Jena, Universiẗat, Diss., 2004.

Universiẗat, Diss., 2004--Jena.

<p>Bud formation by Saccharomyces cerevisiae is a fundamental process for yeast proliferation. Bud emergence is initiated by the polarization of the cytoskeleton, leading to local secretory vesicle delivery and gulcan synthase activity. The master regulator of polarity establishment is a small Rho-family GTPase – Cdc42. Cdc42 forms a clustered patch at the incipient budding site in late G1 and mediates downstream events which lead to bud emergence. Cdc42 promotes morphogenesis via its various effectors. PAKs (p21-activated kinases) are important Cdc42 effectors which mediate actin cytoskeleton polarization and septin filament assembly. The PAKs Cla4 and Ste20 share common binding domains for GTP-Cdc42 and they are partially redundant in function. However, we found that Cla4 and Ste20 behaved differently during the polarization and this depended on their different membrane interaction domains. Also, Cla4 and Ste20 compete for a limited number of binding sites at the polarity patch during bud emergence. These results suggest that PAKs may be differentially regulated during polarity establishment.</p><p>Morphogenesis of yeast must be coordinated with the nuclear cycle to enable successful proliferation. Many environmental stresses temporarily disrupt bud formation, and in such circumstances, the morphogenesis checkpoint halts nuclear division until bud formation can resume. Bud emergence is essential for degradation of the mitotic inhibitor, Swe1. Swe1 is localized to the septin cytoskeleton at the bud neck by the Swe1-binding protein Hsl7. Neck localization of Swe1 is required for Swe1 degradation. Although septins form a ring at the presumptive bud site prior to bud emergence, Hsl7 is not recruited to the septins until after bud emergence, suggesting that septins and/or Hsl7 respond to a “bud sensor”. Here we show that recruitment of Hsl7 to the septin ring depends on a combination of two septin-binding kinases: Hsl1 and Elm1. We elucidate which domains of these kinases are needed, and show that artificial targeting of those domains suffices to recruit Hsl7 to septin rings even in unbudded cells. Moreover, recruitment of Elm1 is responsive to bud emergence. Our findings suggest that Elm1 plays a key role in sensing bud emergence.</p> / Dissertation

In the late stages of cancer, tumors acquire the ability to spread throughout the body and invade distant tissues in a process called metastasis. Studies have shown that metastasis is responsible for 90% of all cancer-related deaths, making this an important field of study. In breast cancers, 30% of patients overexpress the HER2 oncoprotein, causing a more invasive and metastatic disease. Invasion can be stimulated in vitro using the soluble ligand transforming growth factor-β (TGFβ) to induce a process called EMT (epithelial-to-mesenchymal transition), where epithelial cells transition into a migratory phenotype through cell-cell junction breakdown. SLK is a Ste20-like kinase that has been linked to many processes, including cell migration and signaling downstream of the HER2 receptor complex. Here we show that the cellular migration and invasion of TGFβ-treated normal mammary epithelial cells is significantly impaired in the absence of SLK. Additionally, immunofluorescence analyses demonstrate that SLK knockdown conditions decrease a cell’s ability to progress through EMT due to the visible staining of epithelial markers. We find that SLK-depleted cultures express significantly lower levels of Snail1,and fibronectin mRNA levels following TGF-β treatment. Surprisingly, our data demonstrates that SLK kinase activity is not activated downstream of TGF-β stimulation, and that a kinase-dead SLK rescues Snail1 mRNA expression levels. Together these data suggest that SLK plays a novel role in TGFβ-induced epithelial-to-mesenchymal transition in a kinase activity-independent manner.

Die Zellteilung/Zytokinese ist ein grundlegender zellulärer Prozess und essentiell für das Wachstum von einzelligen und mehrzelligen Organismen. Reguliert wird dieser Prozess durch komplexe molekulare Mechanismen sowie einer Vielzahl von interaktiven Netzwerken. In Pilzen koordiniert eine Kinase-Kaskade, das Septierungs-Initiierungs Netzwerk (SIN) das Fortschreiten des Zellzyklus mit dem Beginn der Zellteilung und kontrolliert die Septenbildung. Fehlregulation des homologen Hippo Netzwerks in Tieren führt zu Gewebewucherungen und Tumorbildung, was die konservierte Bedeutung dieser Regulationsnetzwerke in verschiedenen Organismen unterstreicht. Obwohl die Septenbildung essentiell für das Wachstum und die Differenzierung von Schimmelpilzen ist, bleibt die Frage wie die Septierung reguliert wird und aus welchen Komponenten sich das SIN Netzwerk in filamentösen Pilzen zusammensetzt bisher noch unbeantwortet. Mit Hilfe von in silico Analysen konnten homologe Proteine für fast alle SIN Netzwerk Komponenten im Modellorganismus Neurospora crassa identifiziert werden. Die Analyse dieser vorhergesagten SIN Komponenten ermöglichte die Charakterisierung der SIN-Kinase-Kaskade, bestehend aus CDC-7, SID-1 und DBF-2 sowie den entsprechenden, regulatorischen Untereinheiten CDC-14 und MOB-1. Es konnte gezeigt werden, dass DBF-2 durch SID-1 am hydrophoben Motiv phosphoryliert und aktiviert wird und dass eine SID-1 abhängige Stimulation von DBF-2 durch Zugabe von CDC-7 weiter gesteigert wird. Diese Daten liefern den ersten biochemischen Nachweis für die schrittweise Aktivierung einer dreistufigen SIN-Kinase-Kaskade in Pilzen. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die gesamte SIN Kaskade konstitutiv und Zellzyklus unabhängig an den Spindelpolkörpern akkumuliert und dass alle SIN Proteine an kontrahierenden Septen lokalisieren. Demzufolge ist im Gegensatz zu den einzelligen Pilzen die Lokalisation und Aktivität der SIN Komponenten in Synzytium-bildenden Ascomyzeten Zellzyklus unabhängig. Darüber hinaus deutet die Charakterisierung von DBF-2 Mutanten, in denen die beiden regulatorischen Aminosäuren (Ser499 and Thr671) mutiert sind, darauf hin, dass ein dynamischer Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungszyklus des Ser499 entscheidend für die Aktivität und Funktion von DBF-2 in N. crassa ist. Diese Daten haben Einfluss auf das allgemeine Verständnis der Aktivierung von NDR Kinasen, denn bisher wurde für NDR Kinasen höherer Eukaryonten eine folgegebundene Phosphorylierung beider regulatorischer Reste angenommen. Der Ste20-verwandten Kinase MST-1 konnte eine Funktion als SIN-assoziierte Kinase, die parallel zu SID-1 agiert, zugeordnet werden. SID-1 und MST-1 werden auf entgegengesetzte Weise von der oberhalb agierenden SIN Kinase CDC-7 reguliert, was nahelegt, dass MST-1 für die Feinabstimmung des SIN erforderlich ist. Lifeact- und Formin-GFP Reporter Konstrukte zeigten, dass in der Δmst-1 Mutante abnormale, kortikale Actomyosin-Ringe gebildet werden, was eine Fehlpositionierung der Septen und die Bildung von unregelmäßigen Spiralen zur Folge hat. Diese Defekte entsprechen partiell jenen der MOR Mutanten. Diese Mutanten weisen ein defektes NDR Kinase Netzwerk auf, welches für das polare Wachstum verantwortlich ist (MOR). Es stellte sich heraus, dass MST-1 mit den zentralen MOR Kinasen POD-6 und COT-1 interagiert und sowohl die SIN Effektor Kinase DBF-2 als auch die MOR Effektor Kinase COT-1 aktiviert. Somit fungiert MST-1 als dual-spezifisches Enzym. Eine weitere Vernetzung beider Signalwege ist durch die Bildung von Heterodimeren gegeben. Die in dieser Studie identifizierten verschiedenen Ebenen der Vernetzung des SIN und MOR, sowie entsprechende Daten aus anderen Modellorganismen wie S. pombe und D. melanogaster, lassen vermuten, dass antagonistische Interaktionen zwischen homologen NDR Kinase Netzwerken ein genereller Mechanismus zur Koordination beider Signalwege darstellt und auch in höheren Organismen konserviert ist. Durch die Annotierung mehrerer Pilzgenome wurden zahlreiche Gene mit einer Homologie zu den S. cerevisiae BUD Genen auch in filamentösen Pilzen identifiziert. Epistatische und biochemische Analysen ergaben, dass das MOR Netzwerk als negativer Regulator der Septenbildung oberhalb des BUD komplex fungiert und dass COT-1 im Gegensatz zu DBF-2, die beiden Septierungsmarkerproteine BUD-3/BUD-4 phosphoryliert. Folglich könnte die Regulation von BUD-3 (und eventuell auch BUD-4) durch COT-1 ein Mechanismus des MOR Netzwerks sein, um die Septenbildung in N. crassa zu inhibieren.

The Ste20-like kinase SLK plays a pivotal role in cell migration and focal adhesion turnover. SLK activity is regulated by the LIM domain-binding proteins Ldb1/2. In addition to playing role in tumor initiation and progression, these proteins have been demonstrated to interact with LMO4. Therefore, this project assessed the ability of LMO4 to interact and regulate SLK activity. Results show that LMO4 can directly bind to SLK and activate its kinase activity. LMO4 can be co-precipitated with SLK following the induction of cell migration by scratch wounding. Cre deletion of LMO4 inhibits cell migration and SLK activation, and impairs Ldb1 and SLK recruitment to the leading edge of migrating cells. Src/Yes/Fyn-deficient cells (SYF) express very low levels of LMO4 and do not recruit SLK to the leading edge. Src-family kinase inhibition impairs SLK recruitment to the leading edge, suggesting that both expression of LMO4 and the recruitment of SLK to the leading edge require c-Src activity. In conclusion, cell migration and activation of SLK requires its recruitment to the leading edge by LMO4 in a Src-dependent manner. This study also investigated whether LMO4 deletion through MMTV-Cre-driven excision would impair mammary tumorigenesis in a PyMT mouse model of breast cancer. No difference in Overall Survival was observed between animals with and without LMO4 expression. Western blot analysis and IHC showed that tumors expressed LMO4 protein in animals genotyped as Cre-positive. This result suggests that expression of LMO4 is required for tumor initiation in the PyMT model of murine mammary carcinoma. This project has established a novel cytosolic role for the transcriptional co-activator LMO4 and validated it’s involvement in the regulation of SLK and cell migration. This pathway may provide a novel therapeutic strategy as LMO4 appears to be critical to the initiation and progression of breast cancer.