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Na espécie equina, ao contrário do obtido com ruminantes, as técnicas de criopreservação de sêmen progridem lentamente, mas apesar das barreiras técnicas o emprego da inseminação artificial com sêmen congelado vem crescendo. Este experimento foi dividido em três etapas: na primeira comparou-se a utilização de diferentes diluentes e técnicas de congelação; determinação da eficiência do criotubo para envase do sêmen para a criopreservação; e na terceira determinou-se as taxas de prenhez das éguas artificialmente inseminadas com sêmen congelado envasado em criotubo. Seis garanhões foram submetidos à coleta do sêmen e doze éguas foram inseminadas artificialmente no primeiro estro da estação reprodutiva. As amostras foram diluídas em INRA82 ou Nagase, contendo 5% de glicerol, com concentração de 200 x 106 espermatozóides/ml. Parte do sêmen diluído foi envasado em palhetas (0,5ml), das quais uma parte foi imediatamente congelada. As palhetas restantes foram resfriadas previamente da temperatura ambiente (24ºC) até 5ºC antes do congelamento. As amostras foram descongeladas em banho-maria a 37ºC por 30seg. O mesmo protocolo de congelamento com resfriamento prévio foi realizado com as amostras envasadas em criotubos, sendo estas amostras descongeladas a 50ºC por 100seg em banho-maria. A eficiência in vivo do sêmen criopreservado, foi determinada através da inseminação artificial. O diagnóstico de prenhez foi realizado 20 dias após a inseminação artificial através de exame ultrassonográfico. Após a análise dos dados verificou-se que não houve diferença significativa entre os diluentes testados na motilidade progressiva e vigor dos espermatozóides. As médias da motilidade espermática após o aquecimento das amostras foram de: 43,32% e 26,66%, para o sêmen diluído com INRA82 submetido ao resfriamento ou não antes do congelamento, respectivamente, e para o sêmen diluído com Nagase revelou motilidade espermática de 41,08% e 24,44%, respectivamente. De acordo com esses resultados, os grupos experimentais submetidos ao resfriamento prévio apresentaram taxas de motilidade espermática superiores aos grupos que foram congelados diretamente. Não se verificou diferenças quanto ao vigor, motilidade e defeitos espermáticos entre os diluentes testados e os tipos de envase. As éguas inseminadas com criotubo apresentaram taxa de prenhez de 50% (3/6), já com as éguas do grupo controle (palheta) observou-se 16,66% (1/6), provando a viabilidade do congelamento do sêmen envasado em criotubo. / In the horse industry, unlike obtained with catle, the development of sperm cryopreservation techniques are very slow but despite the technical barriers the artificial insemination with frozen semen is growing. This experiment was divided into three steps. The first one compared the use of different diluents and freezing techniques. The other two stages were the use of cryogenic tubes for filling the semen and the determination of mare pregnancy rates that were artificially inseminated with frozen semen packaged in cryogenic tubes. Six stallions were submitted to semen collection and twelve mares were artificially inseminated at first estrus of the breeding season. The samples were diluted in INRA82 or Nagase, containing 5% glycerol, with a concentration of 200 x 106 sperm / ml. A fraction of the diluted semen was stored in straws (0.5 ml), some of those straws were immediately frozen. The remaining straws were cooled from room temperature (24ºC) to 5º C before freezing. The samples were thawed in a water bath at 37° C during 30sec. The same protocol with cooling prior to freezing was performed with samples filled into cryogenic tubes, and these samples were thawed in a water bath at 50° C during 100seg. The in vivo efficiency of cryopreserved semen was determined through artificial insemination. The diagnosis of pregnancy was performed after 20 days by ultrasound examination. After analyzing the data it was found that there was no significant difference in sperm motility and vigor among the tested diluents. Motility was INRA82: 43.32% / 26.66% and Nagase: 41.08% / 24.44%, when the semen was previously cooled or frozen directly, respectively. According to these results, the experimental groups subjected to cooling prior freezing showed better motility rates than the groups that were frozen directly. There were no differences regarding the vigor, motility and sperm defects among the diluents and the semen containers. The mares inseminated with cryotubes showed 50% (3/6) pregnancy rate, and 16.66% (1/6) pregnancy rate was observed in the group of mares inseminated with straws.

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil proteico do plasma seminal equino utilizando eletroforese bidimensional de gel de acrilamida (2D-PAGE) e determinar se algumas das proteínas presentes estavam relacionadas com a congelabilidade do sêmen. O plasma seminal foi coletado de dez garanhões, de alta e baixa congelabilidade de sêmen, provenientes do Haras Estatal da Baixa Saxônia, na cidade de Celle, na Alemanha e rotineiramente utilizados em programas de inseminação artificial. Vinte e cinco bandas proteicas foram encontradas nos géis bidimensionais (12%) e sete delas foram identificadas por MALDI-MS. Das 25 proteínas encontradas nas amostras de plasma seminal dos garanhões, duas bandas proteicas apresentaram densidade óptica superior (P<0,05) nas amostras de garanhões de alta congelabilidade o sêmen: as bandas 5 (80-85 kDa, pI 7,54), que foi identificada como CRISP3 e a 45 (18,2 kDa, pI 5,0-5,2) identificada como HSP-2. Contrariamente a banda 7 (75,4 kDa, pI 6,9 – 7,4), identificada como lactoferrina, a 15 (26,7 kDa, pI 5,51) identificada como calicreína, a 25 (25 kDa, pI 7,54) como CRISP3 e a 35 (13,9 kDa, pI 3,8 – 4,2) que foi identificada como HSP-1, apresentaram valores de densidade óptica superior (P<0,05) nos reprodutores de baixa congelabilidade do sêmen. As proteínas foram identificadas através de espectometria de massa MALDI-MS. As evidências encontradas neste experimento mostram que existem diferenças no perfil proteico dos reprodutores de alta e baixa congelabilidade do sêmen, sugerindo as proteínas CRISP3 e a HSP-2 como possíveis marcadores da alta congelabilidade de sêmen de garanhões. / The objective of this study was to evaluate protein profile of equine seminal plasma using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to find if any of these proteins were related to semen freezability. Seminal plasma was collected from 10 stallions of high and low semen freezability routinely used in AI programs from the State Stud of Lower Saxony and Artificial Insemination Center. Twenty five protein spots were identified from the 2 D gel (12%), seven of which were present in all samples. Of the 25 proteins found in the research stallions, two spots showed superior relative content (P<0.05) in seminal plasma samples collected from stallions with high semen freezability: the spots 5 (80-85 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 45 (18.2 kDa, pI 5.0-5.2) was identified as HSP-2. Conversely, the spot 7 (75.4 kDa, pI 6.9 – 7.4) was identified as lactoferrin, 15 (26.7 kDa, pI 5.51) was identified as kallikrein, 25 (25 kDa, pI 7.54) was identified as CRISP3 and 35 (13.9 kDa, pI 3.8 – 4.2) was identified as HSP-1, showed superior relative protein content (P<0.05) on seminal plasma samples from stallions with low semen freezability. The proteins were identified by MALDI-MS. There were differences in the seminal plasma protein profile between stallions with high and low semen freezability. It may be suggested that CRISP3 and HSP-2 may be considered possible seminal plasma markers of high semen freezability.

A inseminação artificial intracervical superficial em ovinos é uma técnica simples, de baixo custo e eficiente no emprego do sêmen fresco. Por outro lado, particularidades do aparelho reprodutivo da fêmea ovina, a quantidade de células espermáticas que sobrevivem ao pós-congelamento bem como a capacitação precoce de espermatozóides durante o processo de criopreservação, impedem o emprego desta técnica com sêmen criopreservado, fazendo-se necessária a deposição intrauterina, com auxílio da laparoscopia. Desconhece-se a eficiência da inseminação artificial intracervical superficial em ovinos, empregando-se sêmen criopreservado e capacitado in vitro. O experimento foi realizado com objetivo de determinar as taxas de prenhez com o sêmen criopreservado e capacitado in vitro. Os animais foram divididos aleatoriamente em 5 grupos: sêmen fresco (SF); sêmen congelado cervical (SCC); sêmen congelado laparoscopia (SCL); sêmen congelado capacitado cervical (SCCC); e sêmen congelado capacitado laparoscopia (SCCL). Todas as fêmeas receberam doses inseminantes com concentração de 200x106 sptz. As inseminações ocorreram em um período de 52 a 60 horas após a retirada dos dispositivos de progesterona. Os diagnósticos de prenhez foram realizados com auxílio da ultrassonografia 30 dias após as inseminações. As taxas de prenhez observadas foram: No grupo SF 42,30% (11/26), SCC 23,07% (6/26), SCL 54,16% (13/24), SCCC 25,92% (7/27), SCCL 48,14% (13/27), não existindo diferença estatística entre os grupos experimentais. O experimento realizado mostrou que é possível obter prenhez, empregando sêmen criopreservado e capacitado in vitro, na inseminação artificial pela via cervical em ovinos. / The superficial intracervical insemination in sheep is a simple, low cost and efficient technique using fresh semen. Still, the particularities of the female tract, the amount of sperm cells wich survive and the early capacitation during the cryopreservation process, difficult the use of this technique with cryopreserved semen, maaing it's necessary to intrauterine with the aid of laparoscopy. It's unanown the efficiency of superficial intracervical insemination in ovine, using cryopreserved and in vitro capacitated semen. The experiment was carried out with the objective to determine the pregnancy rate of ewes inseminated with cryopreserved and in vitro capacitated semen. The females were randomly distributed among five experimental groups: fresh semen (SF), frozen semen cervical (SCC), frozen semen laparoscopy (SCL), frozen semen in vitro capacitated cervical (SCCC), frozen semen in vitro capacitated laparoscopy (SCCL). All females received dosis with 00x106sptz per insemination. The inseminations were performed from to 60 hours after the withdrawal of progesterone implants. The pregnancy diagnosis was conducted by ultrasongraphy 30 days after inseminations. The observed pregnancy rates was: SF ,30% (113 6), SCC 3,07% (63 6), SCL ,16% (133 ) SCCC %, SCCL 4,1 % (133 7). our experiment showed that in sheep it's viable the superficial cervical artificial insemination using cryopreserved and in vitro capacitated semen.

A inseminação artificial em caninos representa uma atividade importante no manejo reprodutivo desta espécie. O uso de sêmen resfriado, preservado por um determinado espaço de tempo, com a conservação da viabilidade espermática torna-se indispensável. Para a preservação a 4ºC torna-se necessário o conhecimento de curvas de resfriamento mais adequadas para um determinado diluente a ser utilizado. No presente experimento foram utilizados 11 cães adultos, dos quais foram colhidos 5 ejaculados de cada e que após exame imediato avaliando aspecto, volume, motilidade, vigor, concentração, HOST (teste hiposmótico), IME (integridade de membrana) e formas patológicas, foram submetidos a diluição com tris-gema. Após a diluição os ejaculados foram novamente avaliados quanto à motilidade, vigor, HOST e IME. Foram iniciados dois procedimentos de refrigeração dos ejaculados fracionados, um a uma velocidade de -0,1ºC/minuto e outro a -0,3ºC/minuto. Vinte quatro e quarenta e oito horas após foram avaliados motilidade e vigor nas duas amostras. Os exames de HOST e IME foram realizados após quarenta e oito horas de resfriamento. Diferenças quanto à qualidade do sêmen dos diferentes cães foram encontradas. Quanto as diferentes velocidade de resfriamento não foram observadas diferenças. Foram constatadas diferenças na qualidade do sêmen recém diluído e após o resfriamento, porém a qualidade do sêmen se manteve inalterada entre vinte e quatro e quarenta e oito horas após o resfriamento. / The artificial insemination in canines represents an important activity in reproductive management of this species. The use of chilled semen, preserved for a determined amount of time, with conserved spermatic viability has become a necessity. For the preservation at 4o C it has become necessary to know the most adequate chilling curve for the chosen extender. In this experiment, 11 adult dogs were used, who each contributed 5 ejaculates which were immediately examined for volume, motility, vigor, concentration, HOST (hyposmotic test), IME (membrane integrity) and pathological forms, and then diluted with tris-egg yolk. The ejaculates were mixed with extender then evaluated for motility, vigor, HOST and IME. Two cooling procedures were started on the fractionate ejaculates, one at a velocity of -0.1oC per minute and the other at -0.3oC per minute. Twenty-four and fortyeight hours later the two samples were evaluated for motility and vigor. The HOST and IME exams were performed forty-eight hours after chilling. Differences in semen quality were found between the different dogs. There were no differences with the two cooling rates. Differences were found in semen quality right after dilution and after the colling process; however semen quality shows no difference between twenty-four and forty-eight hours after chilling.

Em experimento conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos da concentração da dose de sêmen e o horário da inseminação artificial a tempo pré-fixado, foram utilizadas 516 fêmeas bovinas. Os animais, das raças Aberdeen Angus (Bos taurus) e Braford (Bos taurus 5/8 x Bos indicus 3/8) eram constituídos de 270 novilhas e 246 vacas multíparas. Os animais foram submetidos a um protocolo de sincronização de estros e ovulação através de implante vaginal contendo 250 mg de Acetato de Medroxiprogesterona (MAP) associado a duas aplicações de Benzoato de Estradiol (BE), sendo a primeira de 2 mg IM por ocasião da inserção do implante e a segunda de 1 mg IM vinte e quatro horas após a retirada do mesmo. Quando da remoção do implante foram administrados 500 mcg de Cloprostenol Sódico. As inseminações foram efetuadas às 48, 54 ou 60 horas após a retirada do implante, utilizando para cada momento duas concentrações distintas de espermatozóides viáveis, 10 e 20 milhões por dose. Verificou-se que as fêmeas (em especial as novilhas) inseminadas às 48 horas com 20 milhões de sptz/dose apresentaram índice de prenhez significativamente maior do que as inseminadas no mesmo momento com 10 milhões sptz/dose. As vacas inseminadas com 10 milhões de sptz às 60h apresentaram melhor taxa de prenhez (p<0,05) quando comparadas às inseminadas com 10 milhões de sptz às 48h. O percentual de prenhez encontrado nas vacas foi significativamente maior que o das novilhas, assim como o verificado nas fêmeas Aberdeen Angus, comparadas às Braford. A taxa de prenhez de novilhas inseminadas a tempo fixo pode ser incrementada utilizando-se maior número de espermatozóides viáveis por dose inseminante. / The objective of this study was to analyse the effects of semen concentration and moment of fixed timed insemination on pregnancy rates in 516 beef cattle females of the Aberdeen Angus (Bos taurus) and Braford (Bos taurus 5/8 x Bos indicus 3/8) breeds. The females were constituted of 270 heifers and 246 multiparous cows. The animals were all submitted to a synchronization program consisting of vaginal implants of 250mg of medroxiprogesterone acetate (MPA) associated to application of 2mg IM of estradiol benzoate (EB).After 7 days the implants were removed and 500 mg of cloprostenol were injected at the time. After 24hs of implant removal 1mg IM of EB was injected. The inseminations were done 48, 54 and 60 hours after the removal of the implants and semen with 10 and 20 million viable spermatozoa per dosis was used. The females (specially the heifers) of the group inseminated 48 hours after implant removal and using semen with 20 million viable sptz showed a significant higher percentage of pregnancy than the inseminated 48 hours using 10 million viable sptz. The cows inseminated at 60 hours with 10 million sptz showed higher pregnancy rates (p<0,05) than cows inseminated at 48 hours with 10 million sptz. The total pregnancy rate achieved on the cows was significantly higher than on the heifers. The females of the A. Angus group had higher pregnancy rates than the females of the Braford breed. The pregnancy rate of heifers fixed-timed inseminated can be increased using a higher semen concentration.

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen eqüino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas, pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu- Crio® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio® ,isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. / During semen cryopreservation, sperm cells were submitted to some deleterious events leading to membrane damage which result in fertility decrease. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing rates and the use of two commercial extenders as cryoprotectants (FR-5® and Botu-Crio®) on the total and progressive motility, integrity and functionality of spermatic membranes during the cryopreservation of equine semen. Twenty ejaculates were analyzed. The total and progressive motility of fresh and postthawing semen samples were evaluated by the patterns assays. The function of plasmatic membrane was measured by the hipoosmotic swelling test. The integrity of plasmatic membrane was evaluated using CFDA/PI fluorescent probes. There were significant differences between the two freezing techniques and/or between cryoprotectants for all assessed parameters. The combined used between Botu-Crio® and automated curves showed better results in total and progressive post-thawing motility. The extender Botu-Crio®, alone, showed better results in order to preserve the membrane integrity and function.

Os Triglicerídeos são essenciais para o metabolismo espermático e um alto nível deste está associado com boa qualidade do sêmen. O nível de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) é considerado um elemento crítico para a capacitação espermática e está associada à motilidade espermática e com maior fluidez de membrana. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da alimentação suplementar de garanhões, com óleo de arroz comercial (Gama-Horse, HT Nutri ®, Brasil), em parâmetros espermáticos. Quatro garanhões com idades variando entre 6 e 30 anos foram utilizados. Os animais tiveram o mesmo manejo durante os 190 dias de tratamento. O experimento foi dividido em três períodos: pré-tratamento (PT) - 30 dias para a estabilização das reservas espermáticas; tratamento (TR) - 80 dias de suplementação com 200 ml de óleo arroz contendo 34% ácido linolêico, 1% ácido linolênico, 1% gama-oryzanol e 660mg/Kg vitamina E; controle (CN) - 80 dias sem suplementação de óleo de arroz. Ejaculados foram coletados duas vezes por semana com uma vagina artificial. As avaliações do sêmen foram realizadas imediatamente após a colheita, sendo avaliados volume, concentração, motilidade total, funcionalidade (HOST) e integridade (CFDA / PI) da membrana e potencial antioxidante total (TRAP). Uma amostra de sangue foi obtida cada 15 dias para avaliar testosterona e estradiol plasmáticos. Para avaliar o efeito da suplementação de óleo de arroz no sêmen os dados dos últimos 20 dias a partir da TR com os últimos 20 dias a partir da CN foram analisados com ANOVA, com uma significância estatística de P < 0,05. A suplementação do óleo de arroz aumentou a concentração (P < 0,01) (TR: 226 x 106/mL; NC: 172 x 106/mL), motilidade total (P < 0,01) (TR: 59%; NC: 42%), HOST (P < 0,02) (TR: 73%; NC: 69%) e TRAP (P < 0,01) (TR: 1,9 nmol Trolox / mg de proteína; CN: 0,98 nmol Trolox / mg de proteína). Não foram observadas diferenças entre os períodos TR e CN em volume, integridade de membrana, testosterona e estradiol. A suplementação oral com o óleo de arroz comercial contendo PUFA e gama-oryzanol aumentou o potencial antioxidante total do sêmen. Além disso, foi detectado uma maior funcionalidade de membrana, provavelmente devido a defesa antioxidante evitando peroxidação lipídica da membrana espermática ou a uma melhoria da fluidez da membrana. / Triglycerides are essential for sperm metabolism and a high level of triglycerides is associated with good semen quality. The level of polyunsaturated fatty acids (PUFA) is considered a critical feature for capacitation and is associated with sperm motility and with increased membrane fluidity. The aim of this experiment was to evaluate the effects of the supplementary feeding of stallions, with commercial rice oil (Gama- Horse, HT Nutri®, Brazil), on sperm parameters. Four stallions with ages ranging between 6 and 30 years were used. The animals had the same management during the 190 days of trial. The experiment was divided in three periods: pre-treatment (PT) - 30 days to sperm reserves stabilization; treatment (TR) - 80 days supplementation with 200 mL rice oil containing 34% linoleic acid, 1% linolenic acid, 1% gamma oryzanol and 660mg/Kg vitamin E; control (CN) - 80 days without rice oil supplementation. Ejaculates were collected twice a week with an artificial vagina. Semen exams were performed immediately after collection, being evaluated volume, concentration, total motility, functionality (HOST) and integrity (CFDA/PI) of membrane and total antioxidant potential (TRAP). A blood sample was obtained each 15 days to evaluate plasma testosterone and estradiol. To evaluate the effect of the rice oil supplementation the semen data from the last 20 days from TR with the last 20 days from CN were analyzed with ANOVA, with a statistical significance from 0.05. The supplementation of rice oil increased concentration (P < 0.01) (TR: 226 x 106/mL; CN: 172 x 106/mL), total motility (P < 0.01) (TR: 59%; CN: 42%), HOST (P < 0.02) (TR: 73%; CN: 69%) and TRAP (P < 0.01) (TR: 1.9 nmol Trolox/mg of protein; CN: 0.98 nmol Trolox/mg of protein). No differences among periods TR and CN were observed in volume, membrane integrity, testosterone and estradiol. Oral supplementation with the commercial rice oil containing PUFA and gamma-oryzanol increased the total antioxidant potential of the semen. In addition, a higher membrane functionality and motility was detected, probably due to antioxidant protection avoiding lipid peroxidation of sperm membrane or to a improved membrane fluidity.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 549736 bytes, checksum: 94f356a8e6012cc38a152d4e5b05791a (MD5) Previous issue date: 2007-04-20 / The objective of the present study was to evaluate the effect on the freezability of equine semen with the addition of glycerol in 0, 35 and 60 minutes the cooling period. Semen from two adult stallions (Mangalarga Marchador) were used, totalizing 11 colections of semen. The evaluation consisted of sperm progressive straight motility, total motility, sperm vigor, live/death cells (supravital), functional integrity of sperm plasma membrane (Hyposmotic Swelling test - Host) and sperm morphology analyses in the semen in natura , before and after freezing the semen. Each collected semen was divided in three treatments. T1: addition of the cryoprotector occurred before the cooling; T2: addition occurred after 35 minutes of the cooling; T3: the addition occurred immediately before the freezing, to the 60 minutes of cooling. After the minimum frozen period of 12 days, the semen samples had been thawed at 75º C per 7 seconds. The thawed samples had remained for 120 minutes at 38º C for longevity evaluation. Differences (P < 0.05) among the animals used in the experiment, were noted in sperm morphology. One of the stallions showed average values of abnormal sperms bellow of the praised standards. No relations (P > 0.05) were registered among average values of the morphology test, supravital test and Host in semen in natura . The supravital test showed relation (P < 0.05) only with the sperm vigor in the analysis of the semen in natura . No differences (P > 0.05) were registered among physical analyses, in the Host, supravital test, the morphologic analysis and in the evaluation of longevity in the frozen/thaw semen of three considered protocols. These results suggest that the time of balance between the semen and glycerol does not affect the quality and the longevity of the semen. Seminal qualities had been considered impracticable in fertility terms, after 60 minutes of incubation on longevity test. The supravital test of the frozen/thawed semen showed relation with the progressive sperm motility (r = 0.81) and sperm vigor (r = 0.64) in the 3 considered trataments. The values of the Host used in this experiment were satisfactory due the large reaction of the spermatozoa when in contact with the hyposmotic solutions, however this test did not show relations (P > 0.05) with the sperm physical parameters. The physical parameters of the semen before cooling did not present relation (P > 0.05) with the physical parameters and with supravital test of frozen/thaw sperm. The no significant relations among the different tests used in this study, suggests that the information of these tests are used under different aspects, ratifying the complementary character of the same ones. / O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição do glicerol em tempo 0, 35 e 60 minutos de resfriamento sobre a congelabilidade do sêmen equino. Foram utilizados 2 garanhões adultos da raça Mangalarga Marchador, totalizando 11 ejaculados. Foram avaliadas a motilidade espermática progressiva total e retilínea, vigor espermático, percentual de células vivas e mortas (supravital), integridade funcional de membrana (Hiposmótico) e morfologia espermática no sêmen in natura , pré e pós congelamento. Cada ejaculado foi dividido em três tratamentos. T1: adição do crioprotetor ocorreu antes do resfriamento; T2: adição ocorreu aos 35 minutos de resfriamento; T3: a adição ocorreu imediatamente antes do congelamento, aos 60 minutos de resfriamento. Após o período mínimo de 12 dias de congelados, as amostras de sêmen foram descongeladas a 75º C por 7 segundos. As amostras descongeladas permaneceram por 120 minutos incubadas a 38º C para avaliação de longevidade pelo teste de termoresistência. Foram registradas diferenças (P < 0,05) entre as alterações de morfologia espermática entre os animais utilizados no experimento, sendo que no garanhão 2 os valores médios estavam acima dos padrões preconizados. Não foram registradas relações (P > 0,05) entre os valores médios dos testes de morfologia, Hiposmótico e supravital na avaliação dos ejaculados. O teste supravital apresentou relação (P < 0,05) apenas com o vigor espermático na análise do sêmen in natura . Não foram registradas diferenças (P > 0,05) entre os valores médios obtidos nas análises físicas, no teste Hiposmótico, no teste supravital, na análise morfológica e na avaliação de longevidade pelo teste de termoresistência entre o sêmen congelado de acordo com os três protocolos propostos. Esses registros sugerem que o tempo de equilíbrio entre o sêmen e o glicerol não interfere na qualidade e na longevidade do sêmen de garanhões. Aos 60 minutos de incubação (TTR), as qualidades seminais foram consideradas inviáveis em termos de fertilidade. O teste supravital do sêmen descongelado apresentou relação com os parâmetros de motilidade espermática progressiva (r = 0,81) e vigor espermático (r = 0,64) independente do tratamento avaliado. Os valores do teste hiposmótico mostraram taxas de espermatozóides reativos satisfatórios, porém não foram registradas relações (P > 0,05) com os parâmetros físicos avaliados. As avaliações físicas do sêmen pré-resfriamento não apresentaram relação (P > 0,05) com os parâmetros físicos e com o teste supravital do sêmen descongelado. As relações não significativas entre os diferentes testes utilizados nesse estudo sugerem que as informações são fornecidas sob diferentes aspectos, ratificando o caráter complementar dos mesmos.