O carcinoma do córtex da supra-renal (ACC) é uma neoplasia rara e de prognóstico sombrio. Embora estudos moleculares tenham explorado diversos aspectos relacionados à tumorigênese destas neoplasias, o conhecimento das vias relacionadas à disseminação metastática é restrito. O objetivo do presente estudo é avaliar a expressão de genes relacionados a metástases em uma coorte de pacientes portadores de tumores do córtex da supra-renal metastáticos e não-metastáticos, a fim de identificar vias envolvidas na disseminação metastática destas neoplasias, novos marcadores prognósticos e eventuais alvos terapêuticos. Os perfis de expressão de 27 tumores do córtex da supra-renal de 15 pacientes adultos (8 ACC e 7 adenomas) e 12 pediátricos (5 metastáticos e 7 não-metastáticos) foram avaliados por um array de expressão contendo um painel de 113 genes que sabidamente estão envolvidos no processo de disseminação metastática de diversas neoplasias humanas. A análise de grupamentos mostrou que adenoma dos pacientes adultos forma um grupo distinto dos demais tumores (ACC de adultos e tumores pediátricos). Os genes MMP11e DENR foram identificados como diferencialmente expressos quando se compararam os adenomas e ACC de adultos. Na comparação dos tumores pediátricos nenhum gene foi diferencialmente expresso. Assim como a análise de grupamento, a PCA utilizando grupo selecionado de genes também não foi capaz partir os tumores pediátricos em subgrupos pela evolução. A expressão dos genes MMP2, TIMP3 e FN1 também foram avaliados por RT-PCR e foram concordantes com os dados gerados pelo array de expressão. O papel da LOH como causa da redução da expressão de TIMP3 foi estudado com tipagem de microssatélites. Em alguns casos, foi identificada LOH da região 22q13. Porém, em outros casos em que a expressão do TIMP3 foi bastante reduzida, não houve LOH. Em resumo, foram identificados aspectos moleculares importantes envolvidos na disseminação e metástases de neoplasias do córtex da supra-renal de adultos e crianças, bem como características biológicas deste processo. Diferentes padrões de expressão identificados em tumores metastáticos e não-metastáticos podem ajudar na predição do prognóstico / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare neoplasm with a poor prognosis. Although molecular studies have uncovered many aspects of ACC tumorigenesis, little is known about molecular pathways involved in metastatic spread. The objective of our study is to analyze the expression profile of metastasis-related genes in a cohort of metastatic and nonmetastatic adrenocortical tumors in order to identify genes involved in the metastatic spread, as well as to find new prognostic markers. The expression profiles of 27 adrenocortical tumors from 15 adults (8 ACC and 7 adenomas) and 12 children (5 metastatic and 7 non-metastatic) were evaluated by an array of 113 known to be involved in human metastasis. Cluster analysis showed adult adrenocortical adenomas form a group distinct from other adrenocortical tumors (adult carcinomas and pediatric tumors). The comparison of adult adenoma and ACC revealed that MMP11 and DENR were differentially expressed between these two groups while no gene was differentially expressed among pediatric adrenocortical tumors. Similarly to cluster analysis, Principal component analysis failed to identify partition amongst pediatric tumors categorized by their evolution. The expression data of MMP2, TIMP3 and FN1 genes by RT-PCR agreed with those generated by the arrays. LOH of 22q12.3 region was detected in some cases in which TIMP3 down regulation was verified (but not in all cases). In conclusion, we have identified important aspects of molecular pathways and biological characteristics involved in metastatic spread of adrenocortical tumors. Distinctive patterns of gene expression between metastatic and nonmetastatic tumors may help in prognosis prediction

A célula estromal pode influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e secundário, mas pouco é conhecido sobre as características moleculares das células estromais presentes na medula óssea de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a expressão gênica diferencial entre as células estromais oriundas de medula óssea na presença ou ausência de célula tumoral oculta. Coletamos dez aspirados de medula óssea das pacientes com câncer de mama. A classificação do comprometimento da medula por células tumorais ocultas foi realizada pela detecção da expressão de CK19 por Nested-RT-PCR e quatro entre dez pacientes apresentaram presença de célula tumoral na medula óssea. Estabelecemos culturas primárias de células estromais de todas as amostras e, selecionamos amostras originárias de duas pacientes contendo linfonodos comprometidos e presença de célula tumoral oculta em medula e também de duas pacientes que não apresentavam linfonodos comprometidos e nem célula tumoral oculta na medula. As pacientes selecionadas eram pós-menopausadas com diagnóstico de carcinoma ductal invasor e expressão imunohistoquímica positiva para receptor de estrógeno e progesterona. Realizamos avaliação do perfil de expressão gênica entre estes dois grupos, o que nos revelou 21 genes diferencialmente expressos dentre os 4.608 genes imobilizados em lâmina de cDNA microarray; nove genes hiperexpressos em célula estromal de medula comprometida (PTHLH, TLOC1, NCOA6, C17orf57, ANAPC11, MAST4, POLR3E, CPNE1 e B4GALT5) e doze genes hipoexpressos em célula estromal de medula comprometida (MRPL2, NAT10, DAP, RNF2, FLOT2, FKBP10, SLIT3, EBNA1BP2, SLC35B2, MICAL2, GPR3, TSPAN17). Nossos dados sugerem que apesar da expressão gênica de células estromais oriundas de medula óssea comprometida ou não por micrometástases ser semelhante, algumas diferenças podem ser identificadas. / Stromal cells may influence tumor development in primary and secundary sites, however, molecular characteristics of bone marrow stromal cells from breast cancer patients are almost unknown. Our aim was to evaluate the differential gene expression of bone marrow stromal cells from breast cancer patients in the presence or abscence of occult tumor cells. Bone marrow (BM) aspirates were obtained from 10 breast cancer patients. The presence of occult bone marrow disseminated tumor cells was detected by CK19 expression quantified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Presence of tumoral cell was detected in four of ten BM samples. Stromal cells primary cultures were established and samples from two patients with positive lymph nodes and presence of occult tumor cells in bone marrow and samples from two patients with negative lymph nodes and abscence of occult tumor cells in bone marrow were selected. All the included patients were postmenopausal with invasive ductal carcinoma and positive estrogen and progesterone receptors detected by immunohistochemical analysis. Gene profile evaluated in cDNA microarray slides containing 4.608 spotted genes revealed 21 differencially expressed genes, nine upregulated (PTHLH, TLOC1, NCOA6, C17orf57, ANAPC11, MAST4, POLR3E, CPNE1 e B4GALT5) and twelve downregulated (MRPL2, NAT10, DAP, RNF2, FLOT2, FKBP10, SLIT3, EBNA1BP2, SLC35B2, MICAL2, GPR3, TSPAN17) in stromal cell derived from bone marrow in the presence of tumor breast cancer cell. Our data suggest that gene expression from bone marrow derived stromall cells in the presence or abscence of occult tumor cells seems similar, however small differences may be identified.

INTRODUÇÃO: A cirurgia associada à radioterapia proporciona altas taxas de preservação de membros e de controle local em sarcomas de partes moles de extremidade de adultos, mas ainda apresenta elevadas taxas de complicações locais e de metástases à distância. O valor da quimioterapia adjuvante ou neoadjuvante ainda é controverso e objeto de investigações clínicas. A identificação de fatores moleculares preditivos de resposta à quimioterapia pode selecionar pacientes que se beneficiem ou não da sua aplicação. OBJETIVOS: identificar perfis de expressão gênica capazes de diferenciar tumores respondedores e não respondedores a quimioterapia neoadjuvante em sarcomas de partes moles. Analisar os resultados preliminares relativos à efetividade de um esquema de quimioterapia neoadjuvante em sarcomas de partes moles. MÉTODOS: amostras foram coletadas a partir de um ensaio clínico fase II não controlado que testa um esquema de quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida em sarcomas de alto grau histológico, localizados em extremidades de pacientes adultos. O perfil de expressão gênica foi determinado pela análise de cDNA microarrays. RESULTADOS: 14 pacientes foram incluídos no estudo clínico e 6 amostras foram utilizadas para análise molecular. 222 seqüências diferentemente expressas entre respondedores e não respondedores foram identificadas. Entre os genes com maior diferença de expressão, foram observados genes envolvidos com via de sinalização de TGF, genes envolvidos com angiogênese, com degradação de matriz extracelular e com desenvolvimento. A taxa de resposta objetiva à quimioterapia neoadjuvante foi de 28,6%, a taxa de amputação foi de 7,1% e taxa de complicações relacionadas à ferida operatória foi de 23%. Complicações graus 3 e 4 ocorreram em 50% dos pacientes e nenhum deles faleceu ou teve a proposta cirúrgica suspensa em decorrência de complicações da quimioterapia. CONCLUSÕES: tumores respondedores a quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ifosfamida apresentaram um perfil de expressão gênica diferente dos não respondedores, particularmente em genes envolvidos na via de sinalização de TGF. O esquema terapêutico testado mostrou-se efetivo e seguro para ser investigado em um estudo fase III / INTRODUCTION: Surgery combined with adjuvant radiotherapy provides high rates of limb sparing and local control for adult extremity soft tissue sarcomas, but is still associated with high rates of local morbidity and distant recurrences. The role of adjuvant or neoadjuvant chemotherapy is still controversy and target of clinical investigations. The identification of molecular predictive factors of response to chemotherapy could select patients who have benefits or not with its use. OBJECTIVES: to identify gene expression profiles that discriminate tumors with respect to response to neoadjuvant chemotherapy. Analyze the preliminary results of a protocol of neoadjuvant chemotherapy in soft tissue sarcomas. METHODS: samples were collected from subjects of a single-arm prospective clinical trial that investigates the effectiveness of a neoadjuvant doxorubicin and ifosphamide-based chemotherapy regimen in high grade extremity soft tissue sarcomas in adults. Gene expression profiles were determined by the analysis of cDNA microarrays. RESULTS: 14 patients were included in the clinical trial and six samples were used in the molecular study. 222 sequences differentially expressed between responders and non responders were identified. Among the genes with higher differences in expression, we have identified genes involved with TGF signaling pathway, angiogenesis, extracelular matrix degradation and development. The objective response rate to neoadjuvant chemotherapy was 28,6%, the amputation rate was 7,1%, and the wound complication rate was 23%. Grades 3 and 4 complications have occurred in 50 % of the cases, but no deaths or modifications on surgical intent related to chemotherapy complications have occurred. CONCLUSIONS: tumors considered responders to neoadjuvant chemotherapy showed a gene expression profile significantly different from non responders, especially with respect to the TGF signaling pathway. The neoadjuvant regimen tested has showed to be effective and safe to be considering for a phase III clinical trial

O tópico abordado nesta tese é a perda de massa através de ventos coronais magnetizados em estrelas de baixa massa. Ventos estelares têm sido estudados extensivamente há vários anos, tendo inicialmente como foco o vento solar. Atualmente, sabe-se que o campo magnético é essencial na aceleração e aquecimento dos ventos coronais. Apesar do conhecimento detalhado que temos da estrutura magnética do Sol, pouco se sabe sobre a configuração do campo magnético em outras estrelas. Nesta tese, é investigada a estrutura do campo magnético nas coroas de estrelas do tipo solar na Seqüência Principal e de suas predecessoras na pré Seqüência Principal através de simulações numéricas magneto-hidrodinâmicas tri-dimensionais. Aqui, consideramos de forma auto-consistente a interação entre o vento e o campo magnético e vice-versa. Dessa forma, pela interação entre forças magnéticas e forças do vento, consegue-se determinar a configuração do campo magnético e a estrutura dos ventos coronais. Realizamos um estudo de ventos de estrelas do tipo solar e a dependência dos mesmos com o parâmetro beta do plasma (a razão entre as densidades de energia térmica e magnética). Este é o primeiro estudo a realizar tal análise resolvendo as equações tri-dimensionais da magneto-hidrodinâmica ideal. Em nossas simulações, adotamos um parâmetro de aquecimento descrito por gamma, que é responsável pela aceleração térmica do vento. Então, nós analisamos ventos com intensidades de campo magnético nos pólos no intervalo de B0 = 1 a 20 G e mostramos que a estrutura do vento apresenta características que são similares à do vento coronal do Sol. No estado estacionário, a topologia do campo magnético obtida é similar para todos os casos estudados, apresentando uma configuração do tipo helmet streamer, com zonas de linhas fechadas e abertas de campo magnético co-existindo. Intensidades mais altas de campo levam a ventos mais acelerados e mais quentes. O aumento na intensidade do campo gera também uma zona morta maior no vento, i.e., os loops fechados que previnem que a matéria escape da coroa em latitudes menores que ~45 graus se estendem a maiores distâncias da estrela. Além disso, mostramos também que a força de Lorentz gera naturalmente um vento que é dependente da latitude. Ao aumentar a densidade da coroa mantendo B0 = 20 G, mostramos que o sistema volta a apresentar ventos menos acelerados e mais frios. Para um valor fixo de gamma, mostramos que o parâmetro essencial na determinação do perfil de velocidade do vento é o parâmetro beta calculado na base da coroa. Dessa forma, acredita-se que haja um grupo de ventos magnetizados que apresenta a mesma velocidade terminal independentemente das densidades de energia térmica ou magnética, desde que o parâmetro beta seja o mesmo. No entanto, essa degenerescência pode ser removida ao se comparar outros parâmetros físicos do vento, tal como a taxa de perda de massa. Nós também analisamos a influência do gamma nos nossos resultados e mostramos que ele é importante na determinação da estrutura do vento. Além disso, investigamos ventos magnetizados de estrelas de baixa massa da pré Seqüência Principal. Em particular, analisamos sob quais circunstâncias tais estrelas apresentam estruturas magnéticas alongadas (e.g., helmet streamers, proeminências do tipo slingshot, etc). Focamos especialmente em estrelas do tipo T Tauri fracas, uma vez que o tênue disco de acreção, quando presente ao redor de tais estrelas, não deve causar forte influência na estrutura do vento estelar e nem na do campo magnético coronal. Nós mostramos que o parâmetro beta do plasma é um fator decisivo na configuração do campo magnético do vento estelar. Usando parâmetros iniciais adequados ao que se é observado para tais estrelas, nós mostramos que a configuração do campo magnético pode variar entre uma configuração semelhante à de um dipolo e uma configuração com linhas fortemente colimadas em torno do eixo polar e streamers fechados ao redor do equador (configuração de multi-componentes para o campo magnético). Mostramos que as estruturas alongadas do campo magnético somente estão presentes se o parâmetro beta do plasma na base da coroa é beta0 << 1. Usando nossos modelos magneto-hidrodinâmicos, auto-consistentes, tri-dimensionais, estimamos para ventos de estrelas da pré Seqüência Principal a escala temporal de migração planetária devido a forças de arraste exercidas pelo vento em um planeta tipo hot-Jupiter (i.e., um planeta gigante que orbita muito próximo da estrela). Nosso modelo sugere que os ventos estelares de coroas com multi-componentes de campo magnético não têm influências significativas na migração de hot-Jupiters. / The subject of this thesis is the mass loss of low-mass stars through magnetized coronal winds. Stellar winds have been a topic of extensive research in Astrophysics for a long time, and their first investigations focused on the solar wind. Nowadays, we know that the magnetic field plays a crucial role in the acceleration and heating of coronal winds. Despite of the knowledge of the fine structure of the solar magnetic field, much less information is known regarding the configuration of the magnetic field in other stars. In this thesis, we investigate the structure of the magnetic field in the coronae of solar-like stars and young stars by means of three-dimensional magnetohydrodynamical numerical simulations. We self-consistently take into consideration the interaction of the outflowing wind with the magnetic field and vice versa. Hence, from the interplay between magnetic forces and wind forces, we are able to determine the configuration of the magnetic field and the structure of the coronal winds. We investigate solar-like stellar winds and their dependence on the plasma-beta parameter (the ratio between thermal and magnetic energy densities). This is the first study to perform such analysis solving the fully ideal three-dimensional magnetohydrodynamics equations. We adopt in our simulations a heating parameter described by gamma, which is responsible for the thermal acceleration of the wind. We analyze winds with polar magnetic field intensities ranging from B0 = 1 to 20 G and we show that the wind structure presents characteristics that are similar to the solar coronal wind. The steady-state magnetic field topology for all cases is similar, presenting a configuration of helmet streamer-type, with zones of closed field lines and open field lines coexisting. Higher magnetic field intensities lead to faster and hotter winds. The increase of the field intensity generates a larger ``dead zone\'\' in the wind, i.e., the closed loops that inhibit matter to escape from latitudes lower than 45 degrees extend farther away from the star. The Lorentz force leads naturally to a latitude-dependent wind. We show that by increasing the density and maintaining B0 = 20 G, the system recovers to slower and cooler winds. For a fixed gamma, we show that the key parameter in determining the wind velocity profile is the beta-parameter at the coronal base. Therefore, there is a group of magnetized flows that would present the same terminal velocity despite of its thermal and magnetic energy densities, as long as the plasma-beta parameter is the same. This degeneracy, however, can be removed if we compare other physical parameters of the wind, such as the mass-loss rate. We also analyze the influence of gamma in our results and we show that it is also important in determining the wind structure. We further investigate magnetized stellar winds of low-mass pre-main-sequence stars. In particular we analyze under which circumstances these stars present elongated magnetic features (e.g., helmet streamers, slingshot prominences, etc). We focus on weak-lined T Tauri stars, as the presence of the tenuous accretion disk is not expected to have strong influence on the structure of the stellar wind neither on the coronal magnetic field. We show that the plasma-beta parameter is a decisive factor in defining the magnetic configuration of the stellar wind. Using initial parameters within the observed range for these stars, we show that the coronal magnetic field configuration can vary between a dipole-like configuration and a configuration with strong collimated polar lines and closed streamers at the equator (multicomponent configuration for the magnetic field). We show that elongated magnetic features will only be present if the plasma-beta parameter at the coronal base is beta0 << 1. Using our self-consistent three-dimensional magnetohydrodynamical model, we estimate for the stellar winds of pre-main-sequence stars the timescale of planet migration due to drag forces exerted by the stellar wind on a hot-Jupiter (i.e., on a giant planet that orbits very close to the star). Our model suggests that the stellar wind of these multicomponent coronae are not expected to have significant influence on the migration of hot-Jupiters.

As interações epitélio-mesênquima podem influenciar o desenvolvimento do tumor no sítio primário e no linfonodo comprometido de pacientes com câncer de mama. Nosso objetivo foi avaliar a taxa de proliferação e perfil gênico de fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos obtidos de pacientes com câncer de mama e determinar a influência de células epiteliais mamárias normais (MCF10A) ou malignas (MDA-MB-231) na expressão gênica destes fibroblastos. Foram estabelecidas culturas primárias de fibroblastos de linfonodos (3 comprometidos e 3 não comprometidos) de 6 diferentes pacientes com câncer de mama e não houve diferença na taxa de proliferação destes fibroblastos. Co-culturas de células MCF10A ou MDA-MB-231 com fibroblastos, separadas fisicamente por membranas porosas, foram realizadas por 72 horas. O RNA total dos fibroblastos foi extraído, amplificado e o perfil gênico foi analisado usando-se uma lâmina de cDNA microarray. Fibroblastos de linfonodos comprometidos e não comprometidos apresentaram perfil gênico similar, pois apenas 13 genes foram modulados, sendo que maior expressão de PGBD3 e PTBP2 em fibroblastos de linfonodos comprometidos foi confirmada em ensaios de RT-PCR em tempo real. Em fibroblastos, a cocultura com células MCF10A alterou a expressão de maior número de genes que a co-cultura com células MDA-MB-231. Em fibroblastos originários de linfonodos não comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 foram modulados 151 genes, em relação aos mesmos fibroblastos cultivados na ausência de células epiteliais, sendo que oito deles apresentaram variação de expressão superior a três vezes (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). As células MDA-MB-231 modularam algumas vias de sinalização em fibroblastos não comprometidos, como vias do cálcio, insulina, hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) e da regulação do citoesqueleto de actina, mas o mesmo não ocorreu em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Duzentos e quarenta e nove genes foram diferencialmente expressos em fibroblastos originários de linfonodos comprometidos mantidos em co-cultura com células MDA-MB-231 e quatro genes apresentaram variação superior a três vezes (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). Nestes fibroblastos, algumas funções biológicas foram reguladas apenas por influência da célula MDA-MB-231, entre as quais metabolismo de aminoácidos, excreção, transporte intra Golgi e regulação da forma celular. As vias de sinalização e funções biológicas reguladas em fibroblastos pela interação com células epiteliais malignas podem estar implicadas no desenvolvimento de metástases regionais no câncer de mama. / Tumor development may be influenced by epithelial-mesenchimal interactions in the primary site as well as in the involved lymph node from breast cancer patients. Our aim was to evaluate the proliferation rate and gene profile of fibroblasts obtained from involved and uninvolved lymph nodes from breast câncer patients and to determine the influence of normal (MCF10A) or malignant (MDA-MB-231) mammary epithelial cells on the gene expression of these fibroblasts. Primary culture from fibroblasts obtained from 3 involved and 3 uninvolved lymph nodes (ILF and NILF) from 6 different breast cancer patients was established and no difference in their proliferation rate was detected. These fibroblasts were co-cultured with MCF10A or MDA-MB-231 cells, physically separated by a porous membrane for 72 hours. Total RNA was extracted from the cells, amplified and the gene profile from fibroblasts cultured alone or with epithelial cells was analyzed by cDNA microarray slides. Fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes present a similar gene profile as only 13 genes were differentially expressed between them, including PGBD3 and PTBP2, which higher expression in fibroblasts from involved lymph nodes was confirmed by real time RT-PCR. In fibroblasts, more genes seem to be regulated upon co-cultured with MCF10A than with MDA-MB-231 cells. In fibroblasts from uninvolved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, 151 genes were modulated as compared with fibroblasts cultured alone, and eight of them, presented an expression variation superior to three times (BET1, ENTPD1, USP7, DAPK1, ERBB2 e NCF2). In these fibroblasts, MDA-MB-231 could modulate some signaling pathways as calcium, insulin, gonadotrophin releasing hormone (GnRH) and actin cytoskeleton regulation signaling pathways. Two hundred forty nine genes were differentially expressed by fibroblasts from involved lymph nodes co-cultured with MDA-MB-231 cells, four of which with an expression variation superior to three times (ACLY, AXUD1, CLCN5 e PDE6D). In the last condition, fibroblasts had some biological functions regulated upon MDA-MB-231 cells influence, among which amino acid metabolism, excretion, intra-Golgi transport and regulation of cell shape. Signaling pathways and biological functions regulated in fibroblasts after interaction with malignant epithelial cells might be implicated in the development of regional metastasis in breast cancer.

O desenvolvimento da metástase depende, entre outros fatores de um microambiente propício e é possível que as células do câncer de mama influenciem o perfil da expressão gênica das células estromais, tanto no tumor primário como no linfonodo regional. Para estudar este último evento obtivemos fibroblastos de linfonodos comprometidos (n=3) ou não (n=3) de pacientes com câncer de mama, os quais foram co-cultivados com células de câncer de mama MDA-MB-231, separados fisicamente por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi determinado utilizando-se uma plataforma de cDNA microarray. A presença de células MDA-MB231 modulou a expressão de 415 genes em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e 779 genes em fibroblastos de linfonodos comprometidos, em relação a células mantidas em mono-cultura, sendo que 120 genes tiveram sua expressão reguladas em ambas comparações. A expressão destes genes determinou a separação dos fibroblastos mantidos em co-cultura daqueles mantidos isoladamente em cultura por análise de agrupamento hierárquico, indicando que a presença das células de câncer de mama influencia o perfil da expressão gênica das células. Entre as funções reguladas pela presença de células MDA-MB231 encontramse tradução e receptor de superfície ligado à transmissão de sinal, em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e autofosforilação de proteína e ciclo celular, em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Para determinar se a expressão gênica diferencial é um fenômeno que pode ser generalizado para o câncer de mama, realizamos ensaios utilizando outras amostras de fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos de 5 pacientes e de linfonodos não comprometidos de outras 5 pacientes (incluindo as 6 amostras de fibroblastos previamente analisadas), as quais foram co-cultivadas com três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB231, MDA-MB435 e MCF-7). A expressão relativa de MAP2K3, AKAP8L e CREG1, inicialmente identificados como diferencialmente expressos em análise de cDNA microarray, foi então determinada por RT-PCR em tempo real. Observamos que nenhuma das três linhagens celulares influenciou a expressão de AKAP8L e CREG1 tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto não comprometidos. MAP2K3 foi hiperexpresso tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto em não comprometidos co-cultivados com células MDA-MB231, mas não com células MDA-MB435 ou MCF-7. Nossos resultados indicam que a presença de células MDA-MB231 influencia o perfil de expressão gênica de fibroblastos originário tanto de linfonodos comprometidos quanto de não comprometidos. Alguns genes comumente regulados em fibroblastos de linfonodo comprometido ou não comprometidos, incluindo MAP2K3, podem estar envolvidos no estabelecimento de metástase regional. / Metastasis development may depend on a favorable microenvironment and breast cancer cells may influence stromal cells gene expression profile not only in the primary site but also in the lymph nodes. To study the latter event, fibroblasts were obtained from involved or uninvolved lymph nodes from six breast cancer patients and co-cultivated with breast cancer MDA-MB-231 cells, physically separated by porous membranes, for 72 hours. The gene expression profile was determined utilizing a cDNA microarray platform. The presence of MDA-MB231 cells modulated the expression of 415 genes in fibroblasts from uninvolved nodes and 779 genes in fibroblasts from involved nodes, as compared to fibroblasts cultured isolated, including 120 genes, which were regulated in fibroblasts from both origins. Unsupervised hierarchical clustering allowed a correct segregation of fibroblasts co-cultured with MDA-MB231 cells from fibroblasts cultured alone, indicating that the gene expression profile gene is influenced by the presence of breast cancer cells. Functions, which were regulated by presence of MDA-MB231 cells included translation and cell surface receptor linked signal transduction in fibroblasts from uninvolved nodes and protein autophosphorylation and cell cycle in fibroblasts from involved nodes. To determine whether this differential gene expression was a general process influenced by breast cancer cells, further assays were performed utilizing samples of fibroblasts from involved (n=5) and uninvolved nodes (n=5) from breast cancer patients (including the 6 samples of fibroblasts previously analyzed), which were co-cultured with three breast cancer cell lines (MDAMB231, MDA-MB435 and MCF-7). Relative expression of MAP2K3, AKAP8L and CREG1, initially identified as differentially expressed in co-cultured fibroblasts upon cDNA microarray analysis, was determined by RT-PCR real time. AKAP8L and CREG1 expression in fibroblasts from involved or uninvolved nodes was not influenced by the presence of any of the three cell lines. MAP2K3 was over-expressed in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes when co-cultured with MDA-MB231 cells, but not with MDA-MB435 or MCF-7 cells. Our results indicate that the gene expression profile of fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes are influenced by the presence of MDA-MB231. Some genes commonly regulated in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes, as MAP2K3, may be involved in regional metastasis establishment.

O comportamento do câncer de mama pode ser influenciado pela interação entre células tumorais e estromais que infiltram e circundam o tumor. Acredita-se também que as células que compõem o microambiente linfonodal possam influenciar o perfil da expressão gênica de células mamárias malignas MDA-MB231, induzindo ou inibindo o desenvolvimento de metástase regional. Para avaliar essa possibilidade, células MDA-MB231 foram co-cultivadas com fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos ou não comprometidos de pacientes com câncer de mama, separadas por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi avaliado através de uma plataforma de cDNA microarray de 4608 genes. Observamos que 155 e 188 genes foram modulados em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos não comprometidos e comprometidos, respectivamente, quando comparados com células MDA-MB231 cultivadas isoladamente. Análise do agrupamento hierárquico não supervisionado utilizando os genes diferencialmente expressos revelou a presença de dois grupos, um constituído por células MDA-MB 231 em monocultura e outro por células mantidas em co-cultura com fibroblastos. Splicing de RNAm, via spliceossoma, ciclo celular e regulação da transcrição por promotores da RNA polimerase II, foram algumas funções moduladas em células MDA-MB231. A seguir novos ensaios de co-cultura foram realizados e a expressão de alguns genes foram analisados por RT-PCR. FN3K e COMT foram menos expressos em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos, mas não em co-cultura com células MCF-7, nas quais apenas HTRA1 mostrou-se hipoexpresso em casos de co-cultura com fibroblastos. Esses resultados sugerem que a inter-relação entre células estromais e células tumorais são dependentes do subtipo do tumor, de fenótipo luminal ou basal / Breast cancer behavior may be influenced by interactions between cancer and stromal cells, which infiltrate and surround the tumor. It is also believed that cells within the lymph node microenvironment may influence the gene expression profile of breast cancer cells, stimulating or inhibiting regional metastasis development. To evaluate this possibility, breast cancer MDAMB231 cells were co-cultured with fibroblasts obtained from involved or uninvolved lymph nodes from breast cancer patients, using a porous membrane, for 72 hours. Gene expression profile was evaluated through a cDNA microarray platform containing 4608 genes. MDA-MB231 cells had 155 and 188 genes modulated by the presence of fibroblasts from uninvolved or involved nodes, respectively, as compared to MDA-MB231 cells cultured alone. Unsupervised hierarchical clustering using the differentially expressed genes revealed the presence of two groups, one comprising MDA-MB231 cells cultured aloned and another one, MDA-MB231 cells co-cultured with fibroblasts. Nuclear mRNA splicing, via spliceosome, cell cycle, and regulation of transcription from RNA polymerase II promoter, were functions regulated in cocultured MDA-MB231 cells. New co-culture assays were performed and expression of a few genes was further evaluated by RT-PCR. FN3K and COMT were both down-regulated in MDA-MB231 cells in the presence of nodes\' fibroblasts, but not in co-cultured MCF7 cells, while HTRA1 was just down regulated in MCF7 co-cultured cells. These results suggest that the interrelationship between stromal and cancer cells are dependent on the subtype of tumor, whether from luminal or basal-like phenotype

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 248917 bytes, checksum: 84bc05c660ca867229222e12c0fa08ec (MD5) Previous issue date: 2003-03-31 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Phylogenetic analysis of Lactobacillus UFV H2b20 based on the 16S rDNA sequence positions this isolate among the Lactobacillus delbrueckii subspecies. It confirms the classification by DNA/DNA hybridization. Comparisons of the substituted bases along the 16S rDNA sequence show that most are probably caused by 5-methylcytosine deamination that results in GC/AT transition. Presence of polymorphic copies of the 16S rRNA gene in Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 were confirmed by PCR-DGGE. Five distinct bands of rDNA amplified sequences confirm at least five different copies of the gene. The intensity of one of the bands allows the inference of two identical copies. The DGGE profile of this isolate was different from those of other L. delbrueckii strains, providing a mean to distinguish it in mixed cultures. Analysis of the nucleotide sequences along the rDNA region revealed the presence of putative insertion sequences. One of them, 915 bp long, was characterized and denominated ISLdH2b20. It presents a single ORF that encodes a putative transposase with some homology to the one of ISL5 of L. delbrueckii subsp. bulgaricus. All the characteristic elements of an IS were located as well as the putative regulatory sequences of the transposase. / O estudo de filogenia baseado em seqüências de rDNA de Lactobacillus UFV H2b20 mostrou que esse microrganismo foi agrupado entre as subespécies de Lactobacillus delbrueckii. Este resultado confirma a nova classificação do isolado, baseada na hibridização DNA-DNA. A análise das substituições de bases mostra que a maioria é causada pela desaminação da 5-metilcitosina, o que causa uma transição GC/AT. A técnica PCR-DGGE de L. delbrueckii UFV H2b20 demonstrou resultados satisfatórios na análise de polimorfismos do operon rrn em microrganismos isolados. Foram encontradas cinco bandas diferentes para o L. delbrueckii UFV H2b20, confirmando a presença de cinco cópias distintas do rDNA 16S nesse microrganismo e possivelmente seis no total. O isolado L. delbrueckii UFV H2b20 apresentou um perfil de bandas diferente das outras linhagens de Lactobacillus, o que poderá ser utilizado para diferenciá-lo dos demais, uma vez que outros métodos baseados em PCR, como RAPD, mostram-se pouco discriminatórios. A análise das seqüências da região do rDNA 16S revelou uma seqüência de inserção putativa, de 915 pb, que foi caracterizada e denominada ISLdH2b20. Ela apresenta uma única ORF e codifica uma transposase putativa que apresenta homologia com a transposase de ISL5. Todos os elementos característicos de uma IS foram identificados bem como as seqüências regulatórias putativas da transposase.

O comportamento do câncer de mama pode ser influenciado pela interação entre células tumorais e estromais que infiltram e circundam o tumor. Acredita-se também que as células que compõem o microambiente linfonodal possam influenciar o perfil da expressão gênica de células mamárias malignas MDA-MB231, induzindo ou inibindo o desenvolvimento de metástase regional. Para avaliar essa possibilidade, células MDA-MB231 foram co-cultivadas com fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos ou não comprometidos de pacientes com câncer de mama, separadas por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi avaliado através de uma plataforma de cDNA microarray de 4608 genes. Observamos que 155 e 188 genes foram modulados em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos não comprometidos e comprometidos, respectivamente, quando comparados com células MDA-MB231 cultivadas isoladamente. Análise do agrupamento hierárquico não supervisionado utilizando os genes diferencialmente expressos revelou a presença de dois grupos, um constituído por células MDA-MB 231 em monocultura e outro por células mantidas em co-cultura com fibroblastos. Splicing de RNAm, via spliceossoma, ciclo celular e regulação da transcrição por promotores da RNA polimerase II, foram algumas funções moduladas em células MDA-MB231. A seguir novos ensaios de co-cultura foram realizados e a expressão de alguns genes foram analisados por RT-PCR. FN3K e COMT foram menos expressos em células MDA-MB231 na presença de fibroblastos de linfonodos, mas não em co-cultura com células MCF-7, nas quais apenas HTRA1 mostrou-se hipoexpresso em casos de co-cultura com fibroblastos. Esses resultados sugerem que a inter-relação entre células estromais e células tumorais são dependentes do subtipo do tumor, de fenótipo luminal ou basal / Breast cancer behavior may be influenced by interactions between cancer and stromal cells, which infiltrate and surround the tumor. It is also believed that cells within the lymph node microenvironment may influence the gene expression profile of breast cancer cells, stimulating or inhibiting regional metastasis development. To evaluate this possibility, breast cancer MDAMB231 cells were co-cultured with fibroblasts obtained from involved or uninvolved lymph nodes from breast cancer patients, using a porous membrane, for 72 hours. Gene expression profile was evaluated through a cDNA microarray platform containing 4608 genes. MDA-MB231 cells had 155 and 188 genes modulated by the presence of fibroblasts from uninvolved or involved nodes, respectively, as compared to MDA-MB231 cells cultured alone. Unsupervised hierarchical clustering using the differentially expressed genes revealed the presence of two groups, one comprising MDA-MB231 cells cultured aloned and another one, MDA-MB231 cells co-cultured with fibroblasts. Nuclear mRNA splicing, via spliceosome, cell cycle, and regulation of transcription from RNA polymerase II promoter, were functions regulated in cocultured MDA-MB231 cells. New co-culture assays were performed and expression of a few genes was further evaluated by RT-PCR. FN3K and COMT were both down-regulated in MDA-MB231 cells in the presence of nodes\' fibroblasts, but not in co-cultured MCF7 cells, while HTRA1 was just down regulated in MCF7 co-cultured cells. These results suggest that the interrelationship between stromal and cancer cells are dependent on the subtype of tumor, whether from luminal or basal-like phenotype

O desenvolvimento da metástase depende, entre outros fatores de um microambiente propício e é possível que as células do câncer de mama influenciem o perfil da expressão gênica das células estromais, tanto no tumor primário como no linfonodo regional. Para estudar este último evento obtivemos fibroblastos de linfonodos comprometidos (n=3) ou não (n=3) de pacientes com câncer de mama, os quais foram co-cultivados com células de câncer de mama MDA-MB-231, separados fisicamente por membranas porosas por 72 horas. O perfil da expressão gênica foi determinado utilizando-se uma plataforma de cDNA microarray. A presença de células MDA-MB231 modulou a expressão de 415 genes em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e 779 genes em fibroblastos de linfonodos comprometidos, em relação a células mantidas em mono-cultura, sendo que 120 genes tiveram sua expressão reguladas em ambas comparações. A expressão destes genes determinou a separação dos fibroblastos mantidos em co-cultura daqueles mantidos isoladamente em cultura por análise de agrupamento hierárquico, indicando que a presença das células de câncer de mama influencia o perfil da expressão gênica das células. Entre as funções reguladas pela presença de células MDA-MB231 encontramse tradução e receptor de superfície ligado à transmissão de sinal, em fibroblastos de linfonodos não comprometidos e autofosforilação de proteína e ciclo celular, em fibroblastos de linfonodos comprometidos. Para determinar se a expressão gênica diferencial é um fenômeno que pode ser generalizado para o câncer de mama, realizamos ensaios utilizando outras amostras de fibroblastos obtidos de linfonodos comprometidos de 5 pacientes e de linfonodos não comprometidos de outras 5 pacientes (incluindo as 6 amostras de fibroblastos previamente analisadas), as quais foram co-cultivadas com três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB231, MDA-MB435 e MCF-7). A expressão relativa de MAP2K3, AKAP8L e CREG1, inicialmente identificados como diferencialmente expressos em análise de cDNA microarray, foi então determinada por RT-PCR em tempo real. Observamos que nenhuma das três linhagens celulares influenciou a expressão de AKAP8L e CREG1 tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto não comprometidos. MAP2K3 foi hiperexpresso tanto em fibroblastos de linfonodos comprometidos quanto em não comprometidos co-cultivados com células MDA-MB231, mas não com células MDA-MB435 ou MCF-7. Nossos resultados indicam que a presença de células MDA-MB231 influencia o perfil de expressão gênica de fibroblastos originário tanto de linfonodos comprometidos quanto de não comprometidos. Alguns genes comumente regulados em fibroblastos de linfonodo comprometido ou não comprometidos, incluindo MAP2K3, podem estar envolvidos no estabelecimento de metástase regional. / Metastasis development may depend on a favorable microenvironment and breast cancer cells may influence stromal cells gene expression profile not only in the primary site but also in the lymph nodes. To study the latter event, fibroblasts were obtained from involved or uninvolved lymph nodes from six breast cancer patients and co-cultivated with breast cancer MDA-MB-231 cells, physically separated by porous membranes, for 72 hours. The gene expression profile was determined utilizing a cDNA microarray platform. The presence of MDA-MB231 cells modulated the expression of 415 genes in fibroblasts from uninvolved nodes and 779 genes in fibroblasts from involved nodes, as compared to fibroblasts cultured isolated, including 120 genes, which were regulated in fibroblasts from both origins. Unsupervised hierarchical clustering allowed a correct segregation of fibroblasts co-cultured with MDA-MB231 cells from fibroblasts cultured alone, indicating that the gene expression profile gene is influenced by the presence of breast cancer cells. Functions, which were regulated by presence of MDA-MB231 cells included translation and cell surface receptor linked signal transduction in fibroblasts from uninvolved nodes and protein autophosphorylation and cell cycle in fibroblasts from involved nodes. To determine whether this differential gene expression was a general process influenced by breast cancer cells, further assays were performed utilizing samples of fibroblasts from involved (n=5) and uninvolved nodes (n=5) from breast cancer patients (including the 6 samples of fibroblasts previously analyzed), which were co-cultured with three breast cancer cell lines (MDAMB231, MDA-MB435 and MCF-7). Relative expression of MAP2K3, AKAP8L and CREG1, initially identified as differentially expressed in co-cultured fibroblasts upon cDNA microarray analysis, was determined by RT-PCR real time. AKAP8L and CREG1 expression in fibroblasts from involved or uninvolved nodes was not influenced by the presence of any of the three cell lines. MAP2K3 was over-expressed in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes when co-cultured with MDA-MB231 cells, but not with MDA-MB435 or MCF-7 cells. Our results indicate that the gene expression profile of fibroblasts from involved and uninvolved lymph nodes are influenced by the presence of MDA-MB231. Some genes commonly regulated in fibroblasts from both involved and uninvolved nodes, as MAP2K3, may be involved in regional metastasis establishment.