qualidade espermática pós-criopreservação seria um maior índice de estresse oxidativo, provocado por uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), não compensada pela proteção antioxidante. O presente experimento visa estudar o efeito do tratamento antioxidante com glutationa (GSH) e vitamina E, adicionados ao diluidor, na qualidade do espermatozóide pós-criopreservação em cães. Para isso, o sêmen de 12 cães foi dividido em mixes constituídos dos ejaculados provenientes de 3 cães com no mínimo 70% de motilidade. O mix de sêmen foi então dividido em 7 alíquotas e diluídas em extensor a base de gema de ovo e ácido círtrico suplementadas com 0, 1, 5 e 10 mM de GSH e 1, 5 e 10 mM de vitamina E. Após o período de refrigeração as amostras foram analisadas quanto a motilidade e vigor espermáticos. As amostras foram então descongeladas e avaliadas quanto à motilidade, vigor, porcentagem de espermatozóides com membrana (eosina/nigrosina) e acrossomo (Coloração simples) íntegros, atividade mitocondrial (coloração diaminobenzidina) e susceptibilidade das células ao estresse oxidativo (TBARS). Os resultados foram analisados através do SAS System for Windows. Verificou-se que as amostras tratadas com 1 mM de GSH apresentaram maior porcentagem de células com membrana íntegra quando comparadas ao controle (11,21 ± 2,84 e 6,21 ± 1,16, respectivamente; p<0,05). A concentração de 5 mM de GSH apresentou melhores resultados em relação à atividade mitocondrial. Para as amostras tratadas com vitamina E, não houve efeito significativo com exceção da porcentagem de células DAB III, em que amostras tratadas com 1 mM apresentaram melhores resultados em comparação ao controle (5,61 ± 0,7 e 8,62 ± 1,05, respectivamente; p<0,05). Os resultados do presente experimento indicam que o tratamento antioxidante de amostras criopreservadas de cães com GSH e vitamina E apresentaram efeitos benéficos para a atividade mitocondrial dos espermatozóides. / One of the main factors known to impair post thaw semen quality is oxidative stress (i.e., higher production of reactive oxygen species not compensated by improved antioxidant protection). The present experiment aimed to evaluate the effects of antioxidant treatment with glutathione (GSH) and vitamin E on the quality of dogs cryopreserved semen. Towards this aim, semen of twelve dogs was divided into mixes constituted of the ejaculate of three dogs with at least 70% motility. Each mix was then divided into 7 extender treatment groups as follows: Control, Vitamin E 1, 5, 10 mM, and GSH 1, 5 and 10 mM. O mix de sêmen foi então dividido em 7 alíquotas e diluídas em extensor a base de gema de ovo e ácido círtrico suplementadas com 0, 1, 5 e 10 mM de GSH e 1, 5 e 10 mM de vitamina E. After cooling, motility and vigor were assessed. Cryopreserved samples were thawed and evaluated for motility, vigor, percentage of sperm showing intact membrane (eosin/nigrosin) and acrosome (Simple stain), mitochondrial activity (diaminobenzidine) and susceptibility to oxidative stress (TBARS). Statistical analyses was performed using the SAS system for Windows. Samples treated with 1 mM of GSH showed higher percentage of intact membrane sperm when compared to the control (11.21 ± 2.84 and 6.21 ± 1.16, respectively; p<0.05). Treatment with 5 mM of GSH showed better results regarding mitochondrial activity. Effect of vitamina E treatment was observed only for the percentage of DAB III cels (i.e., cells with severe compromised mitochondrial activity), in which samples treated with 1 mM showed better results when compared to the control group (5.61 ± 0.7 and 8.62 ± 1.05, respectively; p<0.05). Results of the present study indicate that treatment with GSH and vitamin E to cryopreserved sperm samples of dogs improve post-thaw mitochondrial activity.

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante. / The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs.

Foi estudado a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre a motilidade, o vigor, a morfologia e o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões, comparando o sêmen fresco, o exposto a congelação e descongelação sem crioprotetores, o exposto aos crioprotetores sem congelação e o exposto aos crioprotetores com congelação e descongelação. Foram utilizados seis garanhões da raça Mangalarga Paulista, colhendo 12 ejaculados de cada animal na estação não reprodutiva (1) e 12 ejaculados na estação reprodutiva (2), analisando a motilidade, o vigor, a concentração, a morfologia e a patologia do complexo DNA-Proteína. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em sêmen fixado com etanol-ácido-acético glacial 3:1 (v/v), tratado com HCL 4N a 25oC e corado com azul de toluidina a 0,025% em tampão Mcllvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a motilidade, o vigor, a morfologia e a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelado e não congelado (P<0,05). Para o grupo fresco, a taxa de patologia do complexo DNA-Proteína apresentou diferença significativa (P<0,05) entre as estações 1 e 2. O processo de congelação e descongelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões. / To study the effects of freezing and thawing on DNA-protein complexes in spermatozoa, 12 ejaculate were collected from each of 6 stallions (Mangalarga Paulista breed) in each of two consecutive breeding seasons. Motility, vigor, concentration, morphology and incidence of the DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were evaluated and compared among fresh semen, semen expose to freezing and thawing without cryoprotectants and semen exposed to the cryoprotectors glycerol and ethylene glycol left at room temperature or frozen. Incidence of the DNA-protein complex pathologies was evaluated in semen smear fixed in na ethanol-acetic-acid mixture (3:1, v/v) for 1 minute, washed in 70% ethanol for 3 minutes and air dried. To induce nuclear metachromasy, smears were treated with 4N HCL at 25ot for 20 minutes followed by rinsing in distilled water. Preparation were stained with a 0.025% toluidine blue solution in Mailvaine buffer for 15 minutes. Frequency of spermatozoa exhibiting nuclear metachromasy was determined in 1000 cells/animal by light microscopy at 1000X magnification. Motility, vigor, morphology and DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were different for semen frozen compared to not frozen (P<0.05). For fresh semen, there were effects of seasons on the incidence of DNA-protein complex pathologies (P<0.05) For semen frozen without cryoprotectants there were significant effects seasons (P<0.05) The process of cryopreservation and thawing influences negatively the DNA-protein complexes in stallion spermatozoa.