A Apis mellifera é um inseto pertencente à ordem Himenóptera, família Apidae, possui ocorrência cosmopolita e grande importância ecológica, econômica e médica. As subespécies hibridas que ocorrem no Brasil possuem características predominantemente africanas e passaram a ser conhecidas como abelhas africanizadas. As principais características das abelhas africanizadas são o comportamento agressivo, boa resistência a doenças, alta produção de mel e o aumento da frequência de enxameamentos, que tem causado preocupação por estar acompanhado, de aumento no número de acidentes. A agressividade e o aumento da frequência do exameamento fazem com que elas estejam repetidamente envolvidas em ataques massivos a humanos e animais, tornando esse tipo de envenenamento um problema de saúde pública. A busca de tratamento para o envenenamento tem sido alvo de diversas pesquisas. De uma forma geral, os tratamentos atuam sobre os efeitos causados pelo veneno (medicamentos) ou sobre os componentes do veneno (soros e inibidores). Os principais componentes do veneno são a fosfolipase A2 (PLA2) e a melitina. A PLA2 é uma das principais proteínas do veneno, que degrada a membrana plasmática das células e tem o seu efeito potencializado pela presença da melitina. A PLA2 da Apis mellifera possui a estrutura protéica determinada e sítio ativo identificado. Essas características qualificam a PLA2 como potencial alvo de estudos de planejamento de fármacos. A estratégia de planejamento de fármacos tem como objetivo acelerar o processo de identificação de ligantes, contribuindo para o processo da descoberta de fármacos. Este trabalho teve como objetivo identificar in silico potenciais inibidores contra a PLA2 de Apis mellifera, avaliar in vitro e in vivo a potencial atividade inibitória dos compostos selecionados e identificar a citotoxicidade in vitro dos compostos. A estrutura da PLA2 foi obtida da base de dados (PDB) e a busca de compostos feita das bibliotecas Maybridge e Chembridge. A triagem virtual foi realizada com o auxilio do programa GOLD. Os compostos identificados (22 da Maybridge e 68 da Chembridge) pelos programas GOLD foram filtrados com o uso das ferramentas computacionais para seleção dos compostos com melhores interações no sítio ativo. Os parâmetros utilizados como filtros foram as análises das ligações químicas e os campos de interação molecular. Os compostos selecionados (20 da Maybridge e 29 da Chembridge) foram submetidos a um grupo de programas computacionais para predição de características físico-químicas (drug-like), toxicidade e atividade biológica dos ligantes. Os resultados das predições sugeriram que os compostos da Chembridge fossem utilizados nas análises experimentais. Os compostos da biblioteca Chembridge foram adquiridos (29 do total de 49 compostos). Os compostos tiveram as suas potenciais atividades inibitórias avaliadas in vitro e in vivo. A atividade fosfolipásica foi avaliada para os 29 compostos e 11 apresentaram atividade inibitória contra PLA2. Os 11 compostos foram avaliados in vivo com o experimento de indução de edema e 5 compostos conseguiram reduzir o edema. Os compostos foram avaliados em relação a citoxicidade que poderiam causar. A citotoxicidade in vitro foi calculada para 3 compostos dos 5 inibidores obtidos. O resultado do experimento identificou 2 compostos como citotóxicos e 1 com menor citotoxicidade. Apesar da citotoxicidade identificada, mais estudos devem ser realizados para determinar a concentração inibitória não tóxica. Portanto, o trabalho identificou 5 potenciais inibidores específicos contra a PLA2 de Apis mellifera. / Apis mellifera is an insect belonging to the order Hymenoptera , Apidae family , has cosmopolitan occurrence and major ecological , economic, and medical . The hybrid subspecies that occur in Brazil have predominantly African features and came to be known as Africanized bees . The main characteristics of Africanized bees are aggressive behavior , good disease resistance, high honey production and increased frequency of enxameamentos , which has caused concern to be monitored , the increase in the number of accidents . The aggressiveness and increased frequency of exameamento cause they are repeatedly involved in massive human and animal attacks , making this kind of poisoning a problem of public health. The search for treatments for poisoning has been the subject of several studies . In general , treatments act on the effects caused by poison ( drug ), or the components of poison ( sera and inhibitors) . The main components of the venom are A2 ( PLA2 ) and phospholipase melittin . PLA2 is a major venom proteins , which degrades the plasma membrane of the cells and its effect is potentiated by the presence of melittin . The Apis mellifera PLA2 has determined the protein structure and active site identified . These characteristics qualify PLA2 as a potential target for drug design studies . The strategy for drug design aims to accelerate the identification of ligands , contributing to the process of drug discovery . This study aimed to identify in silico potential inhibitors of PLA2 Apis mellifera , in vitro and in vivo the potential inhibitory activity of selected compounds and identify the in vitro cytotoxicity of the compounds . The structure of PLA2 was obtained from the database (PDB ) and the search for compounds made from Maybridge Chembridge and libraries. The virtual screening was done with the aid of the GOLD program. The identified compounds ( 22 and 68 of the Maybridge Chembridge ) by GOLD programs were filtered with the use of computational tools for the selection of compounds with better interactions in the active site . The parameters used were as filters analyzes of chemical bonds and the fields of molecular interaction. The selected compounds ( 20 and 29 of the Maybridge Chembridge ) were submitted to a group of computer programs for the prediction of physico- chemical characteristics ( drug -like) , toxicity and biological activity of the ligands . The results of the predictions suggest that the compounds of Chembridge were used in experimental analysis . The compounds were obtained from Chembridge library (29 of 49 compounds). The compounds had their potential inhibitory activity evaluated in vitro and in vivo . The phospholipase activity was assessed for compounds 29 and 11 showed inhibitory activity against PLA2 . The 11 compounds were evaluated in vivo experiment with the induction of edema and 5 compounds were able to reduce edema . The compounds were evaluated for cytotoxicity that could cause . The in vitro cytotoxicity was calculated for three of the compounds obtained 5 inhibitors . The result of the experiment identified as cytotoxic compounds 2 and 1 with lower cytotoxicity . Despite the cytotoxicity identified , further studies should be conducted to determine the non-toxic inhibitory concentration . Therefore, the study identified 5 potential specific inhibitors of PLA2 Apis mellifera.

Orientador: Lúcia Helena Brito Baptistella / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:38:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Avanzi_ClaudiadeJesusAguiar_M.pdf: 7514328 bytes, checksum: 45b623664e84c807b0d4d3a0a9b9b5b2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A natureza é uma rica fonte de moléculas estruturalmente diversas, capa-zes de exercer os mais variados efeitos biológicos, e por isso, de grande valor farmacológico, que têm inspirado a confecção de novas drogas não-naturais, potencialmente mais efetivas que as de origem. Num contexto mais amplo, o estudo visou a utilização de moléculas simples e abundantes na natureza, como os terpenos R-(-)-linalol (1) e a-(-)-bisabolol (2), para a síntese de outras mais elaboradas, como o acetato do (1S)-1-hidróxi-óxido de bisabolol A (3), sesquiterpeno com conhecida atividade antimalária, e de derivados análogos. Na maioria dos casos, a etapa principal seria o preparo de sistemas tetraidropiranos (THP's) 2,2,3,6,6-pentassubstituídos, idênticos ou análogos ao anel THP de 3, inicialmente utilizando reações de cicloeterificação da cadeia lateral hidroxílica ?,d-insaturada desses terpenos, ativada como um epóxido, sob catálise de ácidos de Lewis impedidos. Em estudos com o linalol R-(-)-1, os éteres cíclicos THP's foram obtidos em bons rendimentos e em alta regios-seletividade quando a epoxidação da olefina em posição ?,d em relação à hidroxila foi feita com reagente de Shi e a cicloeterificação dos álcoois bisho-moepóxidos com triflato de triisopropilsilil (TIPSOTf). Aplicada ao bisabolol (-)-a-2, em oposição às nossas expectativas, a metodologia não alcançou resul-tados satisfatórios, sendo verificada a formação de diversos produtos, principalmente derivados tetraidrofuranos (THF's), onde se observou o efeito do grupo volumoso p-mentânico de (-)-a-2 na seletividade para produtos de ciclização 5-exo-tet. Em menor extensão, comparativamente às reações do linalol, foi também possível a obtenção de anéis THP's do bisabolol com o uso de triflatos de silício impedidos na etapa de ciclização. Após estas constações, alguns métodos alternativos testados sobre (-)-a-2 foram conduzidos, visando o preparo estereosseletivo de intermediários epóxi-álcoois, mas não foram bem sucedidos, fato atribuido à baixa seletividade dos agentes oxidantes e/ou ineficiência de tamponamento, com ciclizações espontâneas para sistemas THF's. Uma série de outros produtos puderam ser isolados e identificados. Teste de oxidação alílica sobre o derivado THP de (-)-a-2 com o complexo CrO3/3,5-dimetilpirazol forneceu indícios de produto regioisomérico ao desejado. Paralelamente, de posse dos derivados THP's de R-(-)-1, estudos em reações de cicloadição [4+2] foram conduzidos, utilizando-os como dienófilos em presença de silil ceteno acetais conjugados como dienos. Infelizmente, tanto os estudos efetuados nesses casos quanto com outros dienos ricos em elétrons foram insuficientes para se chegar ao cicloadutos de Diels-Alder desejados. Alguns resultados permitiram sugestões, mas que ainda necessitam de melhor investigação. Adicionalmente, foram efetuadas análises biológicas de alguns dos com-postos sintetizados, sendo que dois deles exibiram promissora atividade de inibição de proteínas tirosina fosfatases (PTPs) / Abstract: Nature is a rich source of structurally diverse molecules, able to exercise the most varied biological effects, and therefore of pharmacological value, which have inspired the design of new non-natural drugs, potentially more effective than those of origin. In a broader context, this investigation aimed at the use of simple molecules, abundant in nature, such as the terpenes R-(-)-linalool (1) and a-(-)-bisabolol (2), for the synthesis of other more elaborated, such as the (1S)-1-hydroxy-bisabolol oxide A acetate (3), a sesquiterpene with well-known antimalarial activity, and similar derivatives. In most cases, the key step was the preparation of the 2,2,3,6,6-pentasubstituted tetrahydropiran systems (THP's), identical or similar to the THP ring of 3, using regioselective cyclization reactions of the hydroxylic ?,d-unsaturated portion of these terpenes, activated as an epoxide and catalysed by hindered Lewis acids. THP's cyclic ethers from linalool R-(-)-1 were obtained in good yields and high regioselectivity when the ?,d-hydroxy olefin was submitted to the Shi epoxidation and cycloetherification of the corresponding bishomoepoxy alcohols with triisopropylsilyl triflate (TIPSOTf). Applied to the (-)-a-2, in contrast to our expectations, the methodology has not achieved satisfactory results, leading to several sesquiterpene analogues, with tetrahydrofuran derivatives (THF's) as major products, where it was recognized the effect of the bulky p-menthane group of (-)-a-2 on the selectivity for 5-exo-tet cyclization products. At small extention, when compared to linalool reactions, cyclization with sterically bulkier silyl triflates leads to desired THP's rings of bisabolol. Some alternative methods were also performed envisaging the preparation of hydroxy-epoxide intermediates from (-)-a-2 in a stereoselective manner, but they have not been successful, and it was attributed to low selectivity of the oxidizing agents and/or buffer inefficacy, leading to THF's systems by spontaneous cyclization reactions. A number of others products could be isolated and identified. Allylic oxidation essays on the THP derivatives of (-)-a-2 performed with CrO3/3,5-dimethylpyrazole complex provided evidences to afford a regioisomeric product of the expected one. At the same time, studies on [4+2] cycloaddition reactions with the THP's derivatives of R-(-)-1 were conducted, employing then as dienophiles in the presence of conjugated silyl ketene acetals as dienes. Unfortunately, all our efforts were not sufficient to provide the Diels-Alder cycloadducts, neither then other electron rich dienes were used. A better investigation of these cycloaddition reactions is still necessary. Additionally, biological enzymatic essays of two compounds obtained in this research project displayed promising inhibitory activity against protein tyrosine phosphatases (PTPs) / Mestrado / Quimica Organica / Mestra em Química

A utilização de antígenos de Taenia crassiceps vem se mostrando como via alternativa no imunodiagnóstico da neurocisticercose (NC), sendo as frações de 18 e 14 kDa consideradas específicas. No presente trabalho, foram sintetizados seis peptídeos, com base nas seqüências de aminoácidos das proteínas de 10, 14 e 18 kDa de T. crassiceps e homólogas às seqüências de aminoácidos de T. solium. Os peptídeos foram divididos em \"a\" e \"b\", denominados como, P1a, P2a, P3a e P4a e P1b, P3b e P4b, sendo, as seqüências de aminoácidos dos peptídeos \"a\", uma seqüência interna dos peptídeos \"b\". Em estudo da antigenicidade dos peptídeos conduzido por teste ELISA, P1a e P4a isolados ou utilizados como múltiplos peptídeos antigênicos (MAP) contendo dois, três ou quatro peptídeos, apresentaram reatividade com soro hiperimune anti-líquido vesicular de T. crassiceps, enquanto que MAPs contendo apenas P2a e P3a não foram antigênicos. Anticorpos monoclonais (AcMos) anti-T. crassiceps (n=3) e anti-T. solium (n=19), reconheceram, em ordem decrescente, P1b (72,7%), P1a (45,5%) e P3a e P2a (9,1%), enquanto que P3b, P4a e P4b não apresentaram reatividade com os AcMos utilizados. Com soros humanos de pacientes com NC (NC) e de indivíduos supostamente saudáveis (ISS), P1b e P1a foram considerados potencialmente antigênicos, isolados ou em MAPs com três ou quatro peptídeos. A avaliação do teste ELISA com peptídeo sintético isolado ou MAP, respectivamente, P1b e MAP-a (P1a+P3a+P4a), foi realizada baseando-se em três diferentes cut off, a, b e TG-ROC. De acordo com os cut off utilizados, ELISA com P1b apresentou índices de positividade entre 59,0-79,5% com amostras de soros NC (n=39); 1,3-11,8% com ISS (n=76); 3,4-10,2% com amostras de soros de pacientes com hidatidose provindos do Rio Grande do Sul (H-R) (n=59); 0,0-50,0% com amostras de soros de pacientes com hidatidose provindos do Peru (H-P) (n=8) e 0,0-9,1% com amostras de soros de pacientes com outras parasitoses (OP) (n=33). ELISA com MAP-a apresentou índices de positividade entre 57,7-92,3% com NC (n=26); 1,4-9,6% com ISS (n=73); 0,0-13,3% com H-R (n=15) e 12,5-37,5% com H-P (n=8). Na tentativa de aumentar a positividade do teste ELISA com peptídeos sintéticos, antígeno de 18 e14 kDa de T. crassiceps foi adicionado, porém, não houve maior antigenicidade ao complexo antigênico. Os peptídeos sintéticos utilizados mostraram-se promissores para o diagnóstico sorológico da NC, porém, não foram representativos dos epítopos imunodominantes presentes em cisticercos de T. solium. Outras seqüências de aminoácidos necessitam ser ensaiadas, a fim de obter um complexo antigênico sintético equivalente ao antígeno nativo, porém, o alto custo da síntese dos peptídeos ainda é uma barreira que limita a investigação de novos MAPs. / Taenia crassiceps antigens have been showed like one alternative rote to the immunodiagnosis of neurocysticercosis (NC), where 18- and 14-kDa fractions have been considered specific. In this study, six peptides were synthesized based on 10, 14 and 18 kDa fractions of amino acids sequence of proteins of the T.crassiceps and homologous to T. solium. Peptides were divided in \"a\" and \"b\", denominated P1a, P2a, P3a and P4a and P1b, P3b and P4b, being that amino acids sequences of the \"a\" peptides are one internal sequence of the \"b\" peptides. In antigenic study of the peptides conducted by ELISA, isolated P1a and P4a peptides or used like multiple antigenic peptides (MAP) with two, three or four peptides, cross-reacted with anti-vesicular fluid of the T. crassiceps hyperimmune serum, while that, MAPs with only P2a and P3a did not showed antigenicity. Monoclonal antibodies (Mabs) anti-T. crassiceps (n=3) and anti-T.solium (n=19) Mabs recognized in decreasing order, P1b (72,7%), P1a (45,5%) and P3a and P2a (9,1%), while, P3b, P4a and P4b did not showed reactivity with Mabs used. In human serum samples of the patients with neurocysticercosis (NC) and serum healthy individuals (HI), where P1b and P1a peptides were analyzed isolated or in MAPs with three or four peptides, both of them showed antigenic potential. The evaluation of the ELISA tests with synthetic peptides isolated or in MAPs, P1b and MAP-a (P1a+P3a+P4a), respectively, was analyzed in three differents cut off, a, b and TG-Roc. Based on its, ELISA assayed with P1b showed 59,0-79,5% positivity when NC serum samples where tested (n=39); 1,3-11,8% with HI serum samples (n=76); 3,4-10,2% with human serum samples of the patients with hydatidosis from Rio Grande do Sul (H-R) (n=59); 0,0-50,0% with human serum samples of the patients with hydatidosis from Peru (H-P) (n=8) and 0,0-9,1% with human serum samples of the patients with others parasitoses (OP) (n=33). By the way, ELISA assayed with MAP-a showed 57,7-92,3% positivity with NC (n=26); 1,4-9,6% with HI (n=73); 0,0-13,3% with H-R (n=15) and 12,5-37,5% with H-P (n=8). On the attempt of increase the positivity of the ELISA test using synthetic peptides, 18- and 14-kDa fractions of the T. crassiceps was added, but they did not promoted more antigenicity. Synthetic peptides used showed promising results on neurocysticercosis serumdiagnosis, but they were no representatives of dominants epitopes present in T. solium cysticercus. Others amino acids sequences need be used to have a synthetic antigenic complex similar to native antigens, however, the high cost of the peptide synthesis still is a problem that limit the study of the news MAPs.

Anteriormente, foi identificada a atividade esquistossomicida da piplartina, um alcalóide-amida isolado em nossos estudos de bioprospecção em plantas da família Piperaceae. Neste trabalho, foi analisada a estrutura e as propriedades de uma série de análogos da piplartina para avaliar a relação estrutura-atividade. A atividade de análogos sintéticos da piplartina foi avaliada in vitro em vermes adultos de S. mansoni. Primeiro, os análogos foram testados a 50 e 100 μg/mL. Os compostos ativos foram selecionados para a determinação dos valores de IC50. Ao todo, 36 análogos com modificações em três regiões da piplartina foram avaliados. Todas as modificações tiveram uma influência negativa na atividade biológica; no entanto, uma seletividade específica entre os gêneros foi observada. Seis análogos tiveram os valores de IC50 determinados, variando entre 72,33 a 216,86 μM. As diferenças na atividade esquistossomicida entre a piplartina e seus análogos podem ser atribuídas a alterações na forma, equilíbrio hidrofílico-lipofílico e distribuição de carga eletrostática. / Previously, the schistosomicidal activity of piplartine, an alkaloid-amide isolated in our bioprospection studies with plants from Piperaceae species, was identified. In this work, we analyzed the structure and properties of a series of piplartine derivatives to propose a structure-activity relationship model. In vitro activity was evaluated in S. mansoni adult worms exposed in vitro to piplartine synthetic analogs. First, analogs were screened at 50 and 100 μg/mL. Active compounds were selected to the determination of IC50 values. A total of 36 synthetic piplartine analogs with modifications in three regions of the piplartine molecule were evaluated. All the modifications had a negative influence in the biological activity; nevertheless, a gender specific selectivity was observed. Of all the analogs, 6 had the IC50 values determined, ranging from 72.33 a 216.86 μM. Differences in the schistosomicidal activity between piplartine and its analogs could be attributed to changes in shape, hydrophilic-lipophilic equilibrium and electrostatic charge distribution.

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Resumo: As consequências da poluição ambiental não se limitam a danos ao ambiente, mas também atingem diretamente a saúde humana. Recentemente, a Organização Mundial de Saúde divulgou que um terço da população mundial não tem acesso a água potável e, mesmo quando existe, há o perigo desta conter poluentes nocivos à saúde, e que não foram totalmente eliminados após as etapas de tratamento. Nesse contexto, os possíveis efeitos toxicológicos dos resíduos dos compostos corantes descartados pela indústria têxtil em rios que abastecem cidades vêm sendo investigados, na tentativa de eliminar, ou mesmo reduzir, os riscos para as populações expostas. Assim, este estudo foi delineado com o objetivo de avaliar o potencial carcinogênico de amostras de água sob a influência de atividades têxteis (água do Ribeirão Quilombo - RQ - e do efluente tratado da Estação de Tratamento de Esgoto - ETE - de Americana, SP) em cólon de ratos e o potencial toxicogenômico dos corantes sintéticos Disperse Red 1 (DR1) e Disperse Blue 291 (DB291) em células de medula óssea, sangue periférico, fígado e rins de camundongos. Foi também investigado o potencial tóxico-reprodutivo do DR1 em células germinativas de camundongos. Os resultados mostraram que a exposição crônica às amostras de água do RQ e do efluente tratado da ETE não induziram lesões pré-neoplásicas no cólon de ratos, mas foram detectados sinais de hepatotoxicidade. Em relação aos corantes DR1 e DB291 foi observado aumento na frequência de micronúcleos em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: / Doutor

Dentro de la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (LGIC) se encuentra la familia de los receptores Cys-loop que incluye a canales catiónicos, como los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) y los receptores 5-HT3 de serotonina; y canales aniónicos, como los activados por GABA (GABAA) y glicina. Estos receptores revisten importancia tanto en la fisiología normal como así también en diversas y muy variadas patologías, entre las que se pueden mencionar las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Este hecho los posiciona como blancos moleculares importantes para el desarrollo de nuevos fármacos, y es por esto que el conocimiento de su función y modulación resulta un aspecto clave. Los receptores Cys-loop son proteínas transmembrana, por lo que su función se encuentra condicionada por su entorno lipídico y estímulos propios de la membrana celular, además de por distintos estímulos o factores externos a ella. Están formados por 5 subunidades organizadas pseudo-simétricamente alrededor de un poro o canal central. En estos receptores pueden distinguirse un dominio extracelular (ECD, del inglés extracellular domain), donde se encuentran los sitios de unión al agonista y/o antagonistas, un dominio transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domain), que contiene el canal iónico y que se encuentra en extenso contacto con los lípidos de la membrana, y un dominio pequeño intracelular (ICD, del inglés intracellular domain), que contiene distintos sitios de regulación y señalización intracelular. En esta Tesis Doctoral se profundizó en el estudio de la función y modulación de 2 receptores de neurotransmisores pertenecientes a los receptores Cys-loop: los nAChRs, muscular y α7 neuronal, y los receptores 5-HT3. En el capítulo I se estudió la modulación del nAChR muscular por el entorno lipídico de la membrana en la que se encuentra. Se hizo foco especialmente en el colesterol (Col), lípido clave para el correcto funcionamiento del nAChR y que presenta distintas asimetrías laterales y transmembrana en diferentes momentos de la vida y en condiciones de salud o enfermedad. Se trabajó con distintos sistemas modelo: vesículas unilamelares grandes (LUVs), vesículas unilamelares gigantes (GUVs), membranas ricas en nAChR de T. californica o células BOCSC 23 expresando heterologamente el nAChR muscular. A cada uno se le realizaron distintos tratamientos para modificar las condiciones de Col con el fin de obtener sistemas que presenten: i) un aumento del contenido de Col, ii) un aumento de esteroles en la hemicapa externa (por agregado de colesterol hemisuccinato (CHEMS)), o iii) transformación de parte del Col a colestenona (por la enzima colesterol oxidasa (Cox)). Mediante estudios de fluorescencia utilizando las sondas DPH, TMA-DPH y Laurdan se determinó que el orden de membrana aumentó cuando se incorporó CHEMS. Mediante estudios de espectrofotometría utilizando la sonda cristal violeta (CrV) y la técnica de patch-clamp se detectaron, respectivamente, modificaciones conformacionales en el nAChR y cambios en la activación del mismo cuando los diferentes sistemas habían sido incubados con CHEMS o Cox, no así con Col. Tratando LUVs con Tritón, y posterior centrifugación y separación por SDS-PAGE, se determinó que luego de la incorporación de Col o CHEMS al sistema, el nAChR se localizó mayoritariamente en fracciones ordenadas, mientras que cuando se produjo la transformación del Col a colestenona el receptor se localizó principalmente en fracciones desordenadas. Por último, estudios de microscopía confocal utilizando GUVs mostraron que alteraciones en el Col causaron cambios significativos en la presencia y distribución de dominios ordenados y desordenados; y que la presencia de un componente proteico en el sistema, como es un péptido representativo del segmento transmembrana yTM4 del nAChR, alteró las características de la membrana, llevando a todo el sistema a un mayor orden. De acuerdo con estos resultados, distintas modificaciones del Col en la membrana llevan a cambios de su orden y asimetría, y al mismo tiempo a cambios en la localización del nAChR en un determinado entorno, hecho que repercute directamente en su funcionalidad. Su localización en dominios ordenados ocasiona una disminución de su actividad, mientras que su presencia en dominios más desordenados lleva a un aumento de su función. De esta manera, la localización del nAChR en uno u otro dominio podría explicar los cambios en la señal colinérgica reportados en situaciones de envejecimiento y/o patologías como la EA. Existen numerosas evidencias de interacciones funcionales entre los péptidos β-amiloide (Aβ), involucrados en la enfermedad de Alzheimer, y el nAChR α7. En el capítulo II se estudió la modulación del nAChR α7 neuronal por oligómeros de Aβ1-40 y Aβ1-42. Se ha postulado que la acumulación excesiva de estos péptidos en el cerebro provoca la formación de placas seniles, directamente relacionadas con el proceso de neurodegeneración e inflamación característico de esta enfermedad. Sin embargo, evidencias más recientes sugieren que las especies más neurotóxicas serían las formas oligoméricas de Aβ. Mediante estudios de fluorescencia utilizando la sonda CrV se demostró que los oligómeros de Aβ provocan cambios conformacionales en el receptor α7. Utilizando la técnica de patch clamp se determinó que dichos oligómeros son capaces de activar al receptor α7 en muy bajas concentraciones y que, a concentraciones más altas, disminuyen la potenciación de α7 por moduladores alostéricos positivos (PAMs, positive allosteric modulators). Estos resultados muestran un rol dual de los oligómeros de Aβ dependiente de su concentración, como agonistas y como moduladores negativos de α7. El efecto agonista, potenciador de la señal colinérgica, podría tener un rol importante en la fisiología normal del individuo, mientras que el efecto inhibitorio, dado por su exacerbada producción, podría contribuir a la deficiencia en la memoria y cognición asociada a la EA. Teniendo en cuenta las características multifactoriales de la EA, la estrategia de búsqueda de nuevas moléculas apunta al descubrimiento y desarrollo de “multitarget drugs”, es decir de moléculas activas en varios blancos moleculares, por lo que el capítulo III se centró en el descubrimiento y optimización de nuevas moléculas bifuncionales que sean capaces de activar al nAChR e inhibir a la acetilcolinesterasa (ACE). Partiendo de un screening de extractos obtenidos de distintas plantas medicinales, mediante técnicas cromatográficas y de resonancia magnética nuclear se identificó a la molécula de cafeína como una molécula sumamente interesante para la EA. Además de confirmar su ya conocida actividad inhibidora de la ACE, utilizando técnicas de espectrofotometría con la sonda fluorescente CrV y de patch-clamp, en este trabajo se postula su actividad agonista sobre los nAChRs muscular y α7 neuronal. Caracterizada la actividad de la cafeína sobre el sistema colinérgico, se obtuvieron luego 5 análogos sintéticos de esta molécula mediante diseño racional. Se determinó que todos los análogos presentan actividad sobre ambos blancos moleculares, la ACE y los nAChRs, y cuya potencia es mayor a la de la cafeína. Mediante estudios de modelado molecular y docking se identificaron los sitios de inhibición de los análogos de la cafeína en la ACE y de interacción con el nAChR permitiendo postular a estos compuestos como agonistas parciales. Estos hallazgos resultan prometedores en la búsqueda de nuevos fármacos como una estrategia terapéutica para la EA. El otro receptor estudiado en este trabajo de Tesis fue el receptor 5-HT3, uno de los menos conocidos de la familia de los Cys-loop, el cual a nivel presináptico participa de la finalización de la señal nerviosa, tornándose un blanco molecular novedoso tanto en la EA como en otras patologías neurodegenerativas que requieran una potenciación de dicha señal. En el capítulo IV, utilizando el receptor de alta conductancia 5-HT3AHC, se descifraron por primera vez las diferencias entre la activación ortostérica del mismo y su activación alostérica por timol y carvacrol. Mediante la técnica de patch clamp, combinando registros de corrientes macroscópicas en la configuración whole-cell y de canal único en la configuración cell-attached, se caracterizó en primer lugar la activación del receptor humano 5-HT3AHC por los agonistas ortostericos 5-HT y triptamina, y luego la activación alostérica mediada por 2 terpenoides, carvacrol y timol. Se confirmó que tanto el carvacrol como el timol se comportan macroscópicamente como agonistas menos eficaces que 5-HT. Sin embargo, a nivel de canal único, estos 2 terpenoides activan a los receptores 5-HT3A con mayor eficacia que 5-HT. Más aún, se determinó que además de actuar como agonistas, el carvacrol y el timol actúan como modulares alostéricos positivos del receptor 5-HT3AHC humano, y que el efecto potenciador es evidente a concentraciones menores que el efecto agonista. De esta manera, los resultados de este capítulo permitieron definir las bases mecanísticas que subyacen a las diferencias entre la activación y potenciación alostérica u ortostérica del receptor humano 5-HT3A. En resumen, en este trabajo de Tesis se profundizó en el conocimiento de distintas formas de modulación de los nAChRs y del receptor 5-HT3, ya sea por moléculas exógenas o por el entorno lipídico en el que se encuentran, brindando bases moleculares para el entendimiento de su función, su modulación y su afección en determinadas patologías como la EA. En este trabajo se lograron avances significativos, con resultados de gran relevancia, ya sea para el estudio o tratamiento de esta enfermedad. / The Cys-loop receptor family, which belongs to the Ligand-gated ion channel (LGIC) superfamily, includes cation channels, such as nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) and serotonin 5-HT3 receptors, and anion channels, such as those activated by GABA (GABAA) and glycine. These receptors are important in normal physiology and in various pathologies, among which neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD), are included. They are therefore important molecular targets for the development of new drugs, this being the reason why the knowledge of their function is indeed a very interesting aspect worth exploring. Cys-loop receptors are integral membrane proteins whose function is conditioned by their lipid environment as well as by different extrinsic factors. These receptors are formed by five subunits organized pseudo-symmetrically around a central pore. Three different domains can be distinguished: an extracellular domain (ECD), where the agonist and/or antagonist binding sites are localized, a transmembrane domain (TMD), which contains the ion pore and is in extensive contact with membrane lipids, and a small intracellular domain (ICD), which is important for the conductance of the channel and modulation. In this Doctoral Thesis, the function and modulation of two neurotransmitter receptors that belong to the Cys-loop receptor family, nAChRs and 5-HT3 receptors, were explored by using a large variety of fluorescence, confocal microscopy and electrophysiological approaches. In Chapter I, modulation of the muscle nAChR by its lipid environment was studied. Special attention was put on cholesterol (Chol), which displays different lateral and transmembrane asymmetries all throughout life as well as under health and disease conditions. This lipid is crucial for the proper functioning of the nAChR. Different model systems were used: large unilamellar vesicles (LUVs), giant unilamellar vesicles (GUVs), T. californica nAChR rich membranes and BOSC 23 cells heterologously expressing the muscle nAChR. The experimental systems were subjected to different treatments to modify their Chol conditions resulting in: i) an increment in Chol content, ii) an increment in sterols in the outer layer (after addition of cholesteryl hemisuccinate (CHEMS)), and iii) conversion of part of the Chol to cholestenone (through the enzyme Cholesterol Oxidase (ChOx)). Through fluorescence studies using DPH, TMA-DPH and Laurdan probes it was determined that the membrane order increased when CHEMS was incorporated. By using the fluorescent probe Crystal Violet (CrV) and patch-clamp recordings, conformational changes of the nAChR associated to changes in its activation properties were detected after incubation with either CHEMS or ChOx, but not with Chol. By treating LUVs with Triton, and subsequent centrifugation and separation by SDS-PAGE, it was determined that after incorporation of Chol or CHEMS to the system the nAChR was located mostly in ordered fractions, while after the conversion of Chol to cholestenone the receptor was found in disordered fractions. Confocal microscopy studies using GUVs showed that Chol alterations caused significant changes in the presence and distribution of ordered and disordered domains, and that the mere presence of a protein component in the system, specifically a peptide corresponding to the forth transmembrane segment of the nAChR (M4), led to a higher order of the entire system. According to our results, we conclude that modifications of membrane Chol lead to changes in membrane order and asymmetry, and, at the same time, in the location of the nAChR, a fact that would directly affect its functionality. The location of the nAChR in ordered domains causes a decrease in its activity whereas its location in more disordered domains enhances its function. In this way, the location of the nAChR in one or another domain fine-tunes its function and could explain the changes in the cholinergic signal reported in situations of aging and/or pathologies, such as AD. There is increasing evidence of functional interactions between β-Amyloid (Aβ) peptides, involved in Alzheimer's disease, and α7 nAChR. In Chapter II, modulation of α7 nAChR by Aβ1-40 and Aβ1-42 oligomers was studied. It has been postulated that the accumulation of these peptides in the brain causes the formation of senile plaques, which are directly related to the neurodegeneration and inflammation observed in AD. However, more recent evidence suggests that the most neurotoxic species are the oligomeric forms of Aβ. Fluorescence studies using the CrV probe demonstrated that Aβ oligomers cause conformational changes in the α7 receptor, which were dependent on the concentration. Accordingly, single channel recordings revealed that whereas at very low concentrations (pM to nM range) these oligomers are capable of activating the α7 receptor, at higher concentrations, which are compatible with those found in AD patients, they decrease the enhancement of α7 by positive allosteric modulators (PAMs). These results show a dual role of Aβ oligomers depending on their concentration, as agonists and as negative modulators of α7. The agonist effect, which enhances the cholinergic signal, could have an important role in normal physiology, while the inhibitory effect, given by the exacerbated production of Aβ, could contribute to the failure in memory and cognition associated with AD. Taking into account that Alzheimer’s is a multifactorial disease, the search for new molecules aims at discovering and developing “multitarget drugs”. Chapter III is focused on the discovery and optimization of new bifunctional molecules capable of activating the nAChR and inhibiting the AChE. Starting from a screening of extracts obtained from different medicinal plants and using chromatographic techniques and nuclear magnetic resonance, the caffeine molecule was identified as a highly interesting molecule for AD. In addition to its already known AChE inhibitory activity, using CrV fluorescence probe and patch-clamp techniques we postulated its agonist activity in the muscle and α7 nAChRs. After having characterized the activity of caffeine in the cholinergic system, five synthetic analogs of this molecule were obtained by rational design. It was determined that all the analogs have activity in both molecular targets, the AChE and the nAChRs, and that they have a greater potency than caffeine. Through docking studies, the sites of inhibition of caffeine analogs in the AChE and the sites of interaction with the nAChRs were proposed. These compounds are promising as new drugs for a therapeutic strategy for AD. The other receptor explored in this Thesis was the 5-HT3 receptor, one of the least known of the Cys-loop family, which has been recently proposed as a novel molecular target both in AD and in other neurodegenerative pathologies. In Chapter IV, by taking advantage of the high-conductance receptor 5-HT3AHC, differences between orthosteric and allosteric activation of the human 5-HT3A receptor were deciphered for the first time. By using the patch clamp technique, and combining macroscopic current recordings in the whole-cell configuration and single channel recordings in the cell-attached configuration, the activation of the human 5-HT3AHC receptor by the orthosteric agonists, 5-HT and tryptamine, and the allosteric activation, by carvacrol and thymol, were described. Both carvacrol and thymol were less effective agonists than 5-HT at the macroscopic level. However, at the single channel level, these two terpenoids activated 5-HT3A receptors more efficiently than 5-HT. Furthermore, it was demonstrated that in addition to acting as agonists, carvacrol and thymol behave as positive allosteric modulators of the human 5-HT3AHC receptor at low concentrations. In this way, these results made it possible to define the mechanistic bases underlying the differences between orthosteric and allosteric activation and potentiation of the human 5-HT3A receptor. Summing up, in this Doctoral Thesis we deepened into the knowledge of modulation of the nAChRs and the 5-HT3 receptor, either by extrinsic molecules or by the lipid environment in which they are located. Our findings provide molecular bases for the understanding of the function and modulation of these receptors and their implication in certain pathologies, such as AD. In this work, significant advances with highly relevant results were made for the study or treatment of this disease.

[EN] The correlation between the audience and their attendance to classical music concerts is one of the biggest concerns that professionals have when planning the programmes they offer in their Halls. In this doctoral work we intended to contact music experts and users in order to be able the analyse, from a variety of perspectives, the main criteria organizers have to plan their classical music seasons and how the public reacts to this information. We designed strategies to mesure the impact of those criteria and evaluated some selected listener's opinions so that we could find possible synergies between the parameters previously mentioned. / [ES] La relación entre el público y su asistencia a conciertos de música clásica es una de las mayores preocupaciones que tienen los profesionales al desarrollar las programaciones que ofrecen en sus salas. En esta investigación nos propusimos acercarnos a los especialistas y a los usuarios para, desde diferentes perspectivas, analizar cuáles son los principales criterios por los que se rigen los programadores al elaborar sus temporadas y qué efecto provoca esto en el público. Diseñamos estrategias para medir el impacto de dichos criterios y estudiamos la opinión de unos oyentes específicos, con la finalidad de encontrar sinergias entre estos perfiles. / [CA] La relació entre el públic i la seua assitència a concerts de música clàssica és una de les majors preocupacions que tenen els professionals en desenvolupar les programacions que ofereixen en les seues sales. En aquesta recerca ens vam proprosar acostar-nos als especialistes i als usuaris per a, des de diferents perspectives, analitzar quins són els principals criteris pels quals es regeixen els programadors en elaborar les seues temporades i quin efecte provoca açò en el públic. Dissenyem estratègies per a mesurar l'impacte d'aquests criteris i estudiem l'opinió d'uns oients específics, amb la finalitat de trobar sinergias entre aquests perfils. / Pascual Insa, I. (2015). Acercamiento de la música clásica al público del Siglo XXI [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/59431

Resumo: As técnicas mais usadas atualmente para alterar o fluxo metabólico por uma determinada via são a deleção e/ou inserção de sequências regulatórias ou genes no cromossomo bacteriano. Estes são métodos que alteram permanentemente a via metabólica em questão, perturbando o balanço metabólico durante a fase lag de crescimento, o que muitas vezes leva a um excessivo prolongamento desta fase além de diminuir a viabilidade celular. O metabolismo de purinas em Bacillus subtilis tem grande potencial para manipulação genética e produz metabólitos com valor biotecnológico. Cinco riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE e pbuG) controlam o metabolismo de purina em B. subtilis promovendo a terminação precoce da transcrição em ligação com guanina ou adenina. O GTP gerado nesta via é utilizado na biossíntese da vitamina B2 (riboflavina), apresentando o mesmo mecanismo de regulação com riboswitch de flavina-monofosfato (ribDG). Neste estudo, um novo modelo de controle de metabolismo de purina foi construído visando o aumento reversível do fluxo de carbono pela via em B. subtilis utilizando pequenos RNAs não-codificadores sintéticos (sRNAs). Estes foram desenhados e sintetizados para interferir na regulação da expressão gênica realizada pelos riboswitches, mantendo assim a via biossintética ativa. Os riboswitches foram caracterizados por uma nova metodologia in vitro na presença dos ligantes guanina, adenina ou FMN, e nas células de B. subtilis, sendo possível constatar o papel regulador sobre o op... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The currently employed tools to redirect metabolic flux through a specific pathway are deletion and/or insertion of regulatory sequences or genes in the bacterial chromosome. These methods permanently modify the pathway perturbing the metabolic balance during the lag growth phase, which generally extends this process and also decreases cell viability. The purine metabolism in Bacillus subtilis has great potential for genetic manipulation and produces value-added biotechnological products. Five riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE and pbuG) control the purine metabolism in B. subtilis by promoting the premature transcription termination guided by guanine or adenine levels in the cell. The GTP generated in this pathway is used in the biosynthesis of vitamin B2 (riboflavin), which is regulated by a flavin-monophosphate riboswitch (ribDG). In this study, a new metabolism control model was developed aiming to reversibly increase the carbon flux through selected pathways employing small synthetic non-coding RNAs (sRNAs). These sRNAs were designed and synthesized to interfere with the regulation of gene expression performed by the riboswitches, thus maintaining the biosynthetic pathways active. The riboswitches were characterized by a new in vitro methodology in the presence of the ligands: guanine, adenine or FMN. The riboswitches were characterized in B. subtilis cells using the luxABCDE bioluminescence operon as reporter. Synthetic sRNAs were designed in the Ribomaker software to ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O uso e produção de fibra de carbono têm crescido nas últimas três décadas em diversas aplicações como aeroespacial, automotiva, nuclear, naval e construção civil. Isto é devido ao desempenho que este material possui quando comparado com os tradicionais componentes metálicos. A geração de resíduo de fibra de carbono tem aumentado a cada ano e isto tem impulsionado estudos e aprimoramento dos métodos de recuperação de fibras de carbono. Dentre os mais usuais métodos existentes, pode-se destacar a pirólise. O objetivo do presente trabalho consiste em recuperar fibras de carbono determinando e avaliando os parâmetros do processo de pirólise visando o potencial de reutilização destas fibras em novos compósitos. O compósito utilizado foi doado a partir de um descarte industrial. Para caracterizar o compósito, foram empregadas as técnicas de análise térmica (TGA), espectrometria de massa (QMS), análise estrutural em MEV juntamente com a análise pela energia dispersiva de espectroscopia de raio-X (EDS). Durante o aquecimento em atmosfera inerte, ocorre a liberação de compostos orgânicos proveniente da matriz polimérica, e as fibras de carbono permanecem intactas. As fibras de carbono recuperadas foram analisadas em MEV e EDS a fim de verificar a ocorrência de defeitos superficiais, como, resíduos da matriz polimérica, carbonização, rompimento da fibra entre outros. Os resultados obtidos mostram que pela pirolise feita a 550°C por 1h é possível de se obter fibras de carbono livres da matriz polimérica. Após o processo de pirólise nesta condição as fibras não apresentam poros, fratura do material e carbonização. / The last three decades were marked by the expansion of production and research of carbon fiber in several applications such as automotive, nuclear, navy and construction. This is a result of the extraordinary performance that this material presents when compared with the traditional metallic materials. Each year, there has been an increase of the generation of carbon fiber composite waste which has motivated studies and improvement of the current recovering processes of carbon fiber. Among the most usual methods of recovering, there is the pyrolysis method. The present study aims to recover carbon fiber from polymeric composite while evaluating parameters of the pyrolysis process focusing on the potential of reusing the recovered carbon fiber in new composites. The composite material used in this work had been acquired by donation of an industrial disposal. In order to characterize the composite, thermogravimetric analysis was done (TGA), mass spectrometry (QMS), structural analysis by SEM and analysis by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS). During heating in an inert atmosphere, there were release of organic compounds from the polymeric matrix and the carbon fibers remain untouched. Carbon fibers recovered were analyzed by SEM and EDS to verify the occurrence of superficial defects such as, traces of residual polymer matrix, carbonization, fiber breakage among others. The results show that through pyrolysis held at 550°C for 1 hour it is possible to obtain carbon fibers free of the polymeric matrix. After the pyrolysis process in this condition fibers did not presented pores, carbonization or rupture of the material.

O acetato de ciproterona é um esteróide sexual sintético com atividade antiandrogênica, antigonadotrópica e progestagênica. O objetivo deste estudo foi avaliar a bioequivalência de duas marcas comerciais de comprimidos contendo 100 mg de acetato de ciproterona em voluntários sadios. O ensaio foi do tipo quantitativo direto, com delineamento aleatório, cruzado e aberto, formando-se dois grupos de voluntários, A e B. Entre as fases houve um período de \"wash out\" de 27 dias, correspondente a, no mínimo, 10 vezes o valor de meia-vida de eliminação de acetato de ciproterona. Amostras de sangue foram coletadas em tubo heparinizado até 216 horas após a administração dos produtos. A bioequivalência dos produtos foi avaliada quantificando-se o fármaco em plasma, através de metodologia bioanalítica desenvolvida e previamente validada. As curvas médias de decaimento plasmático obtidas para os produtos teste (Androsteron® 100 mg - Bergamo, lote PI0004) e referência (Androcur® 100 mg Schering, lote 14616A) foram semelhantes, da mesma forma que as médias dos parâmetros farmacocinéticos Cmax (referência: 159,05 ng/mL; teste: 170,40 ng/mL), tmax (referência: 3,59 h; teste: 3,50 h) e ASC0-t (referência: 5563,03 ngxh/mL; teste: 5453,80 ngxh/mL) e ASC0-∞ (referência: 6266,22 ngxh/mL; teste: 6218,31 ngxh/mL). No presente estudo, a análise de variância (ANOVA) realizada para avaliação do efeito de produto, grupo e período em relação aos parâmetros farmacocinéticos avaliados demonstrou ausência destes efeitos em ASC0-t e ASC0-∞ para os valores calculados com todos os picos da curva plasmática. A ANOVA indicou ainda ausência de efeito de produto e período para Cmax, mas presença de efeito grupo para este parâmetro. Entretanto a constatação do efeito grupo não significa que as formulações avaliadas não sejam bioequivalentes, apenas que há uma diferença entre os grupos de indivíduos. Os valores do intervalo de confiança 90% para a razão de Cmax, (91,0 a 117,9%), ASC0-t (88,4 a 107,8%) e ASC0-∞. (90,6 a 107,8%) encontram-se entre 80 a 125 %, intervalo proposto pelo FDA e ANVISA. Desta forma, a avaliação dos resultados obtidos permite concluir que não houve diferença significativa entre as formulações teste e referência, ou seja, as duas formulações possuem biodisponibilidades estatisticamente equivalentes, em termos de velocidade e extensão da absorção. / Cyproterone acetate (6-chloro-1β,2βα-dihydro-17-hydroxy-3\'H-cyclopropa[1,2] pregna - 1,4,6-triene-3,20-dione acetate) (CPA) is a synthetic steroid with antiandrogenic and progestogenic properties. The aim of the present study was to evaluate the bioequivalence of two cyproterone acetate formulations. The bioequivalence of cyproterone acetate 100 mg tablets was determined in healthy volunteers after a single dose in a randomized crossover study, with a 27 days washout period between the doses. Reference (Androcur®) and test (Androsteron®) products were administered to twenty-four volunteers with 200 mL water after overnight fasting. Blood samples were taken up to 216 h post dose, the plasma was separated and the concentrations of cyproterone acetate were measured using a simple and rapid chromatographic method (HPLC). The pharmacokinetic parameters AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, tmax and t(1/2)el were calculated for both formulations from plasma concentration time profiles. The calculated pharmacokinetic parameters were compared statistically to evaluate bioequivalence between the two brands and no significant differences between the two studied formulations were found. The 90% geometric confidence intervals of the mean ratio of In-transformed Cmax, AUC0-t and AUC0-∞ values were between 91,0 and 117,9% (Cmax), 88,4 and 107,8% (AUC0-t) ando 90,6 and 107,8% (AUC0-∞), and thus within the acceptance ranges, satisfying the bioequivalence criteria of the European Committee for Proprietary Medicinal Products and the US Food and Drug Administration Guidelines. In the Iight of the present study it can be concluded that the two evaluated cyproterone acetate formulations are bioequivalent in terms of the rate and extent of absorption.