Introdução: O tratamento da Rinossinusite Crônica (RSC) tem sofrido poucos avanços nas últimas décadas. Uma das barreiras na aquisição de novas terapias é a falta de conhecimento pleno sobre sua fisiopatogenia. A carência de avanço decorre principalmente da complexa e provável multifatorialidade da RSC, associada à inexistência de um bom modelo animal que possa mimetizar os fenômenos biológicos que ocorrem em humanos. A maioria dos modelos animais de RSC descrita na literatura mimetiza uma infecção aguda ou promove bloqueio das vias de drenagem que, na maioria das vezes, não corresponde aos mecanismos encontrados nas RSC em humanos. Por outro lado, diversas evidências indicam que as bactérias exercem importante papel na fisiopatogenia da RSC, possivelmente pela presença de biofilmes ou indução de inflamação crônica promovida por endo e exotoxinas. Objetivo: Neste estudo avaliou-se a viabilidade de um modelo experimental de RSC em coelhos, utilizando-se a exposição crônica de toxinas bacterianas em animais previamente sensibilizados à ovalbumina (OVA), analisando seus efeitos histopatológicos sobre a mucosa nasossinusal. Material e Métodos: Após indução de sensibilização com injeção subcutânea de OVA 2,5% e 0,4% de hidróxido de alumínio por duas semanas, os coelhos foram submetidos à implantação de cateter de longa duração em seio maxilar direito. Após, foram submetidos à irrigação nasossinusal com OVA 2,5% três vezes por semana, por duas semanas, e em seguida, irrigação de soluções contendo diferentes toxinas bacterianas (enterotoxina estaflocócica B (SEB) 1 ?g/mL, lipopolissacáride (LPS) 100 ng/mL e ácido lipotecóico (LTA) 100 ng/mL) por quatro semanas. Os animais foram sacrificados 24 horas após a última irrigação e a mucosa do seio maxilar direito (teste) e esquerdo (controle interno) foi coletada para avaliação histopatológica. Resultados: A exposição nasossinusal ao SEB causou espessamento epitelial, infiltração celular, eosinofilia e neutrofilia tecidual, além de redução do epitélio ciliado. A exposição ao LPS causou espessamento epitelial e subepitelial, infiltração celular, eosinofilia epitelial e subepitelial e aumento da fibrose subepitelial. O LTA causou espessamento epitelial e subepitelial, infiltração celular e eosinofílica subepitelial e aumento da fibrose subepitelial. Conclusão: A exposição crônica de toxinas bacterianas na mucosa nasossinusal promoveu alterações histológicas, como espessamento da mucosa e infiltração celular, semelhantes às encontradas em pacientes com RSC. O presente estudo demonstrou que este é um modelo animal viável de RSC. Mais estudos serão necessários para elucidar se os mecanismos patogênicos deste modelo são semelhantes aos observados em humanos. / Background: The treatment of chronic rhinosinusitis (CRS) has had little evolvement in the last decades. One of the barriers to the development of new therapies is the lack of knowledge about CRS pathophysiology. The complexity and multifactoriality of this disease, together with the inexistence of a proper animal model of CRS, are probably the causes for the few advances in CRS therapy. Most of the animal models of CRS resemble acute infection or promote sinonasal obstructions, which are not a very common etiologies in CRS patients. However, there has been a lot of evidence that bacteria play an important role in the pathophysiology of CRS, probably due to the presence of biofilms, or the chronic inflammation induced by endo e exotoxins. Objective: This study aims to evaluate the viability of an experimental model of CRS in rabbits through the use of bacterial toxins in previously sensitized animals with ovalbumin, analyzing its histopathological effects onto the sinonasal mucosa. Materials and Methods: After inducing ovalbumin (OVA) sensitization by intradermic injection of OVA 2,5% and 0,4% aluminum hydroxide for 2 weeks, rabbits underwent maxillary sinus instillation of OVA 2,5% three times a week for 2 weeks followed by sinus lavage with either one bacterial toxin (Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) 1 ?g/mL, lipopolysaccharide (LPS) 100 ng/mL, lipoteichoic acid (LTA), 100 ng/mL) for 4 weeks. Rabbits were euthanised 24 hours after the last sinus lavage and the mucosa of right maxillary sinus (tested side) and left side (control) were collected for histopathological evaluation. Results: The sinonasal exposure to SEB resulted in epithelial thickening, inflammatory cells infiltration (tissue eosinophilia and neutrophilia) and reduction of ciliated cells. The exposure to LPS resulted in epithelial and subepithelial thickening, inflammatory cells infiltration, epithelial and subepithelial eosinophilia and increased subepithelial fibrosis. The exposure to LTA resulted in epithelial and subepithelial thickening, subepithelial inflammatory cells infiltration and eosinophilia and increased subepithelial fibrosis. Conclusion: This study reported the effects of bacterial toxins on the the sinonasal mucosa of ovalbumin-sensitized rabbits, demonstrating similar changes that are observed in CRS patients. Our results show that this is a viable animal model of CRS. Further studies are need to elucidate whether the pathomechanisms in this model are similar to what are observed in humans.

<p>Staphylococcus aureus је често присутан у вимену крава где може да узрокује појаву субклиничких и клиничких маститиса. Због способности синтезе термостабилних стафилококних ентеротоксина представља чест узрок тровања храном код људи. Многи аутори бавили су се испитивањем патогености сојева Staphylococcus aureus са аспекта здравља вимена, као и испитивањем патогености сојева пореклом из стадних узорака млека или из производа од млека, али постоји мало података о патогености сојева Staphylococcus aureus изолованих из узорака млека узетих из појединих четврти вимена крава, као и о њиховој филогенетској сродности са изолатима пореклом од људи. Због тога, циљ истраживања у оквиру ове докторске дисертације, био је да се испита патогеност изолата Staphylococcus aureus пореклом из појединачних узорака млека и секрета вимена крава и изолата пореклом из брисева гуше људи, као и да се испита филогенетска сродност ових изолата.<br />На 46 газдинстава у централној Србији, Калифорнија маститис тестом идентификоване су краве са поремећеном секрецијом. Са две велике фарме у Војводини узети су узорци секрета из четврти вимена крава са клиничким маститисом. На Институту за јавно здравље Војводине у Новом Саду, узети су и брисеви гуше људи. Из наведених узорака коришћењем стандардних микробиолошких метода за изолацију и идентификацију, као и API Staph теста и доказивањем присуства nuc гена методом ланчане реакције полимеразе (PCR) 86 изолата потврђено је као Staphylococcus aureus. Из четврти вимена крава са субклиничким маститисом изоловано је 62 изолата, из четврти вимена крава са клиничким маститисом изоловано је 13 изолата, а из брисева гуше људи 11 изолата Staphylococcus aureus. За одређивање способности синтезе стафилококних ентеротоксина (SE) коришћен је VIDAS&reg; SET2 тест на принципу ELFA методе. Присуство гена за синтезу појединих SE, присуство гена за синтезу Пантон Валентин леукоцидина (PVL) и гена за резистенцију на метицилин доказано је PCR методом. Диск дифузионом методом по Кирби-Бауеру одређена је осетљивост изолата на антимикробне лекове и то на амоксицилин, амоксицилин/клавуланску киселину, ампицилин, бацитрацин, неомицин, новобиоцин, пеницилин, тетрациклин, триметоприм и триметоприм/сулфаметоксазол. Анализом нуклеотидних секвенци гена за синтезу стафилококног протеина А утврђена је филогенетска сродност изолата Staphylococcus aureus пореклом из млека крава оболелих од субклиничког и клиничког маститиса, као и изолата пореклом из брисева гуше људи.<br />Из 111 узорака млека узетих из четврти са позитивним CMT тестом Staphylococcus aureus изолован је из 62 узорка млека, што износи 55,86%. Од укупно 62 изолата Staphylococcus aureus пореклом из четврти вимена крава са поремећеном секрецијом, 5 (8,06%) синтетише стафилококне ентеротоксине и то само SECs, док 6 (54,54%) од 11 изолата Staphylococcus aureus пореклом од људи, синтетише стафилококне ентеротоксине и то и SECs и SEB. Присуство гена за синтезу Пантон-Валентин леукоцидина утврђено је код 5 (8,06%) од 62 изолата Staphylococcus aureus пореклом из четврти вимена крава са поремећеном секрецијом, као и код 7 (63,64%) од 11 изолата Staphylococcus aureus пореклом од људи. Изолати Staphylococcus aureus пореклом из вимена крава резистентни су на мањи број антимикробних лекова од изолата Staphylococcus aureus пореклом од људи на основу испитивања осетљивости на 10 антимикробних лекова. Свих 86 изолата Staphylococcus aureus су сензитивни на новобиоцин и триметоприм-сулфаметоксазол, док је 77 изолата (89,54%) резистентно<br />на бацитрацин, 24 (27,91%) на пеницилин, а 14 (16,28%) на ампицилин. Присуство гена за метицилинску резистенцију утврђено је код 2 (18,18%) од 11 изолата Staphylococcus aureus пореклом од људи и код 1 (1,33%) од 75 изолата Staphylococcus aureus пореклом из вимена крава. На основу испитивања филогенетске сродности нуклеотидних секвенци гена за синтезу стафилококног протеина А код 75 изолата пореклом из вимена крава и 11 изолата пореклом од људи, 2 изолата Staphylococcus aureus пореклом од људи могу се сматрати прецима свих осталих изолата. Подаци о нуклеотидним секвенцама изолата Staphylococcus aureus пореклом од крава депоновани су у GenBank и додељени су им приступни бројеви од KJ023978 до KJ024046.<br />Резултати истраживања указују на различита патогена својства изолата Staphylococcus aureus пореклом од крава са поремећеном секрецијом, због чега би њихово што раније откривање могло да има значајну улогу у очувању здравља вимена и у добијању квалитетног и здравствено безбедног млека.<br />Неопходна су даља истраживања како би се у потпуности разјаснио утицај изолата Staphylococcus aureus из вимена крава на безбедност млека и производа од млека, као и на здравље људи.</p> / <p>Staphylococcus aureus je često prisutan u vimenu krava gde može da uzrokuje pojavu subkliničkih i kliničkih mastitisa. Zbog sposobnosti sinteze termostabilnih stafilokoknih enterotoksina predstavlja čest uzrok trovanja hranom kod ljudi. Mnogi autori bavili su se ispitivanjem patogenosti sojeva Staphylococcus aureus sa aspekta zdravlja vimena, kao i ispitivanjem patogenosti sojeva poreklom iz stadnih uzoraka mleka ili iz proizvoda od mleka, ali postoji malo podataka o patogenosti sojeva Staphylococcus aureus izolovanih iz uzoraka mleka uzetih iz pojedinih četvrti vimena krava, kao i o njihovoj filogenetskoj srodnosti sa izolatima poreklom od ljudi. Zbog toga, cilj istraživanja u okviru ove doktorske disertacije, bio je da se ispita patogenost izolata Staphylococcus aureus poreklom iz pojedinačnih uzoraka mleka i sekreta vimena krava i izolata poreklom iz briseva guše ljudi, kao i da se ispita filogenetska srodnost ovih izolata.<br />Na 46 gazdinstava u centralnoj Srbiji, Kalifornija mastitis testom identifikovane su krave sa poremećenom sekrecijom. Sa dve velike farme u Vojvodini uzeti su uzorci sekreta iz četvrti vimena krava sa kliničkim mastitisom. Na Institutu za javno zdravlje Vojvodine u Novom Sadu, uzeti su i brisevi guše ljudi. Iz navedenih uzoraka korišćenjem standardnih mikrobioloških metoda za izolaciju i identifikaciju, kao i API Staph testa i dokazivanjem prisustva nuc gena metodom lančane reakcije polimeraze (PCR) 86 izolata potvrđeno je kao Staphylococcus aureus. Iz četvrti vimena krava sa subkliničkim mastitisom izolovano je 62 izolata, iz četvrti vimena krava sa kliničkim mastitisom izolovano je 13 izolata, a iz briseva guše ljudi 11 izolata Staphylococcus aureus. Za određivanje sposobnosti sinteze stafilokoknih enterotoksina (SE) korišćen je VIDAS&reg; SET2 test na principu ELFA metode. Prisustvo gena za sintezu pojedinih SE, prisustvo gena za sintezu Panton Valentin leukocidina (PVL) i gena za rezistenciju na meticilin dokazano je PCR metodom. Disk difuzionom metodom po Kirbi-Baueru određena je osetljivost izolata na antimikrobne lekove i to na amoksicilin, amoksicilin/klavulansku kiselinu, ampicilin, bacitracin, neomicin, novobiocin, penicilin, tetraciklin, trimetoprim i trimetoprim/sulfametoksazol. Analizom nukleotidnih sekvenci gena za sintezu stafilokoknog proteina A utvrđena je filogenetska srodnost izolata Staphylococcus aureus poreklom iz mleka krava obolelih od subkliničkog i kliničkog mastitisa, kao i izolata poreklom iz briseva guše ljudi.<br />Iz 111 uzoraka mleka uzetih iz četvrti sa pozitivnim CMT testom Staphylococcus aureus izolovan je iz 62 uzorka mleka, što iznosi 55,86%. Od ukupno 62 izolata Staphylococcus aureus poreklom iz četvrti vimena krava sa poremećenom sekrecijom, 5 (8,06%) sintetiše stafilokokne enterotoksine i to samo SECs, dok 6 (54,54%) od 11 izolata Staphylococcus aureus poreklom od ljudi, sintetiše stafilokokne enterotoksine i to i SECs i SEB. Prisustvo gena za sintezu Panton-Valentin leukocidina utvrđeno je kod 5 (8,06%) od 62 izolata Staphylococcus aureus poreklom iz četvrti vimena krava sa poremećenom sekrecijom, kao i kod 7 (63,64%) od 11 izolata Staphylococcus aureus poreklom od ljudi. Izolati Staphylococcus aureus poreklom iz vimena krava rezistentni su na manji broj antimikrobnih lekova od izolata Staphylococcus aureus poreklom od ljudi na osnovu ispitivanja osetljivosti na 10 antimikrobnih lekova. Svih 86 izolata Staphylococcus aureus su senzitivni na novobiocin i trimetoprim-sulfametoksazol, dok je 77 izolata (89,54%) rezistentno<br />na bacitracin, 24 (27,91%) na penicilin, a 14 (16,28%) na ampicilin. Prisustvo gena za meticilinsku rezistenciju utvrđeno je kod 2 (18,18%) od 11 izolata Staphylococcus aureus poreklom od ljudi i kod 1 (1,33%) od 75 izolata Staphylococcus aureus poreklom iz vimena krava. Na osnovu ispitivanja filogenetske srodnosti nukleotidnih sekvenci gena za sintezu stafilokoknog proteina A kod 75 izolata poreklom iz vimena krava i 11 izolata poreklom od ljudi, 2 izolata Staphylococcus aureus poreklom od ljudi mogu se smatrati precima svih ostalih izolata. Podaci o nukleotidnim sekvencama izolata Staphylococcus aureus poreklom od krava deponovani su u GenBank i dodeljeni su im pristupni brojevi od KJ023978 do KJ024046.<br />Rezultati istraživanja ukazuju na različita patogena svojstva izolata Staphylococcus aureus poreklom od krava sa poremećenom sekrecijom, zbog čega bi njihovo što ranije otkrivanje moglo da ima značajnu ulogu u očuvanju zdravlja vimena i u dobijanju kvalitetnog i zdravstveno bezbednog mleka.<br />Neophodna su dalja istraživanja kako bi se u potpunosti razjasnio uticaj izolata Staphylococcus aureus iz vimena krava na bezbednost mleka i proizvoda od mleka, kao i na zdravlje ljudi.</p> / <p>Staphylococcus aureus is often present in cow&#39;s udder and may cause the occurrence of subclinical and clinical mastitis. Due to the ability to synthesize thermostable staphylococcal enterotoxins, it is a common cause of food poisoning in humans. Many authors have dealt with the examination of the pathogenicity of strains of Staphylococcus aureus in terms of udder health, as well as examining the pathogenicity of strains originating from bulk tank milk samples or dairy products, but there is a scarce amount of data on the pathogenicity of strains of Staphylococcus aureus originating from individual samples from udder quarters, as well as on their phylogenetic relatedness with isolates from humans. Therefore, the goal of the research within this dissertation was to investigate the pathogenicity of Staphylococcus aureus originating from individual samples of milk and udder secretions, as well as isolates from throat swabs of people and to examine the phylogenetic relatedness of these isolates.<br />On 46 dairy farms in central Serbia, cows with abnormal secretion were identified using California mastitis test. From two large dairy farms in Vojvodina samples were taken from udder quarters with clinical mastitis. Human throat swabs were collected at the Institute of Public Health of Vojvodina in Novi Sad. From these samples a total of 86 strains of Staphylococcus aureus were isolated and confirmed by standard microbiological methods for isolation and identification, as well as API Staph test and by detection of nuc gene using the Polymerase Chain Reaction (PCR). 62 isolates of Staphylococcus aureus were isolated from udder quarters suffering subclinical mastitis, 13 isolates were isolated from udder quarters suffering clinical mastitis, and 11 isolates of Staphylococcus aureus were isolated from human throat swabs. VIDAS &reg; SET2 was used for determining the ability of the synthesis of staphylococcal enterotoxins (SE) by the ELFA method and PCR method for the presence of respective SE genes. PCR method was used for determining the presence of gene for the synthesis of the Panton Valentine leukocidin (PVL), and the gene responsible for methicillin resistance in strains of Staphylococcus aureus. Susceptibility to antimicrobial drugs was determined by disk diffusion method by Kirby - Bauer to amoxicillin, amoxicillin/ clavulanic acid, ampicillin, bacitracin, neomycin, novobiocin, penicillin, tetracycline, trimethoprim and trimethoprim/sulfamethoxazole. Phylogenetic relatedness was determined by analyzing the nucleotide sequences of the genes for the synthesis of staphylococcal protein A between isolates of Staphylococcus aureus originating from cow&#39;s udder quarters suffering subclinical and clinical mastitis, as well as isolates of Staphylococcus aureus originating from human throat swabs.<br />Out of 111 milk samples from CMT positive udder quarters, Staphylococcus aureus was isolated from 62 samples, which amounts to 55.86%. Out of 62 isolates of Staphylococcus aureus originating from udder quarters with abnormal secretion, 5 (8.06%) synthesized by staphylococcal enterotoxin and only it was SECs, while 6 (54.54%) out of 11 isolates of Staphylococcus aureus originating from humans, synthesize staphylococcal enterotoxin and they were SECs and SEB. The presence of a gene for the synthesis of the Panton - Valentine leukocidin was determined in 5 (8.06%) out of 62 Staphylococcus aureus strains originating from the udder quarters with abnormal secretion, and in 7 (63.64%) out of 11 strains of Staphylococcus aureus origin of humans. Isolates of Staphylococcus aureus originating from cow&#39;s udder were<br />resistant to fewer antimicrobials than isolates of Staphylococcus aureus originating from humans on the basis of susceptibility to 10 antimicrobials. All 86 strains of Staphylococcus aureus were sensitive to novobiocin and trimethoprim/ sulfamethoxazole, 77 strains (89.54%) were resistant to bacitracin, 24 (27.91%) to penicillin, and 14 (16.28%) to ampicillin. The presence of the gene for methicillin resistance was found in 2 (18.18%) out of 11 isolates of Staphylococcus aureus originating from humans and in 1 (1.33%) out of 75 isolates of Staphylococcus aureus originating from the cow&rsquo;s udder. Analyzing the phylogenetic relatedness based on nucleotide sequences of the genes for the synthesis of staphylococcal protein A from 75 isolates from cow&#39;s udder, and 11 isolates from humans, 2 isolates of Staphylococcus aureus originating from humans can be considered to be the ancestors of all the other isolates in terms of gene mutation ratio give at respective period. Data on the nucleotide sequences of isolates of Staphylococcus aureus originating from cows were deposited in GenBank and assigned the accession numbers of KJ023978 to KJ024046.<br />Results of study on diverse pathogenic properties of Staphylococcus aureus originating from cows with abnormal secretion, indicate the importance of their early detection that could have a significant role in maintaining the cow&rsquo;s udder health and in obtaining quality and safe milk.<br />Further research is necessary in order to fully clarify the impact of Staphylococcus aureus from the cow&#39;s udder to the safety of milk and dairy products, as well as human health.</p>