Abstract Intrauterine infections apparently cause about 85% of preterm deliveries at less than 28 weeks of gestation. Infection and inflammation play an important role in morbidity and mortality during perinatal period. The inflammatory mechanisms and pathophysiological consequences of intrauterine infection are poorly understood. According to current evidence from animal studies, the phenotypes of fetal inflammatory response are variable, ranging from spontaneous preterm birth to fetal death. The fetus is rather well protected against infectious agents by both structural and functional barriers. Toll-like receptors (TLR) are a part of innate immune system. Binding of bacterial or viral component to TLR induces inflammatory response in the host. The present study addressed the hypothesis that the effects of bacterial lipopolysaccharide (LPS) on the fetus, depends on the route by which it reaches the fetus. In this experimental study we hypothesized that an acute inflammation within the amniotic cavity may cause an innate immune response in the fetus consequently leading to cardiovascular distress. Secondly the role of the placenta in protecting the fetus from acute infectious challenges was evaluated. Additionally, the role of gestational age in the fetal immune response was studied. In the present study, LPS from Gram-negative bacteria caused an acute intrauterine inflammation in mice as indicated by the elevated levels of inflammatory mediators (e.g. cytokines) in amniotic fluid. The fetal heart revealed mRNA and protein expression of TLR4, which recognizes LPS. Moreover, the data showed a cytokine response in the fetal heart and severe cardiac dysfunction. In contrast, intraperitoneal LPS administered to the mother did not cause an acute cytokine response in the fetus. After intraperitoneal LPS the placenta showed severe blood congestion and a cytokine response. The data suggest that TLRs play roles in regulating the acute inflammatory responses in the placenta. Despite the absence of a fetal immune response, the placental lesions caused a fetal cardiovascular compromise. In addition, the present data indicate that the fetal expression of TLR4 is tissue specific and developmentally regulated. Present study provides new insights into the acute inflammatory mechanisms in maternal and fetal compartments and the pathophysiological changes in fetal cardiovascular hemodynamics. / Tiivistelmä Hyvin ennenaikaisen, alle 28. raskausviikolla tapahtuneen synnytyksen taustalta löytyy usein kohdunsisäinen infektio (IUI). Kohdunsisäisen infektion aiheuttama synnytys on suurimpia sikiön vammautumiseen tai kuolemaan johtavia syitä. Tulehdukselliset mekanismit, jotka johtavat synnytykseen tai sikiön vammautumiseen ovat huonosti tunnettuja. Tollin kaltaiset reseptorit (TLR) ovat osa synnynnäisen immuniteetin puolustusjärjestelmää. Niiden tarkoitus on tunnistaa nopeasti elimistölle vieraat, usein bakteeri- tai virusperäiset rakenteet ja käynnistää tulehdusvaste tuottamalla tulehdusvälittäjäaineita. Nämä välittäjäaineet säätelevät tulehdusprosessia, toisaalta niiden liiallinen tuotto voi aikuisilla johtaa elinvaurioihin kuten sydämen toimintahäiriöön. On esitetty että tulehdusvälittäjäaineet käynnistäisivät myös ennenaikaisen synnytyksen IUI:ssa. TLR-reseptorien merkityksestä sikiön tulehdusvasteessa tai synnytyksen käynnistymisessä on vain vähän tietoa. Väitöskirjatyössä tutkittiin kokeellisen hiirimallin avulla bakteeriperäisen lipopolysakkaridin (LPS) kykyä aiheuttaa sikiön tulehdusvaste, sekä muutoksia sikiön sydämen ja verenkierron toiminnassa, riippuen LPS:n reitistä sikiöön. Toisaalta kokeellisella mallilla tutkittiin istukan kykyä suojata sikiötä voimakkaalta tulehdusreaktiolta. Tarkoituksena oli tutkia myös sikiön kehitysasteen vaikutusta LPS:n aiheuttamaan tulehdusvasteeseen. Tutkimuksessa havaittiin LPS:n aiheuttavan kohdunsisäisen tulehduksen kun sitä annettiin suoraan lapsiveteen. Sikiön sydämessä todettiin TLR4 lähetti-RNA:n ja proteiinin ilmentyminen sekä nopea sytokiinien tuotannon lisääntyminen kuvastaen äkillistä tulehdusprosessia. Samanaikaisesti ultraäänitutkimuksessa todettiin sikiön sydämen vaikea toimintahäiriö. Toisaalta, jos LPS annettiin kantavalle emolle vatsaonteloon, tulehdusvälittäjäaineiden tuotannon lisääntymistä sikiössä ei havaittu. Sen sijaan istukassa todettiin akuutti verentungos ja tulehdusvaste. Edellä kuvattu istukan toimintahäiriö johti myös sikiön sydämen ja verenkierron toiminnan vaikeutumiseen huolimatta siitä, ettei sikiön sydämessä havaittu tulehduksellista vastetta. Lisäksi sikiöstä ja istukasta saadut tulokset viittaavat siihen, että TLR-reseptorit ovat mukana LPS:n tunnistamisessa ja äkillisen tulehdusvasteen käynnistymisessä. Tutkimus antaa uutta tietoa raskauden aikaisista tulehduksellisista mekanismeista sekä sikiön sydämen toiminnan äkillisistä muutoksista voimakkaan tulehduksen aikana.

Abstract Heart failure (HF) is a complex pathological state, involving simultaneous alterations in several signalling pathways and changes in gene programming. In HF, activation of the neurohumoral factors and renin-angiotensin-aldosterone (RAA) system occurs as a compensatory mechanism to combat the abnormal ventricular function. Developments in cardiac gene delivery methods have exerted a significant impact to treat HF and to discover the novel molecular mechanisms associated with HF and other cardiac diseases. This study demonstrated that adenovirus–mediated gene delivery of B-type natriuretic peptide (BNP) into the anterior wall of the left ventricle decreased myocardial fibrosis and increased capillary density. Post-infarction BNP improved systolic function associated with normalization of cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) 2 expression and phospholamban phosphorylation at Thr17. On the other hand, (Pro)renin receptor ([P]RR) gene delivery resulted deleterious effects on cardiac function and (P)RR activation induced distinct angiotensin II (Ang II)-independent extracellular matrix remodelling and worsening of cardiac function. (P)RR gene delivery resulted in Ang II-independent activation of extracellular-signal regulated (ERK1/2) phosphorylation and increased myocardial fibrosis. In conclusion, the present study indicates that myocardial BNP gene delivery can achieve pleiotropic, context-dependent, favourable effects on cardiac function and that BNP can act locally as a mechanical load–activated regulator of angiogenesis and fibrosis. These results also implicate that (P)RR blockers may display additional cardiac effects in addition to its ability to evoke effective RAA system blockade. Overall, the findings of this study provide a better understanding of the molecular mechanisms involved in the biological actions of BNP and (P)RR, and identify BNP and (P)RR as potential novel drug targets for the treatment of HF. / Tiivistelmä Neuroendokriinisellä aktivaatiolla, jonka seurauksena aiheutuu muun muassa verisuonten supistumista ja laajenemista sekä nesteen kertymistä elimistöön, on tärkeä merkitys sydämen vajaatoiminnan kehittymisessä. Neuroendokriininen aktivaatio kompensoi sydämen vajaatoiminnan seurauksena tapahtuvaa kammioiden poikkeavaa toimintaa. Yksi keskeisimmistä verisuonia supistavista tekijöistä on reniini-angiotensiini-aldosteroni (RAA) -järjestelmä, ja verisuonia laajentaviin tekijöihin kuuluvat muun muassa natriureettiset peptidit, kuten B-tyypin natriureettinen peptidi (BNP) ja A-tyypin natriureettinen peptidi. Geeninsiirtomenetelmillä on ollut merkittäviä vaikutuksia uusien hoitomenetelmien kehittämisessä, sydämen vajaatoiminnan syiden selvittämisessä ja uusien kohdegeenien tunnistamisessa sydämen vajaatoiminnan hoitoon. Väitöskirjan tutkimustulokset osoittivat, että suora adenovirusvälitteinen geeninsiirto rotan sydämen vasemman kammion etuseinään on toimiva menetelmä uusien kohdegeenien löytämiseksi sydämen vajaatoiminnan hoitoon. BNP:n geeninsiirto vähensi merkitsevästi fibroosin muodostumista ja lisäsi verisuonten uudismuodostumista sydämessä. Sydäninfarktin jälkeen BNP paransi sydämen systolista toimintaa, johon liittyi aktiivisen kalsiumpumpun, SERCA2:n ja fosfolambaani-proteiinin fosforylaation normalisoituminen. (Pro)reniini reseptorin ([P]RR) geeninsiirto aiheutti angiotensiini II:sta riippumatonta solunulkoisen matriksin uudelleenmuotoutumista ja sydämen toiminnan huonontumista sekä lisääntynyttä sydämen fibroosia. Väitöskirjatutkimus antaa uutta tietoa solunsisäisistä molekulaarisista mekanismeista sydänsoluissa. BNP geeninsiirto aiheutti sydämen tautitilasta riippuvia suotuisia tapahtumia, ja se toimi paikallisesti muun muassa fibroosia ehkäisevänä tekijänä. (P)RR geeninsiirtotulosten perusteella voidaan olettaa, että (P)RR:n salpaus saattaa olla uusi tehokas hoitokeino sydämen vajaatoiminnan hoitoon.

Abstract Heart failure (HF) and aortic valve stenosis (AS) are complex disorders affected by functional alterations and actively regulated remodelling of the heart and the aortic valve, respectively. In addition to structural proteins, such as collagens and elastin, the extracellular matrix (ECM) in the heart and the aortic valve comprises non-collagenous factors that are not strictly involved in the architecture but may modulate cardiac and valvular remodelling. In the present study the expression of non-collagenous fibrosis- and calcification-related ECM proteins was investigated in HF-associated cardiac remodelling from different origins as well as in fibrocalcific aortic valve disease leading to AS. The experimental models of pressure overload, myocardial infarction (MI) and chronic renal failure were used to study the cardiac expression of bone morphogenetic protein (BMP)-2, BMP-4, bone sialoprotein, matrix Gla protein (MGP), osteoactivin, osteopontin, periostin and/or pleiotrophin in vivo in cardiac remodelling. Human aortic valves, obtained from patients undergoing valve replacement, were studied to characterize the valvular expression of BMP-2, BMP-4, bone sialoprotein, MGP, osteoactivin, osteopontin, osteoprotegerin, periostin, pleiotrophin, and thrombospondins (TSPs) 1-4 in the different stages of fibrocalcific aortic valve disease. Left ventricular (LV) MGP expression was upregulated in vivo in non-uremic cardiac remodelling. In vitro results indicate that angiotensin II elevates MGP expression in cardiomyocytes and fibroblasts. Periostin gene expression was induced in cardiac but not in aortic valve remodelling and the cardiac induction in chronic renal insufficiency was associated with LV hypertrophy and blood pressure as well as the cardiac gene expression of other fibrosis-related genes. Bone sialoprotein and osteopontin were expressed in the aortic valves in parallel with calcification, and also in distinct models of cardiac remodelling. Osteoprotegerin protein expression in stenotic valves was weak regardless of a simultaneous increase in gene expression. BMPs were downregulated in AS and no change in LV gene expression was detected in uremic cardiac remodelling. All the studied TSPs were expressed in human aortic valves, and especially the expression of TSP-2 was shown to increase in fibrocalcific aortic valves simultaneously with decreased activation of the Akt/nuclear factor (NF)-κB-pathway. This study delineates distinct expression patterns of non-collagenous ECM proteins in pathological tissue remodelling in the heart and in the aortic valve, and thus emphasizes the role of ECM proteins as an important modulator of cardiac and aortic valve remodelling. / Tiivistelmä Sydämen vajaatoiminnan ja aorttastenoosin taudinkuvaan kuuluvat toiminnallisten muutosten ohella aktiivisesti säädellyt soluväliaineen muutokset sydämen ja aorttaläpän rakenteessa. Soluväliaineen rakenteen muodostavien kollageenien ja elastiinin lisäksi soluväliaineessa on rakenteeseen kuulumattomia proteiineja. Tässä väitöskirjassa tutkittiin sidekudoksen kertymiseen ja kudosten kalkkiutumiseen osallistuvia soluväliaineen proteiineja sydämen vajaatoiminnassa sekä aorttastenoosiin johtavassa kalkkiuttavassa aorttaläppäviassa. Tutkimuksessa selvitettiin sydämen soluväliaineen proteiinien ilmentymistä painekuormituksen, sydäninfarktin ja pitkäaikaisen munuaisten vajaatoiminnan koemalleissa rotalla. Tutkittavia proteiineja olivat luun morfogeneettiset proteiinit 2 ja 4, luun sialoproteiini, matriksin Gla proteiini (MGP), osteoaktiviini, osteopontiini, periostiini ja pleiotropiini. Edellä mainittujen proteiinien lisäksi osteoprotegeriinin ja trombospondiinien 1-4 ilmentymistä tutkittiin kalkkiuttavan aorttaläppävian eri kehitysvaiheissa. Aorttaläpät oli kerätty tekoläppäleikkauspotilailta. Sydämessä MGP:n ilmentyminen lisääntyi kaikissa muissa paitsi munuaisten vajaatoiminnan koemallissa. Angiotensiini II nosti MGP:n ilmentymistä sydänlihassoluissa ja sidekudossoluissa. Periostiinin ilmentyminen lisääntyi sydämen uudelleenmuovautumisessa, muttei aorttaläppäviassa. Lisäksi munuaisten vajaatoiminnan aiheuttama periostiinin ilmentymisen muutos sydämessä liittyi sekä sydämen kasvuun, verenpaineen nousuun että muiden sidekudosta muokkaavien proteiinien ilmentymiseen. Luun sialoproteiinin ja osteopontiinin ilmentymiset erosivat toisistaan erilaisissa sydämen vajaatoiminnan malleissa, mutta aorttaläpissä niiden molempien ilmentyminen oli suhteessa läpän kalkkiutumiseen. Osteoprotegeriinin geenin ilmentyminen lisääntyi kalkkiutuneissa aorttaläpissä vaikkakin proteiinin määrä pysyi vähäisenä. Luun morfogeneettisten proteiinien ilmentyminen oli alentunut sairaissa läpissä, muttei sydämessä munuaisten vajaatoiminnan aikana. Aorttaläpissä ilmennettiin kaikkia trombospondiineita, joista trombospondiini-2:n ilmentyminen kasvoi sairaissa aorttaläpissä. Kalkkiutuneissa läpissä solunsisäinen Akt/NF-κB–signaalinvälitysjärjestelmä oli vaimentunut. Tutkimus osoittaa, että soluväliaineen proteiinien ilmentymistä säädellään eri tavoin sydämen vajaatoiminnassa ja aorttastenoosissa kudoksen uudelleenmuovautumisprosessin aikana.

Abstract Cardiovascular diseases are the leading causes of death in the developed countries and their incidence is not expected to decrease in the future. There is a lifetime risk of one in five of developing heart failure, which still has poor prognosis and current treatments only cover part of the pathophysiology behind this syndrome. Pathological processes contributing to heart failure include cardiac hypertrophy and remodeling, which involves neurohumoral activation, reactivation of fetal genes, impaired Ca2+ cycling, increased apoptosis, and increased fibrosis. Intracellular signalling pathways and transcription factors mediating the response to various extracellular stresses have a key role in the regulation of myocardial remodeling and they are investigated in order to develop new approaches for the treatment of heart failure. The aim of this thesis was to elucidate roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and transcription factor GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function in cell cultures, and in hearts ex vivo and in vivo. The main findings were that (i) Inhibition of p38α MAPK enhanced function of sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase and thus cardiac contractility by increasing phosphorylation of protein phosphatase inhibitor-1 and phospholamban, (ii) p38 MAPK isoforms p38α and p38β regulated promoter activity of B-type natriuretic peptide via distinct pathways, (iii) p38α and p38β MAPKs also had different effects on gene expressions related to fibrosis and hypertrophy, and (iv) p38 and ERK1/2 MAPKs mediated stretch-induced activation of GATA-4 by phosphorylation at Ser 105. GATA-4 also seems to be regulated by ubiquitination. This study provides novel data of p38 MAPK and GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function. Inhibition of p38α MAPK could be beneficial in the treatment of heart failure. Also GATA-4 is a potential target for treatment of cardiovascular diseases. / Tiivistelmä Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa, eikä niiden ilmaantuvuus tule vähenemään lähitulevaisuudessa. Elinikäinen riski sairastua sydämen vajaatoimintaan on 20 %, ja sydämen vajaatoiminnan ennuste on edelleen huono. Nykyisillä hoitomuodoilla voidaan puuttua vain osittain sydämen vajaatoiminnan patofysiologisiin mekanismeihin. Sydämen vajaatoiminnan kehittymiseen liittyvät sydänlihaksen liikakasvu ja uudelleenmuovautumisprosessi, johon liittyy neurohumoraalinen aktivaatio, sikiöaikaisten geenien uudelleenilmentyminen, häiriöt solunsisäisessä Ca2+-viestinnässä sekä lisääntynyt ohjelmoitu solukuolema ja sidekudoksen muodostuminen sydämeen. Solunsisäisillä viestinvälitysketjuilla sekä transkriptiotekijöillä, jotka vastaavat solunulkoisten ärsykkeiden välittämisestä solun sisällä, on keskeinen rooli edellämainittujen prosessien säätelyssä. Uusien lähestymistapojen kehittäminen sydämen vajaatoiminnan hoitoon edellyttää myös solunsisäisen viestinvälityksen ja geenien säätelyn mekanismien selvittämistä. Tämän väitöstyön tavoite oli selvittää p38 mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja transkriptiotekijä GATA-4:n merkitystä sydämen vajaatoiminnan patogeneesissä soluviljelymalleissa. Päälöydöksiä olivat: (i) p38α MAPK -isoformin estäminen paransi kalsiumia solulimakalvostoon pumppaavan SERCA2a:n toimintaa ja sydänlihassolun supistumiskykyä lisäämällä fosfolambaanin ja proteiinifosfataasi-inhibiittori-1:n fosforylaatiota. (ii) p38 MAPK isoformit p38α ja p38β säätelivät B-tyypin natriureettisen peptidin geenin promoottorialuetta erillisten reittien kautta. (iii) p38α ja p38β isoformit vaikuttivat myös eri tavoin sydämen sidekudoksen muodostumiseen ja hypertrofiaan liittyvien geenien ilmentymiseen. (iv) p38 ja ERK1/2 välittävät venytyksen aiheuttaman GATA-4:n aktivaation fosforyloimalla seriini-105 fosforylaatiopaikan. Lisäksi GATA-4:n toimintaa säädellään ubiquitinaation avulla. Tämä tutkimus tuo uutta tietoa p38 MAPK:n ja GATA-4:n rooleista sydämen vajaatoiminnan kehittymisessä. p38α-isoformin toiminnan estäminen voisi olla hyödyllinen hoitomuoto sydämen vajaatoiminnassa. Myös GATA-4 on potentiaalinen lääkehoidon kohde sydänsairauksien hoidossa.