Les caractéristiques des transferts de masse et de chaleur par convection forcée lors de l'évaporation du film liquide dans le canal en présence d'un cylindre carré poreux parcouru par un écoulement transversal sont étudiées numériquement. L'objectif principal de la présente étude est d'évaluer l'effet de l'introduction d'un cylindre carré poreux sur le transfert de chaleur et de masse. Plus précisément, cette étude examine l'influence de paramètres tels que l'humidité relative de l'air ambiant, la température de l'air à l'entrée, le flux de chaleur imposé, la position du cylindre, le taux de blocage et le nombre de Reynolds. Une comparaison entre les deux configurations, avec et sans cylindre carré poreux a été réalisée pour mettre en évidence l'effet de son ajout. Pour modéliser ce phénomène nous avons résolu l'équation classique de convection forcée et le modèle de Darcy-Brinkman-Forchheimer dans les milieux poreux. Nous avons trouvé que l'insertion d'un cylindre carré poreux dans le canal pourrait perturber l'écoulement et améliorer de manière significative les taux de transfert de masse et de chaleur au niveau des parois du canal. Les transferts de chaleur et de masse deviennent plus importants avec la diminution du nombre de Darcy et lorsque l'obstacle poreux est placé au milieu du canal. Par contre, l'augmentation de l’humidité relative de l’air ambiant et de la température d'entrée réduit le transfert de masse. A Da = 10-6, l'écoulement ne pénètre plus à travers le cylindre poreux, la structure de l'écoulement est similaire à celui d'un cylindre carré plein. Enfin, nous proposons des lois de corrélations qui permettent de prédire les valeurs des nombres de Sherwood et de Nusselt en fonction des nombres de Reynolds, de Biot et du taux de blocage. / The characteristics of mass and heat transfers by forced convection during liquid film evaporation in the channel with a built in porous square cylinder in a cross flow are investigated numerically. The main objective of the present study is to evaluate the effect of introducing a porous square cylinder on the heat and mass transfer. Specifically, this study examines the influence of parameters such as the relative humidity of the ambient air, the air inlet temperature, the imposed heat flux, the variation of the cylinder position, blockage ratio and Reynolds number on the performance of the evaporation at the channel wall. A comparison between the two configurations, with and without, porous square cylinder has been performed to highlight the effect of its addition. To achieve this, we solved the classic equation of forced convection and the Darcy-Brinkman-Forchheimer model in the porous media. We find that the insertion of a porous square cylinder in the channel could make the flow more disturbed and significantly improve mass and heat transfer rates at the channel walls. The heat and mass transfer enhancements is greater with a decrease of the Darcy number and for γ=1 when the porous obstacle is placed in the middle of the channel. It is also greater with a decrease of the temperature and relative humidity of the air at the inlet. At Da = 10-6, the flow does not penetrate through the porous cylinder, the flow pattern is similar to that of a solid square cylinder. Finally, we propose correlations that allow us to define the Sherwood and Nusselt numbers based on the Reynolds, Biot numbers and the blockage ratio.

Ce travail porte sur différentes méthodes de détection de protéines par des anticorps (Acs) marqués par des boîtes quantiques (QD, « quantum dots »). La première partie de la thèse porte sur le développement et l'optimisation de méthodes de conjugaison d'Acs polyclonaux à des QDs. Une étude de 2007 avait démontré que les conjugués anticorps-quantum dots (Acs-QDs) commerciaux ne présentent que de très rares anticorps fonctionnels à leur surface [Pathak et al., 2007]. Nous avons donc : (i) développé des conditions de réduction ménagée des ponts disulfures des Acs en utilisant soit du dithiothreitol, soit du 2-mercapotethanolamine, (ii) purifié les fragments d'Acs fonctionnels grâce à une colonne d'affinité, (iii) conjugué ces fragments fonctionnels d'Acs aux QDs en utilisant l'agent de liaison amine-thiol SMCC et (iv) développé une méthode de purification des conjugués sur gel d'agarose afin d'éliminer les fragments d'Acs non conjugués et les QDs libres. Des tests en cytométrie en flux ont permis de déterminer l'efficacité des conjugués pour détecter l'expression de la molécule CD4 à la surface de lymphocytes T humains. Un marquage de CD4 réalisé avec des conjugués préparés selon notre méthode s'avère être cinq fois plus sensible qu'en utilisant des conjugués réalisés selon les recommandations commerciales. Une autre méthode de préparation des Acs pour la conjugaison aux QDs a été testée : l'ajout de groupements fonctionnels sulfhydriles sur des amines primaires grâce au N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). Cependant, cette méthode ne permet pas d'avoir un contrôle précis du nombre ni de l'emplacement des groupements fonctionnels sulfhydriles ainsi ajoutés. Les tests de conjugaison aux QDs qui ont été réalisés avec ces Acs-SH, en utilisant l'agent de liaison SMCC, a entraîné la formation d'agrégats de taille variable. Cette méthode a donc été abandonnée.La seconde partie de la thèse porte sur la démonstration de la faisabilité et l'optimisation d'un marquage de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA, « carcinoembryonic antigen ») humain à la surface de lignées cellulaires murines avec un anticorps simple domaine (sdAb) anti-CEA biotinylé détecté grâce à des conjugués streptavidine-QDs commerciaux et analysé par cytométrie en flux. Ces sdAbs ont été biotinylés selon deux approches : (i) avec des agents de biotinylation chimique qui permettent d'ajouter une biotine sur les amines primaires (biotinylation in vitro) et (ii) par une enzyme lors de leur production par E. coli (biotinylation in vivo). La détection du CEA humain à la surface des 100 000 cellules (lignées cellulaires murine MC38 et MC38-CEA) par ces sdAbs biotinylés a été testée en cytométrie de flux puis comparée à celle obtenue par un anticorps monoclonal biotinylé in vitro. Les résultats ont démontré que les sdAbs biotinylés ont une sensibilité de détection similaire que la biotinylation soit réalisée in vitro ou in vivo. Par contre, la sensibilité de la détection du CEA est environ cinquante fois meilleure en utilisant des sdAbs biotinylés (0,6 fmol d'anticorps sont nécessaires pour détecter le CEA) qu'avec des anticorps monoclonaux biotinylés (33 fmol). / We have been working on different ways to detect proteins with antibodies (Abs) labeled by quantum dots (QDs). The first part of his work is to develop and optimize the conjugation of polyclonal antibodies to quantum dot. A study has reported that commercial antibody-quantum dots conjugates (Abs-QDs) present very few functional Ab fragments at the surface of the conjugate [Pathak et al., 2007]. We had: (i) developed an advanced procedure of antibody reduction using dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanolamine (2-MEA) (to prevent the loss of antibody functions), (ii) purified the active fragments by affinity purification on column, (iii) conjugated the active reduced antibody fragments to QDs using the amine-thiol crosslinker SMCC for SH coupling, and (iv) developed the purification of the conjugates on agarose gel to remove free QDs and unconjugated antibody fragments. Our conjugates present about a five times better ability to detect CD4 by flow cytometry on 500 000 isolated human lymphocyte T cells than those made after the commercial procedure. Another procedure for antibody preparation was addition of sulfhydryl groups on primary amines using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). However this procedure presents some variable yield and the number and the localization of sulfhydryl groups added on antibody cannot be fully controlled. Thereby, the conjugation of these Abs-SH to QDs using SMCC chemistry leads to the creation of aggregates. This Ab preparation in preparation for conjugation to QDs was abandoned.The second part of our work focusses on testing and comparing the ability to detect carcinoembryonic antigen (CEA) by flow cytometry with anti-CEA single domain antibodies (sdAbs) labeled by QDs. The sdAbs were biotinylated by using two methods: (i) in vitro chemical biotinylation reagent which adds biotins on primary amines, and (ii) enzymatic in vivo biotinylation during their production in E. coli. These anti-CEA sdAb biotinylation methods were compared to in vitro biotinylated monoclonal Abs against CEA for their respective ability to detect human CEA on 100 000 mice cells (MC38 and MC38-CEA cell lines) using flow cytometry. The results show that the limit detection for biotinylated sdAbs is similar between in vitro and in vivo biotinylation. Furthermore the limit detection with biotinylated sdAb (0.6 fmol are required to detect CEA) is about fifty times better than with biotinylated monoclonal Abs (33 fmol).

Par leur stabilité, leur petite taille et leur nature monomérique, les domaines variables des immunoglobulines à chaînes lourdes, ou Nanobodies (Nb), sont incontournables en diagnostic et recherche médicale. Pourtant, leur utilisation en agro-biotechnologies demeure confidentielle.Dans l'idée de les utiliser pour étudier et combattre le Grapevine fanleaf virus (GFLV), responsable de la maladie du court-noué très préjudiciable à l'économie viticole mondiale, j'ai produit une collection de Nb spécifiques du GFLV.Fusionné à une protéine fluorescente et exprimé en plante de façon stable, un de ces Nb (alors appelé Chromobody, Cb) a conféré une haute résistance au GFLV inoculé mécaniquement ou transmis par nématodes.Le potentiel du Cb comme biocapteur a été validé par le suivi in vivo d’un isolat contournant la résistance mais toujours reconnu par le Cb. La structure du complexe Nb/GFLV a été résolue à 2,8 Å et révèle la zone occupée par le Nb à la surface de la capside.Ces résultats ouvrent des perspectives innovantes pour la compréhension du cycle infectieux d'un phytovirus et l'élaboration de nouvelles stratégies de lutte antivirale. / Due to their small size, high stability and strict monomeric nature, Nanobodies (Nbs) deriving from camelids heavy chain only antibodies have proven very valuable as diagnostic and therapeutic tools. However their use in agro biotechnology remains limited.In order to apply Nbs to the study and the control of grapevine fanleaf degeneration, I produced acollection of Nbs against Grapevine fanleaf virus (GFLV), the causal agent of this devastating disease worldwide.When fused to a fluorescent protein and stably expressed in plants, one of these Nbs (calledChromobody, Cb) conferred high resistance to GFLV, whether inoculated mechanically or by vector-mediated transmission.The identification of an isolate overcoming the resistance but still bound by the Cb allowed real-time tracking of the infection showing the high potential of Cbs as biosensors.The cryoEM structure of the Nb/GFLV complex was obtained at 2,8 Å and provides a clear picture of the footprint of the Nb on the surface of the GFLV capsid.These results pave the way for the innovative use of Nbs to unravel viral life cycle and to counter viral diseases.

Les récepteurs à la vasopressine V1bR et à la sérotonine 5HT3R jouent des rôles physiologiques importants dans la détection des signaux extracellulaires, les mécanismes de transmission nerveuse et diverses pathologies dont le cancer, le diabète et des maladies des SNC et SNP. Mes études avaient pour but de générer ou trouver des modulateurs peptidiques de ces deux récepteurs. Pour le V1bR, j’ai développé plusieurs anticorps de type VHH et les ai caractérisés aux plans biochimique et fonctionnel. L’un de ces VHHs agit comme un agoniste allostérique complet et spécifique du V1bR humain (hV1bR). In vitro ce VHH est capable d’activer les voies de signalisation de l’inositol phosphate et des MAP kinases et d’induire l'internalisation du hV1bR. Dans des îlots pancréatiques surexprimant le hV1bR, il induit une augmentation du Ca2+ intracellulaire et une sécrétion d'insuline. Pour le 5HT3R, j’ai criblé par SPR 31 venins de serpents sur des récepteurs recombinants immobilisés et mis en évidence une interaction à partir d’un de ces venins. Suite à purification par chromatographie liquide et identification par spectrométrie de masse, j’ai identifié une toxine préalablement caractérisée comme une enzyme à activité Ca2+-dépendante. Cette toxine interagit avec les 5HT3R A et AB indépendamment du Ca2+ et avec des valeurs de Kd ≤ 10 nM. L’analyse fonctionnelle par électrophysiologie suggère qu’elle agit comme un PAM de l’activité canal du 5HT3R. Des images de ME en coloration négative montrent la toxine fixée sur le domaine extracellulaire du 5HT3R, à distance du site pour la 5HT. Le VHH et la toxine pourraient être utilisés comme outils pharmacologiques et/ou agents thérapeutiques. / The vasopressin V1bR and serotonin 5HT3R receptors play important physiological roles in the detection of extracellular signals, in the mechanisms for neuronal transmission, and in various pathologies including cancer, diabetes, and CNS and PNS diseases. My studies were aimed at generating or finding peptidic modulators of these two receptors. For the V1bR, I developed several antibodies of the VHH type and characterized them biochemically and functionally. One of these VHHs acts as a complete allosteric agonist specific for the human V1bR (hV1bR). In vitro this VHH is able to activate the signaling pathways of inositol phosphate and MAP kinases and to induce the internalization of hV1bR. In pancreatic islets overexpressing hV1bR, it induces an increase in intracellular Ca2+ and a secretion of insulin. For the 5HT3R, using SPR I screened 31 snake venoms on immobilized recombinant receptors and for one of these venoms, evidenced an interaction. Following purification by liquid chromatography and identification by mass spectrometry, I identified a toxin previously characterized as an enzyme with Ca2+-dependent activity. This toxin interacts with the 5HT3R A and AB independently of Ca2+ and with Kd values ≤ 10 nM. Functional analysis by electrophysiology suggests that it acts as a PAM of the 5HT3R channel activity. Images recorded by negative staining EM show that the toxin binds to the 5HT3R extracellular domain, at a distance from the 5HT binding site. Both this VHH and this toxin could be used as pharmacological tools and / or therapeutic agents.