Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se investigó mediante fecundación in vitro, la capacidad de espermatozoides caninos refrigerados a 4 °C y frescos (controles), de atravesar la ZP, y penetrar el citoplasma ovular, de ovocitos de perra en estado inmaduro y madurados in vitro, a través de diferentes tiempos de coincubación gamética. Se trabajó con eyaculados de 5 perros adultos, el semen se obtuvo por estimulación digital, utilizando la segunda fracción espermática. Luego de la evaluación del semen, se retiró el plasma seminal por centrifugación, los espermatozoides utilizados como controles (frescos) fueron resuspendidos en medio Fert TALP y los espermatozoides que se sometieron a refrigeración se resuspendieron en extensor o diluyente en base a TRIS-yema de huevo-ácido cítrico y fueron posteriormente refrigerados a 4 °C, por 24 horas. Posterior a ese tiempo, se retiró el diluyente por centrifugación y el pellet espermático fue resuspendido en medio Fert TALP. Ambos tipos de espermatozoides -frescos y refrigerados- fueron coincubados con ovocitos de perra tanto inmaduros como madurados in vitro, en forma separada. Los ovocitos utilizados provinieron de ovarios macerados, obtenidos previamente por ovariectomía. Los ovocitos fueron seleccionados bajo la lupa estereoscópica y lavados en PBS. Posteriormente, los utilizados en estado inmaduro se ambientaron en medio de coincubación Fert TALP y luego se coincubaron con espermatozoides frescos o refrigerados. Los ovocitos que se sometieron a maduración in vitro fueron incubados en medio TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de hCG, 2.5 μl/mL de solución piruvato y 5 μl/mL de solución antibiótica por 72 y 96 horas. Posteriormente fueron coincubados separadamente con ambos tipos de espermatozoides. La coincubación gamética se realizó por períodos de 1 a 10 horas en medio Fert TALP. Cada hora de incubación se retiraron ovocitos, se fijaron en una solución en base a ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3) por 72 horas a 4 °C y teñidas con 0,1% de Yoduro de Propidio para la 4 posterior evaluación de la penetración espermática y fecundación en microscopia de epifluorecencia. Un ovocito penetrado se determinó cuando se encontró espermatozoides en zona pelúcida (ZP), en espacio perivitelino (PV) o en el citoplasma ovular (C). Se utilizó análisis de varianza y de regresión para determinar diferencias en los diferentes parámetros estudiados. Se evaluaron un total de 3391 ovocitos inmaduros (n= 1765) y madurados in vitro (n= 1626). La penetración espermática fue directamente proporcional al tiempo de coincubación. El aumento del porcentaje de penetración total con espermatozoides frescos fue significativo a partir de las 3 horas en ovocitos inmaduros y 2 horas en ovocitos madurados in vitro (p< 0,05). Con espermatozoides refrigerados, los ovocitos inmaduros muestran diferencias en la penetración total a partir de las 5 horas de coincubación, en ovocitos madurados in vitro es posible observar diferencias a partir de las 2 horas. Los mayores porcentajes de penetración total se obtuvieron a partir de las 6 y 7 horas de coincubación y hacia finales del cultivo. Los espermatozoides refrigerados tuvieron un menor porcentaje de penetración que los frescos, durante todo el periodo de cultivo, excepto a la primera hora de coincubación con ovocitos madurados in vitro y espermatozoides refrigerados (p<0,05). Los ovocitos madurados in vitro fueron penetrados en mayor proporción que los inmaduros (p< 0,05), considerando todo el periodo de cultivo. Se concluye que al aumentar el tiempo de cultivo, un mayor número espermatozoides logró atravesar las cubiertas ovocitarias. Los ovocitos inmaduros y madurados in vitro son penetrados en mayor porcentaje por espermatozoides frescos respecto a aquellos refrigerados, sin embargo, los espermatozoides sometidos a refrigeración serían capaces de penetrar antes los ovocitos madurados in vitro. No obstante los ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro pueden ser penetrados por espermatozoides caninos frescos y refrigerados, la utilización de ovocitos madurados sería más apropiado para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides frescos y criopreservados. / Proyecto FONDECYT 1030380

A nivel mundial se está dando un fenómeno que cada vez es más común, la infertilidad. En la actualidad la edad es considerada un factor determinante en la calidad seminal, existe una relación directa entre la edad y el aumento del daño en el ADN espermático. El objetivo de este estudio fue evaluar las características seminales en jóvenes universitarios mediante espermatogramas utilizando el sistema computarizado de análisis seminal C.A.S.A (Computer Assisted Sperm Analyzer, ISAS v1.2) para la evaluación morfológica. Se calcularon los estadísticos descriptivos, frecuencias y coeficientes de variación para todos los parámetros seminales procedentes de 30 jóvenes universitarios voluntarios de 18 a 30 años de edad. Con el fin de determinar si los hábitos de los jóvenes consideradas en la investigación tuvieron efecto en alguno de los parámetros seminales se realizó la prueba exacta de Fisher, en el caso de variables nominales, y una prueba de T de student o de U de Mann Whitney, previa verificación de la normalidad con la prueba de Shapiro-Wilk, en el caso de las variables cuantitativas. Todos los análisis se realizaron con un nivel de confianza de 95% en el software SPSS v.21. En conclusión no se encontraron asociaciones significativamente estadísticas entre los hábitos y los distintos parámetros seminales y se determinó que solo los criterios de pH, volumen, vitalidad, motilidad, concentración y recuento total, cumplen con los valores establecido por la Organización Mundial de Salud y la Sociedad Europea de Reproducción Humana y Embriología (ESHRE), a diferencia del 76.7% las muestras seminales que no cumple con los criterios de morfología. Se observó que existían alteraciones morfológicas en la cabeza y la pieza intermedia de los espermatozoides, comparándolo con los valores considerados normales por la OMS se obtuvo que las principales áreas afectadas fueron la longitud, el ancho, el área, la elipticidad y la elongación de la cabeza al igual que el ancho de la pieza intermedia, y al compararlo con los valores de la ESHRE se obtuvo que las principales áreas afectadas fueron el ancho, el área y la elipticidad de la cabeza. Worldwide is taking a phenomenon that is becoming more common, infertility. Today's age is considered a important factor in semen quality, there is a direct relationship between age and the increased damagein DNA sperm. The aim of this study wasto evaluate the seminal characteristics in young students by Spermograms and use a computerized semen analysis C.A.S.A (Computer Assisted Sperm Analyzer, ISAS v1.2) for morphological evaluation Descriptive statistics and frequencies for all semen parameters considered in this study were calculated. The coefficient of variation was calculated by dividing the standard deviation to the average and expressed in percentage. In order to determine whether the habits of young people considered in the investigation had any effec on semen parameters Fisher's exact test was performed, in the case of nominal variables, and student T test or Mann Whitney, after verification of normality with the Shapiro-Wilk test, in the case of quantitative variables. All analyzes were performed with 95% confidence in the SPSS v.21 software In conclusion not significantly statistical associations between the habits and different sperm parameters were found and determined that only the criteria of pH, volume, vitality, motility, concentration and total count, meet values set by the World Health Organization and the European Society of Human Reproduction and Embryology, unlike 76.7% of young people who do not meet the requirements criteria of morphology. It was found that there were obvious morphological changes in the anatomical parts of the head and the intermediate piece, comparing the valuesconsidered normal by WHO, was obtained that the main affected areas were the length, width, area, ellipticity and elongation of the head as the width of the intermediate piece, and when compared with the valuesthat were obtained ESHRE relevant affected areas were the wide area and the ellipticity of the head.

Determina si la menor exposición al semen paterno es un factor de riesgo de preeclampsia en pacientes obstétricas del Instituto Nacional Materno Perinatal durante los meses de febrero y marzo del 2016. Es un estudio analítico, observacional y tipo caso control. Participan 75 pacientes con preeclampsia y 75 pacientes sin preeclampsia, un total de 150 pacientes obstétricas provenientes del servicio de hospitalización. Revisa las historias clínicas y la realiza entrevistas estructuradas. Para describir las variables presenta medidas de tendencia central y dispersión para las variables cuantitativas y frecuencias y porcentajes para las cualitativas. Calcula OR e intervalo de confianza al 95%. Ejecuta un análisis bivariado y un análisis de regresión logística multivariado. Encuentra que el 78,7% de pacientes preeclámpticas conviven más de 10 años con su pareja, mientras que el grupo de pacientes normotensas lo presenta en un 72%. En cuanto a la frecuencia de relaciones sexuales el 54,7% del grupo casos refiere una frecuencia de 3 veces o más por semana, comparada con el 44% del grupo control. Además, el 86,7% de pacientes con preeclampsia y el 84% del grupo control tienen un tiempo de actividad sexual con su pareja por más de 10 años. En cuanto al número de exposiciones al semen paterno, el OR presenta preeclampsia en el cuartil de 104 a 312 exposiciones comparado con el más alto cuartil de exposiciones al semen paterno que es de 0,37 con un intervalo de confianza al 95% de 0,15 – 0,93, lo que muestra una relación estadísticamente significativa. Se observa en el análisis multivariado, ajustando factores de confusión, que no existe asociación significativa entre el número de exposiciones al semen paterno y el desarrollo de preeclampsia (OR ajustado de 0,53; IC del 95%: 0,20-1,39). Concluye que la menor exposición al semen paterno no constituye un factor de riesgo de preeclampsia en las pacientes obstétricas del Instituto Nacional Materno Perinatal durante el periodo comprendido entre febrero y marzo del 2016.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en la actividad enzimática de acrosina en espermatozoides refrigerados de perro a través de dos métodos de evaluación: digestión de gelatina en placa y la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE) a través de espectrofotometría. La obtención de semen se realizó a 4 perros adultos sanos, mediante estimulación digital del pene, utilizando sólo la fracción espermática de cada eyaculado. El volumen, la motilidad y la concentración espermática se evaluaron de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. El trabajo se realizó con semen fresco (control) y semen refrigerado proveniente de los mismos machos. Las muestras obtenidas fueron incubadas a temperatura ambiente con medio Fert Talp durante diferentes tiempos de capacitación (0, 1, 2 y 3 horas), para inducir la capacitación. Luego de cada tiempo de capacitación se evaluó la actividad enzimática de acrosina mediante ambas técnicas señaladas. En la digestión de gelatina se midió el tamaño de los halos obtenidos a través de un microscopio de contraste de fase, obteniendo un promedio de los tamaños de cada tiempo. Mediante la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), se midió la actividad de acrosina a través de la absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro. Se realizaron 4 replicas experimentales y los resultados obtenidos se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se observó que la actividad enzimática de acrosina de los espermatozoides refrigerados, medida a través del tamaño de los halos de digestión de gelatina, no mostró variaciones estadísticas durante los diferentes tiempos de incubación (p > 0,05). Mientras que los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad durante el tiempo 1 (p < 0,05). Al medir la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), no se observó en los espermatozoides refrigerados diferencias entre los tiempos de incubación (p > 0,05). Sin embargo, los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad a la primera hora de incubación (p < 0,05). Al comparar la actividad enzimática de la acrosina de los espermatozoides refrigerados y frescos, no se observaron diferencias (p > 0,05) en los diferentes tiempos de incubación, tanto en su actividad proteolítica de gelatina como en espectrofotometría con BAEE. Esto podría indicar que el daño o alteraciones sufridas por los espermatozoides refrigerados, durante el proceso de criopreservación, no produciría un cambio significativo en la actividad de acrosina / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Studies have highlighted a growing national problem regarding the number of untested Sexual Assault Kits (SAKs). A 2011 National Institute of Justice report revealed Los Angeles alone had 10,000 untested SAKs. This backlog has fueled the need for specific and efficient testing of SAK evidence. In traditional workflows, serology tests are used to indicate the presence of a targeted bodily fluid and prioritize samples for genetic analysis. However, given the lack of sensitivity and specificity of modern serological assays, current SAK workflows often skip serological identification altogether for a “direct to DNA” approach. While these Y-Screen workflows achieve rapid screening of samples for the presence of a detectible male contributor, they do not provide any serological information. As a result, samples lack what can be critical investigative context. Improved serological capabilities with enhanced sensitivity and specificity would provide greater confidence in results for the confirmatory identification of seminal fluid. At a minimum, forensic biologists should understand the limitations associated with traditional serological approaches to seminal fluid identification when processing SAK samples. Current serological techniques based on antigen-antibody binding have exhibited both sensitivity and specificity limitations. False positive results for semen can be obtained by non-target biological fluids such as breast milk, urine, and vaginal fluid, or by non-specific binding events. This study evaluates a promising emerging technique that combines high specificity protein biomarker detection with targeted mass spectrometry. This research targeted human-specific peptide markers for seminal fluid proteins and peptide standards to perform quantification of seminal fluid peptide targets using an Agilent 6495 mass spectrometer coupled to a 1290 series liquid chromatograph. This approach has shown to be both more specific and sensitive in identifying a bodily fluid compared to current immunological based approaches. Thus, this proteomic workflow was used to evaluate authentic false positive rates of current immunochromatographic techniques for seminal fluid identification. Self-collected vaginal swabs collected from participants not engaging in barrier-free vaginal intercourse with male partners were tested using various immunochromatographic assays designed to detect both semenogelin (Sg) (RSID™-Semen) and prostate specific antigen (PSA) (ABAcard® p30 Test and SERATEC® PSA Semiquant). Similarly, three seminal fluid biomarkers (semenogelin 1, semenogelin 2, and prostate specific antigen) were used for seminal fluid identification via mass spectrometry. Any samples producing positive results on any immunochromatographic assay were evaluated to determine whether the target protein was actually present at levels above the reported sensitivity limits of the lateral flow tests. Additionally, Sperm HY-LITER™ Express was used to microscopically confirm the absence of spermatozoa in all samples producing positive immunochromatographic results. In addition to using the quantitative proteomic assay to estimate the rate of authentic false positive results associated with lateral flow assays, this research sought to establish the correlation (or lack thereof) between absolute quantitation of seminal fluid markers and the ability to successfully generate DNA profiles. Self-collected post-coital swabs from donors engaging in barrier free vaginal intercourse with male partners over varied periods of time between 1-8 days after intercourse were collected. All samples were analyzed using the quantitative seminal fluid protein mass spectrometry assay, once again targeting SgI, SgII, and PSA. Both autosomal STR profiles (GlobalFiler™) and Y-STR profiles (Yfiler™ Plus) were subsequently generated. With regard to immunochromatographic assay false positive rates, a total of 17 false positives for semen were observed (n=150), 14 of which were consistent with PSA and 3 with Sg, for a corresponding total false positive rate of 9.3% and 2%, respectively (11.3% overall). These samples were all confirmed to be sperm negative with mass spectrometry and microscopic analysis. This data supports the use of current immunochromatographic assays for the presumptive detection of seminal fluid while also providing further support for the improved specificity of alternative serological approaches using mass spectrometry identification of biological targets. With regard to the relationship between quantitative levels of target seminal fluid peptides and the ability to generate STR profiles from vaginal swabs collected at various post coital intervals, a total of 61 post-coital samples were tested. Of these, 48 samples had a seminal fluid target greater than the limit of quantitation for the mass spectrometry assay and 26 produced an STR (n=9) and/or Y-STR (n=10) profile. A correlation between peptide quantitation and ability to generate a genetic profile was unable to be determined from this initial sample set. Overall, however, it has been demonstrated that the use of proteomic mass spectrometry for the identification of seminal fluid targets (with its enhanced sensitivity and specificity) would enable forensic practitioners to make better use of serological information during the analysis of challenging sexual assault samples.

Resumo: Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da congelação e do meio sobre as características físicas e químicas do sêmen de 10 reprodutores suínos durante o inverno e o verão. No protocolo utilizado para a congelação seminal, 2 diluentes de congelação foram testados em combinação com 2 diluentes de transporte e refrigeração. Os resultados encontrados demonstraram que os parâmetros de integridade de membranas, morfologia e cinética espermática nos momentos que antecederam a congelação não foram influenciados, de forma geral, pela estação do ano. Apesar do número de células espermáticas totais e o volume do ejaculado terem sido superiores no inverno em relação ao verão, a motilidade progressiva pós-descongelação foi melhor no verão do que no inverno na maior parte dos meios de congelação avaliados. A metodologia de congelação aplicada e os diluentes utilizados mostraram índices de viabilidade espermática do sêmen descongelado sem precedentes e superiores aos encontrados na literatura, independentemente do diluente ou da estação do ano avaliada. Em relação ao perfil químico seminal, apenas os níveis de sódio no sêmen e de cálcio no plasma seminal foram mais elevados durante o verão, devido ao menor volume seminal produzido neste período. As temperaturas e umidades foram evidentemente superiores durante o verão e as concentrações de metabólitos fecais de corticosterona mais elevadas nesta mesma estação, porém estes índices não ocasionaram alterações consistentes na viabilidade do sêmen descongelado dos cachaços. Desta forma, os resultados do presente trabalho indicam que os animais encontram-se adaptados ao ambiente, não apresentando alterações marcantes de suas características seminais de acordo com as condições climáticas / Abstract: This study aimed to evaluate the effect of freezing and environment on physical and chemical characteristics of the semen of 10 breeding pigs during the winter and summer. In the protocol used for the freezing of semen, 2 freezing extenders were tested in combination with 2 diluents for transport and refrigeration. The results show that the parameters of membrane integrity, sperm morphology and kinetics in the moments preceding the freezing were not affected, in general, by the season. Although the number of sperm cells and the total volume of the ejaculate were higher in winter compared to summer, the post-thaw motility was better in summer than in winter in most media tested for freezing. The freezing methodology and the extenders applied showed indices of viability of the thawed sperm unprecedented and higher than those found in the literature, regardless of the diluents or the season assessed. Regarding the chemical seminal profile, only the levels of sodium and calcium in semen in the seminal plasma were higher during the summer due to lower volume seminal produced in this period. Temperatures and humidities were clearly higher during the summer and the concentrations of fecal corticosterone metabolites higher in the same season, but these rates did not cause consistent changes in the viability of frozen-thawed semen of boars. Thus, the present results indicate that the animals are adapted to the environment, showing no marked changes in their semen characteristics according to the season / Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Daniella Jorge de Moura / Banca: Frederico Ozanam Papa / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Aníbal Sant'Anna Moretti / Banca: Rubens Stahlberg / Mestre

La infertilidad en el Perú, actualmente no se encuentra considerada como una enfermedad importante para el ámbito de la salud pública, no obstante, afecta al 15% de la población en edad reproductiva y la demanda de Centros de Reproducción Asistida cada vez aumenta. Se considera que el factor masculino contribuye con el 40% de los casos como factor de infertilidad en la pareja. El análisis clínico del semen aporta al conocimiento de la calidad seminal que pueda presentar, que luego permitirá tratar a los pacientes exitosamente. El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad seminal de pacientes con problemas de fertilidad que asistieron al Centro de Reproducción Humana de Lima (NACER) durante el periodo de Mayo del 2015 hasta Mayo del 2016. La población de estudio estuvo conformada por 150 individuos con edades comprendidas entre 27 y 70 años, a quienes se les realizó un análisis seminal, donde se evaluó parámetros seminales como volumen, viscosidad, pH, vitalidad, concentración y morfología espermática, según el manual del líquido seminal de la Organización Mundial de la Salud en su 5ta edición 2010. Se calcularon los estadísticos descriptivos, frecuencias y medias de las anomalías más frecuentes y se compararon con una condición normal en los parámetros seminales más importantes en fertilidad. Todos los análisis se realizaron con un nivel de confianza de 95% utilizando el programa SPSS versión 23 para Windows 2010, además se realizó una tabla de frecuencias que fue utilizada para obtener gráficos en excel indicando la prevalencia e incidencias de las alteraciones en los espermatogramas realizados. Del total de muestras analizadas el 50.6% presentaron por lo menos un parámetro alterado, mientras que el 49.3% de los casos están sobre los valores de referencia establecidos en la 5ta edición del manual de la OMS (2010). La astenozoospermia fue la anomalía más prevalente en los pacientes con un porcentaje de 28%, seguido de la oligozoospermia e hipospermia con un porcentaje de 19.3% en ambos casos. En las características macroscópicas se encontró que 45 (30%) de los casos evaluados presentaron anormalidades en su consistencia y el 8.6% de los casos estudiados presentaron un cuadro de azoospermia. La presencia de alteraciones como astenozoospermia, oligozoospermia, hipospermia y teratozoospermia refleja la mala calidad seminal poblacional que viene experimentando el hombre en los últimos años.Infertility in Peru is not currently considered an important disease for the field of public health; however, it affects 15% of the reproductive-age population and demand for Assisted Reproduction Centers each time increases. It is considered that the male factor contributes 40% of cases as a factor of infertility in couples. The clinical analysis of semen provides the knowledge of seminal quality that can present, that then it will allow treat patients successfully. The aim of this study was evaluate the semen quality of patients with fertility problems who attended to the Human Reproduction Center of Lima (NACER) during the period May 2015 to May 2016. The study population consisted of 150 individuals with aged between 27 and 70 years who underwent a seminal analysis, where seminal parameters was assessed such as volume, viscosity, pH, vitality, concentration and sperm morphology according to criteria of the World Health Organization (2010). Descriptive statistics, frequencies and media of the most frequent anomalies were calculated and compared with a normal condition in the most important seminal parameters in fertility. All analyzes were performed with a confidence level of 95% using SPSS version 23 for Windows 2010, also it was performed a frequency table that was used for get graphics in excel indicating the prevalence and incidence of alterations in semen analysis made. Of the total samples analyzed 50.6% showed at least one parameter altered, while 49.3% of cases fulfill the benchmarks set out in the 5th edition of the WHO manual (2010). The astenozoospermia was the anomaly most prevalent in the patients studied with a percentage of 28%, followed by oligozoospermia and hipospermia with a percentage of 19.3% each anomaly. In the macroscopic characteristics it found that 45 (30%) of cases evaluated presented abnormalities in consistency and 29% of the cases studied presented azoospermia. The presence of alterations as astenozoospermia, oligozoospermia, hipospermia and Teratozoospermia reflects the decline in semen quality population that man has experienced in recent years.

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Includes bibliographical references (leaves 274-316) Examines several aspects of male reproduction in the sheep, and how these are related to fertility in the female when semen is introduced by natural mating or artificial insemination.

Includes bibliographical references (leaves 274-316) / xxii, 333 leaves : ill. (chiefly col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Examines several aspects of male reproduction in the sheep, and how these are related to fertility in the female when semen is introduced by natural mating or artificial insemination. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Animal Sciences, 1991