Foi estudado a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre a motilidade, o vigor, a morfologia e o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões, comparando o sêmen fresco, o exposto a congelação e descongelação sem crioprotetores, o exposto aos crioprotetores sem congelação e o exposto aos crioprotetores com congelação e descongelação. Foram utilizados seis garanhões da raça Mangalarga Paulista, colhendo 12 ejaculados de cada animal na estação não reprodutiva (1) e 12 ejaculados na estação reprodutiva (2), analisando a motilidade, o vigor, a concentração, a morfologia e a patologia do complexo DNA-Proteína. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em sêmen fixado com etanol-ácido-acético glacial 3:1 (v/v), tratado com HCL 4N a 25oC e corado com azul de toluidina a 0,025% em tampão Mcllvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a motilidade, o vigor, a morfologia e a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelado e não congelado (P<0,05). Para o grupo fresco, a taxa de patologia do complexo DNA-Proteína apresentou diferença significativa (P<0,05) entre as estações 1 e 2. O processo de congelação e descongelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões. / To study the effects of freezing and thawing on DNA-protein complexes in spermatozoa, 12 ejaculate were collected from each of 6 stallions (Mangalarga Paulista breed) in each of two consecutive breeding seasons. Motility, vigor, concentration, morphology and incidence of the DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were evaluated and compared among fresh semen, semen expose to freezing and thawing without cryoprotectants and semen exposed to the cryoprotectors glycerol and ethylene glycol left at room temperature or frozen. Incidence of the DNA-protein complex pathologies was evaluated in semen smear fixed in na ethanol-acetic-acid mixture (3:1, v/v) for 1 minute, washed in 70% ethanol for 3 minutes and air dried. To induce nuclear metachromasy, smears were treated with 4N HCL at 25ot for 20 minutes followed by rinsing in distilled water. Preparation were stained with a 0.025% toluidine blue solution in Mailvaine buffer for 15 minutes. Frequency of spermatozoa exhibiting nuclear metachromasy was determined in 1000 cells/animal by light microscopy at 1000X magnification. Motility, vigor, morphology and DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were different for semen frozen compared to not frozen (P<0.05). For fresh semen, there were effects of seasons on the incidence of DNA-protein complex pathologies (P<0.05) For semen frozen without cryoprotectants there were significant effects seasons (P<0.05) The process of cryopreservation and thawing influences negatively the DNA-protein complexes in stallion spermatozoa.

Considerando a importância comercial da perdiz (Rhynchotus rufescens), implantou-se algumas biotecnologias reprodutivas. Trinta animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle (sem selênio orgânico) e tratamento (com 0,2 a 0,8mg de selênio em 1000kgs de ração ), provenientes da FCAV-UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Coletou-se semên por excitação manual que foram aliquotados em pools com 150&micro;L. Após a avaliação do volume, motilidade, vigor, números de espermatozóides, concentração e morfologia espermática, diluiu-se 20&micro;l de sêmen em 300&micro;l de solução fisiológica para testar a Integridade das membranas acrossomal e plasmática e avaliação da atividade mitocondrial. Uma outra alíquota de 20&micro;l foi utilizada para testar a resistência dos espermatozóides ao estresse oxidativo, induzido (vitamina C + sulfato ferroso), por meio da dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). A amostra restante foi congelada diretamente em nitrogênio líquido para a realização do teste da integridade do DNA espermático e para medir a atividade das enzimas antioxidantes Catalase e Glutationa Peroxidase. Contou-se 200 células, para avaliação da integridade acrossomal e de membrana, atividade mitocondrial e ensaio cometa e classificou-as: 1) Acrossomo Íntegro: cor lilás e Não-Íntegro: róseo; 2)Células Vivas (não coradas) e Mortas (coradas), 3) Classes de I a IV, sendo Classe I (todas as mitocôndrias íntegras) com a peça intermediária totalmente corada e Classe IV (todas as mitocôndrias comprometidas) com a peça intermediária totalmente descorada e 4) Cometa I a IV, sendo Cometa I (DNA íntegro): células com halo ao seu redor e núcleo corado, porém sem cauda de cometa evidente e Cometa IV (DNA altamente fragmentado): célula com núcleo completamente descorado e apenas a cauda do cometa, respevtivamente. Os dados foram analisados pelo SAS, System for Windows. Nenhuma diferença foi encontrada para volume, motilidade, vigor, número de espermatozóides, concentração, integridade acrossomal, integridade da membrana plasmática, Classes I e III da atividade mitocondrial, Cometa I,II e IV, TBARS e atividade da Glutationa. Foram encontradas diferenças nas Classes II (Se=33,39±2,93 e Controle=44,39±2,59, p=0.0125 e IV (Se=3,44±0,09 e Controle=1,50±0,38, p=0.0401) e Cometa III (Se=16,00 ± 0,82 e Controle=34,75 ± 1,44, p=<.0001), respectivamente. A diferença encontrada no DAB II pode ser devido aos danos causados na arquitetura da peça intermediária pela deficiência de selênio, o que compromete a mobilidade e a capacidade de fecundação do espermatozóide. Para o DAB IV, não era esperado esse resultado, que pode ser devido aos pequenos valores encontrados para essa variável (Se=3,44% e Controle=1,50%) em relação ao total das classes e que poderia não ser significante se levássemos em consideração as classes juntas. Em relação a porcentagem mais baixa de espermatozóides do grupo suplementado com selênio para a classe III do Ensaio Cometa, pode sugerir um efeito de proteção desta substância, possivelmente devido a um índice mais elevado da Glutationa Peroxidase. / Considering the commercial value of the partridges (Rhynchotus rufescens), the employment of reproductive biotechnologies has been attempted. Thirty animals were randomly assigned into two groups: control group (no selenium) and treatment group (supplemented with 0,2 a 0,8mg selenium/ 1000kgs ration). Animals were allocated at the FCAV - UNESP/Jaboticabal (2007-2008). Semen collections were performed by digital manipulation and divided in pools of at least 150&micro;L. After the immediate evaluation of volume, motility, vigour, concentration and morphology, an aliquot of 20&micro;L was diluted in 300&micro;L of physiologic solution in order to test acrosome and membrane integrities and mitochondrial activity. Another aliquot of 20 &micro;L was used to test the resistance of sperm against the induced oxidative stress (Vitamin C + ferrous sulphate), followed by the measurement of TBARS. The remaining semen sample was frozen directly in liquid nitrogen in orther to perform the comet assay and to measure the activity of the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. Cells were evaluated respectively for acrosome and membrane integrities, mitochondrial activity and comet assay as follows: 1) Intact acrosome: lilac acrosome; Non-intact acrosome: pink acrosome; 2) Live cells: non stained; Dead: stained; 3) Classes I to IV, being Class I (full mitochondrial potential): midpiece totally stained and class IV (no mitochondrial potential): midpiece not stained; 4) Classes I to IV, being Class I (intact DNA): nucleus with intense fluorescence with no comet tail; Class IV (highly fragmented DNA): no nucleus, only a comet tail. Data was statistically anlysed using the SAS System for Windows. No differences were found on volume, motility, vigour, number of spermatozoa, concentration, acrosomal and membrane integrity, Classes I and III of mitochondrial activity, Comets I, II and IV, TBARS and Glutathione activity. Differences were found on as DAB Classes II (Se=33.39±2.93 and control=44.39±2.59, p=0.0125) and IV (Se=3.44±0.09 and control=1.50±0.38, p=0.0401) and comet class III (Se=16.00 ± 0.82 and control=34.75 ± 1.44, p=<.0001), respectively. The difference found on DAB II may be due to the damages caused by the selenium deficiency to the architecture of the midpiece, which compromises sperm mobility and fertilization capacity. On the other hand, the unexpected difference found on DAB IV may be due to the small values found for this variable in all animals (Se=3.44% and control=1.50%), which would be not significant taking into account all classes. The decreased percentage of sperm showing DNA fragmentation Class II found on the selenium supplemented group may suggest a protective effect of this substance on sperm DNA, possibly due to a higher GPx content.

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

O sêmen eqüino é muito utilizado na forma refrigerada, porém, para alguns garanhões, a longevidade espermática é baixa. Durante a refrigeração o espermatozóide pode ser afetado por vários fatores, que podem causar a perda da integridade da membrana plasmática, danos no acrossomo e disfunções mitocondriais, resultando em perda irreversível de motilidade e capacidade fecundante. A composição e concentração do plasma seminal podem causar efeitos deletérios ao espermatozóide, sendo a centrifugação do sêmen uma alternativa para minimizar estes efeitos. Este experimento foi realizado para verificar o efeito da centrifugação nas características de movimento, integridade e peroxidação lipídica das membranas do espermatozóide eqüino refrigerado a 5°C por até 72h. Foram realizadas cinco colheitas de sêmen de quatro garanhões. O sêmen foi avaliado quanto ao volume e concentração, e em seguida dividido em dois tratamentos, sem centrifugação (S) e centrifugado (C) (300g/10min). Ambos foram diluídos na concentração final de 30 x106 eptz/mL em diluidor a base de leite desnatado e então refrigerados. Foram analisadas as características do movimento espermático (CASA), morfologia espermática (DIC), integridade das membranas plasmática e acrossomal (PI/FITC-PSA), potencial de membrana mitocondrial (JC-1) e peroxidação lipídica das membranas (C11-BODIPY581/591), sendo estas três últimas análises por citometria de fluxo. As análises foram realizadas no tempo 0 e 24, 48 e 72 horas após a refrigeração. O delineamento experimental foi em blocos generalizados adicionado do fator medidas repetidas no tempo. Os dados foram analisados pelo programa SAS, submetidos à análise de variância e às interações determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser ao nível de 5% de significância. O espermatozóide do sêmen centrifugado apresentou valores médios maiores de motilidade total e progressiva, ALH, STR e LIN (P<0,05), porém os valores das velocidades e BCF foram menores (P<0,05). Houve efeito do tempo nas características de movimento espermático (P<0,05), exceto para STR. Não houve efeito da centrifugação e nem do tempo quanto às características morfológicas dos espermatozóides refrigerados, esta só diferiu entre os garanhões (P<0,05). Por sua vez, a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial espermáticas foram maiores nos sêmen centrifugado (P<0,05) e suas porcentagens decresceram com o tempo (P<0,05). A peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide refrigerado aumentou somente nas primeiras 24h (P<0,05) e não foi influenciada pela centrifugação. Conclui-se que a centrifugação e a retirada do plasma seminal melhoram a qualidade do sêmen refrigerado eqüino, principalmente em garanhões com baixa longevidade, sendo esta influenciada pelas características iniciais da morfologia espermática. Ainda, tempo de refrigeração induz a um declínio da qualidade seminal. E, por fim, a peroxidação lipídica da membrana do espermatozóide parece não ser a principal causa de alterações da integridade das membranas e do potencial de membrana mitocondrial durante a refrigeração do sêmen eqüino. / Equine cooled semen is frequently used, although the longevity for some stallions is low. During the cooling process the spermatozoon can be affected by several factors that can cause loss of plasma membrane integrity, acrosomal damage and mitochondrial dysfunctions, resulting in irreversible loss of motility and fertilizing capacity. The composition and concentration of seminal plasma could cause harmful effects to the sperm, being semen centrifugation an alternative to minimize these effects. This experiment was designed to verify the effects of the centrifugation in motion characteristics, membranes integrity and lipid peroxidation of cooled equine sperm to 5°C until 72 hours. Five ejaculates from four stallions were collected. The semen was evaluated for volume and concentration, then split in two treatments, no centrifugation (N) and with centrifugation (W) (300g/10min). Both were diluted in the final concentration 30 x106 spermatozoa/mL in a skin milk extender and then cooled. The following analyses were performed: the sperm motion characteristics (CASA), morphology (DIC), plasma and acrosomal membranes integrity (PI/FITC-PSA), mitochondrial membrane potential (JC-1) and membrane lipid peroxidation (C11-BODIPY581/591), the last three analyses were assessed in flow citometry. The analyses were performed in time 0 and 24, 48 and 72 hours after cooling. The experimental design was random blocks with repeated-measures. The data were analyzed by the SAS program, submitted to analysis of variance and the interactions by the test of Greenhouse-Geisser at the level of 5% of significance. The values were larger in W semen for total and progressive motility, ALH, STR and LIN (P<0,05), however the values of the three types of speed and BCF were smaller (P<0,05). There was effect of time in the motion characteristics of sperm (P<0,05), except for STR. There was not any effect of centrifugation and time for the morphologic characteristics of cooled spermatozoa, that only differed among stallions (P<0,05). On the other hand, the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane were larger in W semen (P<0,05) and their percentages decreased within time (P<0,05). The membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm only increased in the first 24 hours (P<0,05) and it was not influenced by centrifugation. In conclusion, the centrifugation and withdrawal of the seminal plasma improve semen quality of the cooled equine sperm, mainly in stallions with low longevity, which is influenced by the initials characteristics of sperm morphology. Moreover, time of cooling induces a decline of seminal quality. Finally, the membrane lipidic peroxidation of the cooled sperm seems not to be the main cause of alterations in the sperm integrity of plasma and acrosomal membranes and the potential of mitochondrial membrane during the cooling of equine semen.

Os ovinos domésticos (Ovis aries) estão entre os primeiros animais domesticados para lã, leite, carne e pele. Novas biotecnologias de avaliação e manipulação do sêmen estão sendo estudadas para a elucidação de causas de infertilidade em machos. Sabe-se que danos causados na membrana espermática diminuem a qualidade seminal. Considerando que as membranas são compostas por uma bicamada de fosfolipídios e que a peroxidação lipídica é uma das principais causadoras de lesão celular, explica-se a importância de estudos sobre os lipídios constituintes do sêmen. A peroxidação lipídica é conseqüente da reação entre os lipídios e as espécies reativas de oxigênio que são fisiologicamente produzidas pelo metabolismo celular. Esse quadro pode ser diminuído pela presença de antioxidantes no sêmen, como a vitamina E. O sêmen foi coletado através da técnica da vagina artificial e após análise imediata e mediata, foi centrifugado para a obtenção de duas frações: plasma seminal e pellet de espermatozóide. Ambas tiveram seus lipídios extraídos por dois métodos diferentes e foram qualificados e quantificados pela especificidade e sensibilidade da Cromatografia Liquida de Alta Eficiência e assim pudemos escolher qual o melhor processo de extração. A análise estatística dos dados foi realizada através do programa SAS for Windows. O AG saturado predominante no espermatozóide é o mirístico e o AG insaturado predominante é o DHA, em ambas as extrações. No plasma seminal, nos dois métodos, o AG saturado que prevalece é o palmítico e o insaturado é o oléico. Dentre os métodos Folch (1957) modificados estudados, o que obtivemos melhores resultados na identificação e quantificação dos AG foi a extração 1. / The domestic sheep (Ovis Aries) is one of the first domesticated animals for wool, milk and meat production. The study of technologies for assessment and handling of semen are in course for the elucidation of male infertility causes. It is well known that damage to the sperm membrane decreases semen quality. Considering that the membranes are composed by a phospholipid bilayer, lipid peroxidation is a major cause of cell damage and explains the importance of studies on lipid components of semen. Lipid peroxidation is a consequence of the reaction between lipids and reactive oxygen species that are physiologically produced by cellular metabolism. This event may be reduced in the presence of antioxidants in semen, such as tocopherol. Semen was collected by artificial vagina and, after sperm evaluation, samples were centrifuged resulting in two fractions: seminal plasma and spermatozoa pellet. Both had their lipids extracted by two different methods and were qualified and quantified for the sensitivity and specificity to the high performance liquid chromatography in order to determine the most efficient extraction technique. Statistical analysis was performed using SAS software for Windows. The predominant saturated fatty acid in sperm is the myristic and the most abundant insaturated fatty acid in both extractions was DHA. In seminal plasma, in both methods, the prevailing fatty acid is the saturated palmitic and the unsaturated oleic. Among the methods evaluated, we obtained the best results of identification and quantification of fatty acids in extraction 1.

A capacidade de preservar a viabilidade do sêmen pelo emprego das biotecnologias, como refrigeração e criopreservação, oferece muitas vantagens a equideocultura. O estresse oxidativo é um dos principais entraves para estas biotecnicas e advêm do ataque de distintas espécies reativas de oxigênio (EROs). Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar o impacto das diferentes EROs sobre os espermatozoides com e sem plasma seminal. Foram colhidos ejaculados de 13 garanhões Mangalarga Marchador de fertilidade conhecida. Os ejaculados foram divididos em duas frações (A e B). As frações foram centrifugadas (2200g/10min) e o pellet com os espermatozoides foi ressuspendido em solução salina fisiológica ou plasma seminal de modo que as duas frações apresentassem a mesma concentração final (sptz/mL). Ambas as frações (A e B) tiveram 4 alíquotas de 400&micro;L retiradas e submetidas a 3 sistemas distintos de produção de EROs (xantina + xantina oxidase que produz anion superóxido; peróxido de hidrogênio; ferro + vitamina C que produz radical hidroxil) e malondialdeído. Após a incubação, as amostras A e B foram avaliadas de acordo com os testes funcionais (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3&#39;diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA&trade; para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARs).Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo programa SAS System for Windows. A susceptibilidade do espermatozoide equino ao estresse oxidativo é variável de acordo com a espécie reativa de oxigênio empregada na incubação; as espécies mais deletérias no presente experimento foram a malondialdeído e principalmente o radical hidroxil o que já era esperado. Houve um efeito benéfico quanto a manutenção das funções celulares e status oxidativo em amostras cujo plasma seminal foi preservado. A proteção atribuída ao plasma seminal influenciou parâmetros como atividade mitocondrial, susceptibilidade a denaturação acida da cromatina e índice de peroxidação lipídica. O plasma seminal exerceu mais pronunciada proteção aos eventos desencadeados pela malondialdeído / Biotechnologies such as chilling and cryopreservation of equine semen have been largely used in horse breeding due to its importance on storage and propagation of genetic material. The oxidative stress is one of the main causes of poor results related to the fertility of processed stallion sperm. Oxidative injuries are mainly due to the attack of different reactive oxygen species (ROS). Thus, the aim of the present study was to evaluate the impact of distinct ROS attack on equine spermatozoa with and without seminal plasma. The collection of one ejaculate of thirteen Mangalarga fertile stallions were performed. Ejaculates were divided in two aliquots (A and B). These aliquots were centrifuged (600G /10 min) and pellets were resuspended in saline solution (0,9%) or seminal plasma certifying that each sample had the same concentration (sptz/mL). Both aliquots (A and B) were divided in four samples of 400 &micro;L each and incubated with four ROS generating systems (superoxide anion; hydrogen peroxide; hydroxil radical and malondialdehyde). After the 30 incubation, all the samples were evaluated for membrane integrity (eosin-nigrosin stain), acrosome integrity (simple stain of fast-green/ Bengal rose), 3-3&#39;diaminbenzidine for mitochondrial activity and SCSA&trade; for the chromatin suceptibility to the acid denaturation. Lipid peroxidation was accessed by TBARs assay. Statistical analysis was performed using SAS System for Windows. The susceptibility of equine sperm to the oxidative stress is different in each ROS generation system; but the most deleterious ROS were hydroxyl radical and malondialdehyde. A positive effect of seminal plasma on the sperm viability was observed which may be linked to its protective role. The protection occurred in mitochondria, chromatin and against lipid peroxidation. Higher beneficial effect of seminal plasma was observed in samples treated with malondialdehyde

O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade da refrigeração do sêmen bovino comparada com a criopreservação. Este estudo foi realizado em dois experimentos. No primeiro experimento foram comparados os efeitos in vitro do sêmen refrigerado em três meios diluidores comerciais a 5&deg; C por até 48 horas, e criopreservado em dois meios. Para este experimento foram utilizados ejaculados de 10 touros da raça Nelore. Cada ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo diluídas nos meios Botubov&reg;, Steridyl&reg; e Bovidyl&reg;. Após a diluição o sêmen foi envasado em palhetas e refrigerado nos três diluidores e criopreservado utilizando somente os meios Botubov&reg; e Steridyl&reg;. A refrigeração do sêmen foi realizada a 5&deg; C por até 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex&reg; e a criopreservação realizada em sistema automatizado TK 4.000&reg;. O sêmen foi avaliado nos tempos 0, 24, 36 e 48 horas após a refrigeração e após a descongelação, para cada diluidor. Foram realizadas análises dos padrões de cinética espermática pelo sistema computadorizado de análise espermática (CASA, programa SCA - Sperm Class Analyser), integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e estresse oxidativo por sondas fluorescentes, sob microscopia de epifluorescência e morfologia espermática por microspcopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Notou-se efeito de tempo de refrigeração para os três diluidores para de 0 para 24h, se mantendo semelhante até 48 h. Os diluiores Botubov&reg; e Steridyl&reg; preservaram as características espermáticas de forma semelhante até 48 horas de refrigeração diferindo apenas na variável de velocidade curvilianear; no entanto, ambos foram superiores ao diluidor Bovidyl&reg;, para as variáveis, motilidade total, motilidade progressiva, células rápidas, velocidade curvilinear, velocidade progressiva, velocidade do trajeto, retilinearidade, integridade da membrana plasmática, alto potencial de mitocondrial e espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial. O segundo experimento foi realizado, baseado nos resultados do primeiro experimento, para avaliar os efeitos da refrigeração e da criopreservação do sêmen sobre a fertilidade in vivo. Foram utilizados ejaculados de três touros das raças Brangus, Braford e Angus, com idade entre 5 e 7 anos. O sêmen foi colhido por meio de vagina artificial, o ejaculado foi dividido em três alíquotas, sendo duas alíquotas para refrigeração e uma para criopreservação. Para a refrigeração o sêmen foi diluído nas concentrações de 15x106 (R15) e 30x106 (R30) espermatozoides/palheta e para a criopreservação diluído na concentração de 30x106 espermatozoides/palheta (CRIO). Para todas as diluições foi utilizado o meio Botubov&reg; e o sêmen armazenado em palhetas de 0,5 mL. A refrigeração foi realizada a temperatura de 5&deg; C por 48 horas em sistema passivo de refrigeração BotuFlex&reg; e a criopreservação em sistema automatizado TK&reg;. Foram sincronizadas 552 vacas da raça Brangus em programas de inseminação artificial em tempo fixo. Os resultados da taxa de prenhez para os grupos de vacas inseminadas foram de 49,4% para R15, 43,38% para R30 e 47,59% para o sêmen criopreservado. Pode-se concluir que a refrigeração do sêmen a 5&deg; C por 48 horas resulta em taxa de prenhez semelhante às obtidas com o sêmen criopreservado, sendo que esses resultados indicam que a refrigeração por até 48 horas pode ser uma opção de uso para IATF. / The objective of the present study was to evaluate the viability of cooling bovine semen compared to cryopreservation. This study was carried out in two experiments. In the first experiment, the in vitro effects of cooled semen were compared in three commercial extenders at 5&deg; C for up to 48 hours, and cryopreserved in two extender. For this experiment were used ejaculates of 10 Nellore bulls. Each ejaculate was divided into three aliquots, being diluted in the Botubov&reg;, Steridyl&reg; and Bovidyl&reg; extenders. After dilution, the semen was cooled into three extenders and cryopreserved using the Botubov&reg; and Steridyl&reg;. Semen refrigeration was performed at 5&deg; C for up to 48 hours in BotuFlex&reg; passive refrigeration system and cryopreservation performed in TK 3.000&reg; automated system. Semen was evaluated at 0, 24, 36 and 48 hours after refrigeration and after thawing, for each diluent. The sperm kinetics of the spermatic kinetics (CASA, SCA - Sperm Class Analyzer), plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential and oxidative stress by fluorescent probes were analyzed under epifluorescence microscopy and sperm morphology By Differential Interference Contrast Microscopy (DIC). The Botubov&reg; and Steridyl&reg; diluents were very similar after 48 hours of cooling differing significantly only in the Curvilianear Velocity (VCL) 106.04 m/s and 124.56 m/s. The Bovidyl&reg; diluent yielded results significantly lower than the 48 hours of refrigeration for the variables: total motility (MT), progressive motility (MPRO), fast cells (RAP), curvilinear velocity (VCL), progressive velocity (AP), plasma membrane integrity (PI), high mitochondrial potential (AP), and spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes and high mitochondrial potential (PIAIA). The second experiment was carried out, based on the results of the first experiment I, to evaluate the effects of cooled and cryopreservation of semen on in vivo fertility. We used ejaculates of three bulls of the Brangus, Braford and Angus breeds of a IA center, aged between 5 and 7 years. The semen was collected by artificial vagina, the ejaculate was divided into three aliquots, two aliquots for refrigeration and one for cryopreservation. For cooling, the semen was diluted in the concentrations of 15x106 (R15) and 30x106 (R30) spermatozoa/straw, for cryopreservation diluted in the concentration of 30x106 spermatozoa / vane (CRIO). For all dilutions, the Botubov&reg; medium and the semen stored in 0.5 mL vial were used. Refrigeration was carried out at a temperature of 5&deg; C for 48 hours in BotuFlex&reg; passive refrigeration system and cryopreservation in an automated TK&reg; system. 552 Brangus cows were synchronized in fixed-time artificial insemination programs. The results of the pregnancy rate for the groups of inseminated cows were 49.4% for R15, 43.38% for R30 and 47.59% for cryopreserved semen. It can be concluded that the cooling of the semen at 5&deg; C for 48 hours results in pregnancy rate similar to those obtained with cryopreserved semen, and these results indicate that refrigeration for up to 48 hours may be an option of use for FTAI.

O presente experimento teve por objetivos comparar a adição de diferentes concentrações de glutationa reduzida (GSH) no diluidor para criopreservação do sêmen de cães, considerando-se as características morfofuncionais pós-descongelação; e verificar os índices de gestação e número de filhotes por ninhada obtidos a partir da inseminação artificial intra-uterina, por cateterização cervical endoscópica, com sêmen criopreservado contendo diferentes concentrações de glutationa. Na primeira fase do experimento, foram realizadas duas colheitas seminais de 11 reprodutores com intervalo mínimo de uma semana entre os procedimentos. Foram empregadas três concentrações diferentes de glutationa reduzida (0, 10 e 20 mM) ao meio de congelação tris-gema-citrato. O sêmen fresco, refrigerado, glicerolizado e descongelado foram avaliados por citometria de fluxo com uso de sondas específicas para determinar a integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e fragmentação de DNA. Também foi realizada dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar os níveis de estresse oxidativo. Na segunda fase do experimento, foram inseminadas 6 fêmeas, alocadas em dois grupos: inseminação intra-uterina com sêmen congelado em diluidor contendo 10 mM (IA-GSH10, n=3) e sem a adição de glutationa (IA-GSH0, n=3). O acompanhamento do ciclo estral foi realizado por citologia vaginal, vaginoscopia, dosagem de progesterona e LH. Foram realizadas duas inseminações no 5o e 6o dias após pico de LH e a gestação diagnosticada aos 30 dias. A adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação promoveu queda na motilidade espermática nas amostras descongeladas, sendo o maior prejuízo observado na concentração de 20 mM. Foi detectada maior porcentagem de acrossomos íntegros nos grupos tratados. A glicerolização e, principalmente, a exposição do espermatozóide ao nitrogênio líquido e posterior descongelação foram responsáveis pela diminuição da motilidade espermática, em consequência ao prejuízo da função mitocondrial promovida pela produção de radicais livres durante o processamento seminal. A gestação foi diagnosticada em duas fêmeas do grupo IA-GSH10 e duas do grupo IA-GSH0. Em conclusão, a adição de 10 e 20 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal não promoveu os efeitos protetores esperados na espécie canina, sendo a concentração de 20 mM responsável por maiores prejuízos à amostra seminal. A adição de 10 mM de GSH ao diluidor para criopreservação seminal na espécie canina manteve o índice de fertilidade semelhante ao obtido com sêmen criopreservado sem a suplementação antioxidante. / The present experiment aimed to compare the addition of different concentrations of reduced glutathione (GSH) on frozen-thawed canine semen, considering the morphofunctional characteristics; and to verify the pregnancy rate and number of puppies per litter obtained from intrauterine insemination by endoscopic catheterization of the cervix, with frozen-thawed semen containing different concentrations of glutathione. During the first phase of the experiment, two seminal samples collected weekly from 11 mature dogs were used. Three different concentrations of reduced glutathione (0, 10 and 20 mM) were supplemented in a tris-citrate egg yolk extender. The fresh, chilled, glycerolized and post-thawed semen were assessed by flow cytometry using specific probes to determine plasma membrane and acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay was also performed to assess the occurrence of oxidative stress. In the second phase of the experiment, six canine females were allocated into two groups: intrauterine insemination with frozen-thawed semen containing 10 mM GSH (IA-GSH10, n = 3) and without the addition of glutathione (IA-GSH0, n = 3). Bitches were monitored by vaginal cytology, vaginoscopy, progesterone and LH assays. Two inseminations were performed on days 5 and 6 post LH peak. We verified that the addition of 10 and 20 mM of GSH to semen extender promoted a decrease in post-thaw sperm motility, as well as a higher damage degree at the 20 mM concentration. We also detected a higher percentage of acrossomal integrity in treated groups. At glycerolization and moreover, the sperm exposure to liquid nitrogen and further thawing, were responsible for the decrease in sperm motility, due to the loss of mitochondrial function through the free radicals production. Gestation was diagnosed in two female from IA-GSH10 group and two bitches of the IA-GSH0 group. In conclusion, we did not observe the expected protective effects of the addition of 10 and 20 mM GSH to semen extender. Furthermore, the concentration of 20 mM was responsible for the more extreme damage to semen sample. The supplementation of 10 mM GSH to semen extender for cryopreservation maintained the fertility rates similar to the ones observed for cryopreservation without antioxidant supplementation in dogs.

A perdiz (Rhynchotus rufescens) é um tinamídeo com amplos músculos peitorais muito apreciados por mercados especializados. No entanto, a produção em larga escala é inexpressiva, podendo ser melhorada através da inseminação artificial (IA). Sendo assim, o presente experimento teve como objetivos padronizar a coleta de sêmen, o teste hipo-osmótico, testar diferentes diluidores, tempos de refrigeração e doses inseminantes. Amostras seminais de 100 animais, pertencentes a FCAV/UNESP/Jaboticabal, foram empregadas na descrição do volume, pH, motilidade, vigor, concentração e alterações morfológicas. As coletas de sêmen foram realizadas em 2 ciclos. No primeiro ciclo foram realizadas a padronização da técnica de coleta de sêmen e a determinação do melhor meio hipo-osmótico, por meio de oito soluções. No segundo ciclo de coletas aplicou-se as técnicas já padronizadas; descreveu-se a motilidade e vigor espermático de amostras seminais diluídas em meios para sêmen de peru, TCM 199, TQC e solução fisiológica, refrigeradas por até 48h; além de terem sido realizadas IA em 128 fêmeas utilizando sêmen de 32 machos, os animais foram agrupados em quintetos (1 macho:4 fêmeas) no início do ciclo reprodutivo de 2004-2005. Metade dos quintetos foi mantida no sistema de monta natural e empregada como grupo controle (GC). A outra metade foi mantida em quintetos por apenas 2 meses. Em seguida, retirou-se os machos dos boxes das fêmeas, para formar os grupos inseminados (GI), cada um com uma dose inseminante de 10, 20, 30 ou 40x106sptz. No primeiro ciclo padronizou-se o método de coleta, no segundo empregou-se a técnica padronizada e os valores encontrados para a média e erro padrão da média de 231 amostras para volume, aspecto, motilidade, vigor, pH e concentração espermática foram: 23,59&plusmn;1,30&micro; l; 1,81&plusmn;0,03; 73,06&plusmn;1,41%; 3,06&plusmn;0,08; 8&plusmn;0; 5,25&plusmn;0,74x109sptz/ml; respectivamente. A motilidade correlacionou positivamente com a porcentagem média de células normais (r=0,4; p&lt;0,0001) e negativamente com as porcentagens de defeitos totais e de cabeça solta (r=-0,4; p&lt;0,0001). A porcentagem de caudas enroladas nas soluções hipo-osmóticas testadas variaram de 73,25&plusmn;3,3 a 84,52&plusmn;2,21%. A solução hipo-osmótica de 100mOsm demonstrou ser adequada e foi empregada em 81 amostras, resultando em 82,0&plusmn;1,38% de espermatozóides com membrana íntegra, gerando uma correlação positiva (r=0,4; p&lt;0,0002) entre esta variável e a motilidade. As amostras seminais diluídas em solução fisiológica não apresentaram motilidade e vigor após refrigeração, diferente das demais. As amostras refrigeradas por 24 e 48h em TCM 199 apresentaram melhores resultados de motilidade e vigor do que as que permaneceram no diluidor para sêmen de peru e TQC. Não foi possível observar diferenças estatísticas significantes entre os resultados da comparação dos índices reprodutivos entre GI e GC, porém os valores médios de ovos férteis obtidos no sistema de monta natural (2,22&plusmn;0,29) foram menores do que os grupos inseminados com 30 (4,44&plusmn;1,81) e 40x106sptz/dose inseminante (3,65&plusmn;1,66). Os resultados do presente experimento permitiram concluir que é possível a coleta e avaliação de sêmen de perdizes para o posterior emprego de biotecnologias tais como a inseminação artificial, sendo que esta pode ser utilizada a curtíssimo prazo, com a finalidade de aumentar a produção e melhorar o manejo genético deste animal. / The partridge (Rhynchotus rufescens) belongs to the tinamidae family and possesses breast muscles which are quite appreciated in high cuisine However, there is an insignificant large scale production, which could be improved using the artificial insemination (AI). The present experiment aimed to standardize semen collection and the hipoosmotic swelling test and to test dilutors, refrigeration times and insemination doses in partridges. Semen samples of 100 animals, belonging to the FCAV/UNESP/Jaboticabal, were used to describe the volume, pH, motility, vigor, concentration and morphologic alterations. Semen collections were performed in 2 stages. The first stage consisted of standardizing the technique of semen collection and of verifying the most adequate hipoosmotic medium (8 different osmolarities). In the second stage, the standardized techniques were applied; motility and vigor were evaluated in samples diluted in turkey semen extender, TCM 199, TQC and physiologic saline solution, refrigerated until 48 hours. Still in the second stage, 128 females and 32 males were allocated in groups of 5 (1 male:4 females) in the beginning of 2004-2005 reproductive season. Half of the quintets were bred using natural service (control group - CG); the other half was kept as quintets for 2 months, after which males were removed and allocated in quartets with no physical contact with the females. The females of this group were then inseminated (inseminated group ? IG) with 10, 20, 30 e 40x106sptz/ insemination dose. In the first experimental stage, 231 samples were evaluated for volume, aspect, motility, vigor, pH e sperm concentration with values averaging 23.59&plusmn;1.30&micro;l, 1.81&plusmn;0.03, 73.06&plusmn;1.41%, 3.06&plusmn;0.08; 8&plusmn;0; 5.25&plusmn;0.74x109sptz/ml, respectively. Motility was positively correlated with percentage of normal cells (r=0.4; p&lt;0.0001) and negatively correlated with the percentages of total sperm defects (r=-0.4; p&lt;0.0001) and detached head (r=-0.4; p&lt;0.0001). Percentage of swollen tails in the hipoosmotic solutions ranged from 73.25&plusmn;3.3 a 84.52&plusmn;2.21%. The solution of 100mOsm was the most adequate, being used in 81 samples, which averaged 82.0&plusmn;1.38% of sperm cells with intact membrane. A positive correlation (r=0.4; p&lt;0.0002) was found between the percentage of cells with intact membrane and motility. Neither motility or vigor were observed in samples diluted in physiologic saline solution, different for the other tested solutions. After both 24 and 48 hours of refrigeration, TCM 199 showed the highest results of motility and vigor when compared to the turkey extender and the TQC. No differences on the general reproductive indexes were found between animals from IG or CG. However, mean values of fertile eggs from CG (2.22&plusmn;0.29) were lower (p&lt;0.05) than groups inseminated with 30 (4.44&plusmn;1.81) and 40x106sptz/insemination dose (3.65&plusmn;1.66). Results allowed to infer that the techniques of semen collection and evaluation in partridges standardized in the present experiment may be used in a short term period for reproductive technologies such as artificial insemination, which could increase the production and improve the genetic management of these animals.

A inseminação artificial em caninos representa uma atividade importante no manejo reprodutivo desta espécie. O uso de sêmen resfriado, preservado por um determinado espaço de tempo, com a conservação da viabilidade espermática torna-se indispensável. Para a preservação a 4ºC torna-se necessário o conhecimento de curvas de resfriamento mais adequadas para um determinado diluente a ser utilizado. No presente experimento foram utilizados 11 cães adultos, dos quais foram colhidos 5 ejaculados de cada e que após exame imediato avaliando aspecto, volume, motilidade, vigor, concentração, HOST (teste hiposmótico), IME (integridade de membrana) e formas patológicas, foram submetidos a diluição com tris-gema. Após a diluição os ejaculados foram novamente avaliados quanto à motilidade, vigor, HOST e IME. Foram iniciados dois procedimentos de refrigeração dos ejaculados fracionados, um a uma velocidade de -0,1ºC/minuto e outro a -0,3ºC/minuto. Vinte quatro e quarenta e oito horas após foram avaliados motilidade e vigor nas duas amostras. Os exames de HOST e IME foram realizados após quarenta e oito horas de resfriamento. Diferenças quanto à qualidade do sêmen dos diferentes cães foram encontradas. Quanto as diferentes velocidade de resfriamento não foram observadas diferenças. Foram constatadas diferenças na qualidade do sêmen recém diluído e após o resfriamento, porém a qualidade do sêmen se manteve inalterada entre vinte e quatro e quarenta e oito horas após o resfriamento. / The artificial insemination in canines represents an important activity in reproductive management of this species. The use of chilled semen, preserved for a determined amount of time, with conserved spermatic viability has become a necessity. For the preservation at 4o C it has become necessary to know the most adequate chilling curve for the chosen extender. In this experiment, 11 adult dogs were used, who each contributed 5 ejaculates which were immediately examined for volume, motility, vigor, concentration, HOST (hyposmotic test), IME (membrane integrity) and pathological forms, and then diluted with tris-egg yolk. The ejaculates were mixed with extender then evaluated for motility, vigor, HOST and IME. Two cooling procedures were started on the fractionate ejaculates, one at a velocity of -0.1oC per minute and the other at -0.3oC per minute. Twenty-four and fortyeight hours later the two samples were evaluated for motility and vigor. The HOST and IME exams were performed forty-eight hours after chilling. Differences in semen quality were found between the different dogs. There were no differences with the two cooling rates. Differences were found in semen quality right after dilution and after the colling process; however semen quality shows no difference between twenty-four and forty-eight hours after chilling.