Techn. Universiẗat, Diss., 2006--München.

Mainz, Univ., Diss., 2001.

Universiẗat, Diss., 2005--Jena.

Universiẗat, Diss., 2004--Jena.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

Freie Universiẗat, Diss., 2001--Berlin.

Jena, Univ., Diss., 2004

Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundärmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachsbestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung: Der Glossy-Phänotyp ist frei von epikutikulären Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von fadenförmigen epikutikulären Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikulärem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgeführt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer täglichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikulären Triterpenen über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans für die katalytische Funktionalität dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden. / Triterpenoids are a large group of secondary metabolites found in different plant species, either as glycoside conjugates or as aglycones. The latter in many cases accumulate to high amounts in the cuticular wax and hence the primary surface of above-ground plant organs, influencing their surface properties. In the present work, the cuticle-specific formation of triterpenoids was investigated in Ricinus communis stems, combining analytical and molecular genetic methods. Two phenotypes of castor bean could be distinguished based on the appearance of the surface of all stem portions including the hypocotyls: The stems of the glossy phenotype are devoid of wax crystals. In contrast, the stems of the glaucous phenotype are covered by a layer of thread-like epicuticular wax crystals. Comparative studies by GC-FID analysis revealed that the cuticles of 67-day old hypocotyls of the glossy and the glaucous phenotypes contained 12.5 and 51.9 µg/cm^2, respectively. The wax mixture of the glossy phenotype was dominated by VLC aliphatic compounds. In the cuticular wax of the glaucous phenotype, VLC aliphatics were found in similar absolute amounts as in the glossy phenotype, whereas the triterpene loads were significantly higher. Here, the wax mixture was dominated by lupeol, making it the single most abundant component (56% of the total wax). To monitor the accumulation of cuticular lupeol during ontogenesis, the chemical composition of the wax mixture was studied at different stages of hypocotyl growth. In these investigations, lupeol was found to accumulate rapidly during early development at the surface of glaucous hypocotyls: between day 6 and day 25 the lupeol load increased by a daily rate of 1.2 µg/cm^2. During the period of highest lupeol increase from day 11 to day 18, a daily rate of 0.013 ng/cell could be calculated. Within that early time period a sharp increase in the number of epicuticular wax crystals on the surface of glaucous hypocotyls was observed by SEM. Based on the cuticular wax analyses of both stem phenotypes, it was hypothesized that a triterpene synthase should exist in castor bean responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol in the glaucous phenotype. In a homology-based cloning approach two epoxysqualene cyclases were cloned from R. communis, functionally expressed in the yeast strain GIL 77 and characterized as a cycloartenol synthase (RcCAS1) and a lupeol synthase (RcLUS1). Both the organ-specific expression of RcLUS1 (with an expression exclusively in stems of the glaucous phenotype) and the expression pattern during hypocotyl development (with a peak at day 12) exactly matched the accumulation of cuticular lupeol in the plant. From the strong correlation of the organ specific and time dependent accumulation of lupeol in the cuticle of glaucous hypocotyls on the one hand, and the expression patterns of the RcLUS1 gene on the other, it can be concluded that the lupeol synthase RcLUS1 from castor bean is the central enzyme responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol. This is the first report on a cuticle-relevant triterpene synthase. Based on the studies on castor bean, it can be concluded that the biosynthesis of cuticular triterpenoids is accomplished by enzymatic cyclisation of the substrate 2,3-oxidosqualene and obviously controlled by a transcription regulation of the corresponding epoxysqualene cyclase. Phylogenetic analyses revealed that RcLUS1 exhibits only weak sequence similarities to the two clades of so far known lupeol synthases and was thus interpreted as a first member of a new class of lupeol synthases in higher plants. The RcLUS1 mutant F257W was created by a site-directed mutagenesis approach and the mutated enzyme was functionally characterized in yeast. The mutation resulted in an altered product pattern, switching from lupeol to β-amyrin, thus confirming the importance of the corresponding Trp in amyrin synthases for the catalytical function of these enzymes. Besides Ricinus communis, Lycopersicon esculentum was chosen as a model plant to study the biosynthesis of cuticular triterpenes. The implementation of the homology-based primer design and cloning strategy developed for castor bean led to the successful cloning of two triterpene synthases from L. esculentum. One of these enzymes, LeTTS1, was characterized as a monofunctional β-amyrin synthase. In contrast to the glaucous stems of R. communis, with α-, β- and δ-amyrin, more then one single triterpene compound accumulates to high amounts in the tomato fruit cuticle. The evidence of the cuticle-relevance of the cloned epoxysqualene cyclases LeTTS1 and LeTTS2 has to be proven in accompanying experiments by determination of the expression patterns of these genes.

Polyketide (PK) und nichtribosomale Peptide (NRP) sind zwei grosse Klassen von Naturstoffen, die eine grosse Vielfalt hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion aufweisen. Sie werden von einer Reihe von Bakterien, Pilzen und Pflanzen als Sekundärmetabolite produziert und besitzen eine Vielzahl pharmakologisch wichtiger Aktivitäten, wie z.B. antimikrobielle, antimykotische, antitumorale oder antiparasitische Wirkungen. Ein Grossteil der bakteriellen Produzenten findet sich im Phylum Firmicutes, innerhalb der Gattungen Bacillus, Streptomyces und Mycobacterium. In E. coli sind Polyketide und nichtribosomale Proteine von eher geringer Bedeutung, mit Ausnahme der Siderophore Enterobactin und Yersiniabactin. Unerwartet war daher die Identifizierung eines neuen PKS/ NRPS-Gencluster in verschiedenen E. coli-Stämmen. Das 2006 durch NOUGAYRÈDE et al. zuerst beschriebene Colibactin-Gencluster kodiert für ein hybrides System aus modularen Polyketidsynthasen und nichtribosomalen Peptidsynthetasen sowie für zusätzliche editierende Enzyme und einen möglichen transkriptionellen Regulator (ClbR). Das Produkt der PKS/NRPS-Synthasen, Colibactin, übt in vitro einen zytopathischen Effekt (CPE) auf Säugerzelllinien aus. Die zytopathische Aktivität Colibactins zeichnet sich u.a. durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen in der DNA der eukaryotischen Zellen aus. Darüber hinaus kommt es zu einer Unterbrechung des Zellzyklus in der G2-Phase nach einer transienten in vitro Infektion mit Colibactin-positiven Bakterienstämmen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit war besonders die weitere Aufklärung der Struktur des Colibactinclusters sowie die regulatorischen Mechanismen, die die Exression des hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids von Interesse. Eine Transkriptionsanalyse führte zur Identifizierung der Transkriptionsstartpunkte der meisten relevanten Gene des Colibactinclusters. Basierend auf diesen neugewonnenen Informationen war eine Sequenzanalyse der upstream-Bereiche der Gene möglich, in deren Ergebnis neben den Elementen eines Sigma70-abhängigen Promotors, putative Bindestellen für mehrere Transkriptionsfaktoren identifiziert wurden. Untersuchungen zur Regulation der Colibactinsynthese zeigten, dass die Expression der Colibactin-Gene sowohl unter Kontrolle des Transkriptionsfaktors H-NS als auch des Colibactin-spezifischen Regulators ClbR stehen. Neben der Aufklärung der Struktur und Regulation der Colibactin-Gene bestand das Ziel dieser Arbeit in der Optimierung der Synthese des nichtribosomalen Peptid-Polyketids. Hierfür durchgeführte Expressionstudien zeigten einen Einfluss von Fettsäuren und Indol sowie von der Sauerstoffverfügbarkeit auf die Promotoraktivität einzelner Gene des Colibactin-Genclusters. Darüberhinaus konnte das pks-Genclusters erfolgreich in Pseudomonas putida KT2440 transferiert werden sowie der Nachweis der Funktionsfähigkeit Colibactins in diesem Wirtsorganismus nachgewiesen werden. Wenngleich die Stabilität des für diesen Zweck konstruierten Shuttle-Vektors nicht von Dauer ist, konnte gezeigt werden dass Pseudomonas putida prinzipiell als Wirtssystem für die Realisierbarkeit der heterologen Expression von Colibactin, geeignet ist. Zusätzlich zur Strukturanalyse des pks-Clusters und den Studien zur Expression der Colibactin-Gene befasste sich die hier vorliegende Arbeit mit der Fragestellung nach der biologischen Funktion Colibactins. Phänotypische Untersuchungen zeigen sowohl eine Beeinflussung der Eisenaufnahme als auch der Biofilmbildung durch das nichtribosomale Peptid-Polyketid. Dies sind die ersten Hinweise die zur Aufklärung der Funktion Colibactins beitragen könnten. / Polyketides (PK) and nonribosomal peptides (NRP) are two large classes of natural products showing a great variety in structure and function. They are produced as secondary metabolites by a range of bacteria, fungi and plants and exhibit a wealth of pharmacologically important activities, including antimicrobial, antifungal, antitumor or antiparasitic properties. The vast majority of bacterial producers belong to the phylum Firmicutes, especially to the genera Bacillus, Streptomyces and Mycobacterium. With the exception of the siderophores enterobactin and yersiniabactin polyketides and nonribosomal peptides are of minor relevance within E. coli. Therefore unexpected was the identification of a new PKS/ NRPS gene cluster in several E. coli strains. The colibactin gene cluster being described for the first time in 2006 by NOUGAYRÈDE et al. is coding for a hybrid system of modular polyketide synthases and nonribosomal petid synthetases as well as editing enzymes and a putative transcriptional regulator (ClbR). The product of these PKS/ NRPS synthases, termed colibactin, induces in vitro a cytopathic effect (CPE) on mammalian cell lines. The cytopathic activity of colibactin is characterized by the induction of double strand breaks in the DNA of eukaryotic cells as well as the arrest of the cell cycle in G2 phase after transient infection with E. coli strains expressing colibactin. In context of this thesis especially the elucidation of the regulation of clb operon transcription and the organisation of transcriptional units within the colibactin-encoding genomic island were of main interest. A transcriptional analysis led to the identification of the transcriptional starting points of most of the relevant genes within the colibactin cluster. Based on these newly obtained information it was possible to perform a sequence analysis of the upstream regions of the genes resulting in the detection of sigma70 depending promoter elements and several putative transcription factor binding sites. Studies on the regulation of the colibactin synthesis could also demonstrate that the expression of colibactin genes are under control of the transcription factor H-NS as well as the colibactin specific regulator ClbR. Beside the studies concerning the structure and regulation of colibactin genes optimization of the nonribosomal peptid-polyketid was object of this work. Therefor performed expression analysis showed an influence of fatty acids and indole, as well as the oxygen availability on the promoter activities of single genes within the colibactin gencluster. Further investigations belonging the transcriptome and the proteome of the Colibactin expressing strain E. coli Nissle 1917 showed an over all influence of Colibactin synthesis on the amino acid and carbohydrate metabolism of this strain. Further more a successful transfer of the pks gene cluster into Pseudomonas putida KT2440 was carried out as well as the demonstration of functionality of colibactin in this host organism. Even though long term stability of the constructed shuttle vector was not given it was shown that Pseudomonas putida is a suitable host for realizing the heterologous expression of colibactin. Additionally to the structural analysis of the pks cluster and the studies on expression of the colibatin genes this thesis questioned on the biological function of Colibactin. Phenotypical examination showed an influence of the iron upake as well as on biofilm formation due to the nonribosomal peptid – polyketide. These are the first evidences that could contribute the elucidation of Colibactin function.

University, Diss., 2004--Hamburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.