Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:35:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 331098.pdf: 3343639 bytes, checksum: 1aa3dc70f554a210df4d2516b5bbdff1 (MD5) Previous issue date: 2014 / O presente trabalho visou realizar um estudo fitoquímico analítico da espécie vegetal Senecio brasiliensis. Após o preparo do extrato bruto de diferentes partes da planta, foi desenvolvido um procedimento sistemático utilizando eletroforese capilar como guia para o subseqüente isolamento dos constituintes químicos. O procedimento aplicado permitiu verificar a presença de alcalóides, flavonóides e ácidos dicafeoilquinicos. Com o uso de técnicas espectroscópicas RMN, IV, EI-MS e ESI-MS foi possível identificar os alcalóides como senecionna, senecioina N-oxido, os ácidos x,y-dicafeoilquínicos 3,5, 3,4, 4,5 e 1,4, além dos flavonóides rutina e quercetrina. Para o estudo da distribuição dos alcalóides na planta, foi desenvolvido um método utilizando eletroforese capilar. A determinação de log P para os alcalóides foi efetuada através da EC, utilizando um mecanismo de separação em MEKC (cromatografia micelar capilar). O modelo obtido para os padrões foi log P = xlogk - y (n=6, R2 = 0.91) com log P variando de 0,4 ? 4,08. O valor de log P para a N-oxido senecionina foi determinado como < 0,4 e para a senecionina 0,7. Para a determinação da interação dos alcalóides pirrolizidinicos com albumina humana foi utilizado eletroforese capilar no modo PF-ACE. Ambos os compostos não apresentaram interação com a proteína humana. Para a determinação da permeabilidade em membrana paralela artificial (PAMPA) foi utilizada a técnica eletroforese capilar para as análises de permeabilidade. Com a finalidade de determinar alcalóides pirrolizidinicos em amostras de mel com diluição simples foi desenvolvido método utilizando HPLC-MS/MS.<br> / Abstract: This study aimed to carry out a phytochemical study of Senecio brasiliensis species under an analytical perspective. After preparation of the crude extract from different parts of plant, a systematic procedure using capillary electrophoresis (CE) as a guide for the subsequent isolation of the chemical constituents was developed. The procedure demonstrated the presence of alkaloids, flavonoids and dicaffeoylquinic acids. Using spectroscopic techniques (NMR, IR, EI-MS and ESI-MS) it was possible to identify the alkaloids senecionine[1] and N-oxide senecionine[2]; the x,y-dicaffeolylquinic acids (3,5)[3], (3,4)[4], (4,5)[5] and (1,4)[6] and also the flavonoids rutin[7] and quercetin[8]. To study the distribution of alkaloids in the plant, a novel method using CE was developed. For determining the log P for alkaloid, CE technique was used in MEKC (Micellar ElectrokineticChromatography) mode. The model obtained for the standards was logP=xlogk -y (n= 6, R2=0.91) with log P ranging from 0.4 to 4.08. The k values for senecionine and N-oxide senecionine were determined as0.7 and <0.4, respectively. To evaluate the interaction between pyrrolizidine alkaloids and human albumin (HSA), CE in PF-ACE (Partial-Filling Affinity Capillary Electrophoresis) mode was applied. The results suggest that both compounds do not present interaction with the studied protein. To determine the permeability of these alkaloids, experiments were carried out using parallel artificial membrane (PAMPA) and CE was used to analyze all solutions. In order to determine pyrrolizidine alkaloids in honey samples with simple dilution, a method using HPLC-MS/MS was developed.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-20T03:10:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334964.pdf: 2246614 bytes, checksum: 32093f6cd81b63a2fc050ea3ef34cd58 (MD5) Previous issue date: 2015 / A embriogênese somática (ES) é um métedo eficiente à propagaçãomassiva de plantas e à conservação de germoplasma. Em nível básico elase configura como um modelo biológico para o aprofundamento deestudos de morfogênese, fisiologia, bioquímica e genética de plantas.Muitos organismos apresentam características similares durante a ES, taiscomo a expressão de genes homólogos, o desenvolvimento de tecidosespecializados semelhantes ao observado na embriogênese zigótica e asrespostas a certos reguladores de crescimento. Para abordarprofundamente estas características associadas à ES de palmeirasneotropicais foi elaborada uma ampla revisão sobre este tema no primeirocapítulo desta dissertação. De uma forma geral esta revisão mostrou queembriões zigóticos e/ou meristemas apicais têm sido os explantes maisempregados, mostrando-se responsivos ao meio de cultura baseado naformulação salina de Murashige e Skoog suplementado com vitaminas deMorel, 3% de sacarose, carvão ativado e concentrações elevadas deauxinas, principalmente 2,4-D ou picloram. Em seguida, odesenvolvimento embrionário normalmente é estimulado em meios decultura suplementados com teores reduzidos destas auxinas e com oemprego de citocininas, notadamente BAP e 2-ip. Por fim, os embriõessão convertidos em plântulas em meios isentos de reguladores decrescimento. Além da micropropagação, muitos estudos concentraram-sena expressão de genes e na bioquímica do desenvolvimento de embriõessomáticos de palmeiras. Estudos histológicos sugeriram tendênciascomuns em diferentes espécies durante a morfogênese in vitro, tais comomorfologia semelhante dos ápices caulinares meristemáticos, calos ecélulas epidérmicas. No segundo capítulo estudou-se o emprego deculturas de protoplastos em três espécies de palmeiras, pupunha (Bactrisgasipaes), butiá-da-serra (Butia eriospatha) e açaí (Euterpe oleracea).Protoplastos são células com suas paredes celulares removidas eapresentam interesse tanto pela sua capacidade regenerativa quanto pelapossibilidade da geração de híbridos através da fusão somática de doisprotoplastos diferentes. Esta tecnologia tem sido investigada em váriasespécies de palmeiras, tais como dendê (Elaeis guineensis) e tamareira(Phoenix dactyilifera). Na presente dissertação, culturas embriogênicaspreviamente estabelecidas de pupunha, butiá-da-serra e açaí foramtratadas com uma solução enzimática composta por 2% de celulase, 0,5% de hemicelulase e 0,5 % de pectinase e em seguida elas foram23incubadas no escuro a 25 ± 2 ° C durante 6, 12, 18, ou 24 horas semagitação ou num agitador orbital a 45 rpm para o isolamento deprotoplastos. As maiores quantidades de protoplastos foram obtidasatravés da incubação em agitador orbital, sendo 5.50±0.68x105 e1.22±0.13x106 protoplastos / grama de peso fresco de pupunha e açaí,respectivamente, depois de seis horas de incubação, e 5,36 ± 2.23x105células / grama de peso fresco para butiá após 24 horas incubação.Culturas de pupunha e açaí mostraram diminuição de rendimento deprotoplastos após seis horas de incubação, enquanto a quantidade deresíduos celulares visíveis aumentou. A viabilidade de protoplastosmanteve-se elevada (> 70%), com exceção de protoplastos de açaí, cujaviabilidade diminuiu rapidamente após seis horas na incubação orbital.Os protoplastos foram cultivados usando o método de gotas de agarose oude alginato, sendo submetidos a seis tipos de meios líquidos contendo 0,1, ou 10 µM de picloram com ou sem 2µM de 2-ip. Picloram não semostrou essencial para as divisões celulares, as quais, no entanto forammais frequentes e ocorreram mais cedo em resposta a meios com níveiscrescentes do mesmo. Foram observadas microcolônias se formando nasgotas de alginato com 10 de µM picloram e 2 µM de 2-ip, no entantocolonias visíveis foram formados apenas em duas esferas de agarose. Noterceiro capítulo desta dissertação o incremento de massa seca e os teoresde proteínas, açúcares e amido foram investigados em culturas depupunha com diferentes capacidades para ES: alta capacidadeembriogênica (ACE), baixa capacidade embriogênica (BCE), e nãoembriogênica(NE). Culturas de ACE e NE apresentaram incrementos demassa seca semelhantes e que foram maiores queo incremento de massaseca em culturas de BCE. Culturas de ACE apresentaram teoresligeiramente mais elevados de proteínas do que as culturas NE, contudoambas continham maiores teores de proteínas do que as culturas de BCE.Níveis de amido foram semelhantes entre culturas de ACE e NE e queforam maiores que os níveis de amido em culturas de BCE. Níveis deaçúcares foram demasiadamente baixos para terem seus valorescalculados utilizando uma curva padrão de glicose, porém as leituras deabsorbância mostraram que as culturas de ACE e NE apresentaramvalores médios semelhantes e superiores aos níveis encontrados emculturas de BCE. Estes dados sugerem que os diferentes comportamentosde crescimento das diferentes culturas podem não refletir as quantidadestotais de proteínas, e sim os tipos de proteínas a serem expressas. A grandequantidade de amido nas culturas NE, juntamente com a morfologia24distinta destas culturas, pode sugerir uma rota regenerativa baseada naorganogênese. Além disso, é possível que a falta de reservas de energianas culturas de BCE esteja relacionada com o seu rápido crescimento.Formações de tecidos organizados também foram observadas nas culturade BCE, isto pode sugerir que a morfogênese in vitro não inclui apenasos embriões somáticos, calos, raiz e plântulas, mas pode incluir outrostipos de tecidos. No quarto capítulo buscou-se a optimização da ES emculturas de pupunha, butiá e açaí. Culturas de pupunha 'G3' foramcultivadas em meios de cultura compostos pelos sais de MS ou MSmodificado, suplementados com 1 mM de espermidina, 1 mM deespermina, ou sem poliaminas. Não houve diferença no número deembriões somáticos regenerados a partir dos meios de MS ou MSmodificado, no entanto, ambas as poliaminas apresentaram efeitosnegativos para a formação de embriões. Culturas de pupunha ?G2? foraminoculadas em meio de cultura contendo 3% de sacarose ou uma misturaigual de sacarose, glicose, frutose, e sorbitol, não revelando diferenças emtermos de números totais de embriões regenerados. Embriões zigóticos debutiá inoculados em meio MS contendo 3% sacarose, 2,5 g / L de carvãoativado e 300 µM ou 450 µM de picloram responderam com a formaçãode calos com aparência embriogênica similares aos observados empupunha, 40% e 27,5% respectivamente. No entanto, culturas friáveis debutiá foram submetidas a vários tipos de meios de cultura, incluindomeios sólidos e líquidos; diferentes concentrações de auxinas, citocininas,ABA, GA3, sacarose e carvão ativado,e ausência ou presença de luzdurante o cultivo, porém, em nenhum dos ambientes proporcionadosocorreu a formação de embriões somáticos. Além disso, desidrataçãoparcial não induziu melhorias na multiplicação das culturasde butiá, omesmo foi observado em culturas de pupunha. A multiplicação dasculturas de açaí foi melhorada com a adição 2,5 g / L de carvão ativado eaumento nos teores de picloram de 10 µM até 50 µM. O carvão ativadolevou à redução de 400% no número de explantes oxidados, um aumentono número de explantes produzindo embriões, número deembriõesformados por explante, e numero de massas poliembriogênicas porexplante. No entanto, os casos de crescimento de raizes organogênicas ede calogênese observados a partir de explantes de açaí colocadas emmeios com carvão ativado sugerem que o efeito da auxina diminui napresença de carvão ativado. Tomados em conjunto, os resultados dapresente dissertação contribuem para uma melhor compreensão dosestudos da morfogênese in vitro de palmeiras, notadamente aqueles25associados aos fatores envolvidos na tecnologia de protoplastos, àscaracterísticas bioquímicas de culturas de pupunha com diferentespotenciais embriogênicos e à otimização dos protocolos regenerativosestudados, especialmente o de açaí.<br> / Abstract : Somatic embryogenesis (SE) is a powerful technology that is useful for commercial propagation, scientific study, germplasm conservation, and has potential applications in reforestation attempts in damaged ecosystems. Many organisms show similar traits during SE, such as the expression of commonly-found gene homologs, development of specialized tissues similar to zygotic embryogenesis, and response to certain growth regulators. To summarize these trends, a review article was written (Chapter 1 of this thesis). A literature analysis of SE in the palm family, Arecaceae, suggests similar trends across palm species. Both zygotic embryos or palm shoot meristems tended to respond well to culture media composed of Murashige and Skoog salts, vitamins, 3% sucrose, exogenous activated carbon, and high concentrations of auxins, such as 2,4-D or picloram. Embryo development was usually stimulated through subculture onto media with reduced auxins and addition of cytokinin, such as BAP and 2-ip and then embryos could be frequently converted on media without growth regulators. In addition to micropropagation, many studies focused on the biochemistry and gene expression of developing palm somatic embryos. Histological studies revealed common trends, such as similar morphology of meristematic vs. callus and epidermal cells. One of the technologies that several research groups had evaluated was protoplast culture. Protoplasts, cells with their cell walls removed, are of scientific interest due to both being able to regenerate into larger cultures and the ability to create hybrids through somatic fusion of two different protoplasts. This technology has only been investigated in several large-scale economic species, such as oil palm (Elaeis guineensis) or date palm (Phoenix dactyilifera), and increased understanding of trends might lead to further development of protoplast culture as a whole (Chapter 2). To understand protoplast isolation and culture, previously-established peach palm (Bactris gasipaes), butiá-da-serra (Butia eriospatha), and açaí (Euterpe oleracea) cultures were treated with an enzyme solution composed of 2% w/v cellulase, 0.5% hemicellulase, and 0.5% pectinase and then either incubated stationary for 6, 12, 18, or 24 hours or on an orbital shaker at 45 rpm for 3, 6, 12, or 24 hours in the dark at 25±2 °C. Stationary incubation did not provide large amounts of protoplasts in comparison to incubation done on an orbital shaker. The greatest numbers of protoplasts per species were 5.50±0.68x105 and 1.22±0.13x106 protoplasts/ gram FW for peach palm and açaí after six hours of orbital shaking and 5.36±2.23x105 cells/gram FW for butiá after 24 hours of orbital shaking. Both peach palm and açaí saw dramatic decreases in protoplast yield after later incubations while the amount of visible cellular debris increased, possibly showing a potential reason for the decreased cell yield as cellular debris might lyse cells in motion. Protoplast viability remained high (>70%), except for açaí protoplasts, which decreased rapidly during orbital incubation. Protoplasts were cultured either using the agarose bead or the alginate bead method. Protoplasts cultured in alginate beads were subjected to six types of liquid media containing 0, 1, or 10µM picloram either with or without 2µM 2-ip. Auxin was not shown to be essential for causing cell division in several occasions, however cell division was more frequent and occurred earlier in media with increasing levels of picloram. 2-ip was not found to have a major impact. Microcolonies were observed to form in alginate beads with 10µM picloram and 2µM 2-ip, however visible colonies were only formed twice in agarose beads. Further optimization would be required to achieve regeneration of whole plants, however there are many trends in other species, such as use of nurse cultures, higher cell density during culture, and type of culture method, which can be pursued. The biochemistry of peach palm cultures with different capacities for SE, high embryogenic (HE), low embryogenic (LE), and non-embryogenic (NE), were investigated for dry weight, protein, sugar, and starch content (Chapter 3). It was found that both HE and NE cultures had similar dry weights, but water made up a larger proportion of LE cultures. Because of this difference, protein, sugar, and starch amounts were evaluated in terms of both fresh weight and dry weight. HE contained slightly higher amounts of protein than NE cultures, but both tissues contained higher proteins contents than LE cultures, even after adjusting for dry weight. Starch levels were comparable between HE and NE cultures, but LE cultures contained significantly fewer starch reserves. Sugar levels were too low to have their amounts calculated using a glucose standard curve, however their absorbance readings showed HE and NE cultures had the about the same values, while once again LE cultures contained fewer reserves. These data suggest that the different growth behavior of the different tissues may not reflect overall protein amounts, but rather the types of proteins being expressed. Additionally, the large amounts of starch growth, along with the distinct morphology of NE tissues might suggest a type of organogenesis. Additionally, it is possible that the lack of energy reserves found in LE tissue is related to its rapid growth. Organized tissue formations were also observed in LE tissue, possibly suggesting that in vitro organogenesis extends beyond simply somatic embryos, roots, and shoots. Additionally, SE optimization was investigated in peach palm, butiá, and açaí cultures. Peach palm tissue lines  G3 were placed on media containing either MS or modified MS salts and media containing 1mM spermidine, spermine, or no polyamines. No difference was detected in the number of somatic embryos recovered from MS or modified MS cultures, however either polyamine had a negative effect. Peach palm  G2 cultures were placed on media containing either 3% sucrose or an equal mix of sucrose, glucose, or sorbitol with no difference in total numbers of recovered embryos. Fast-growing friable butiá cultures were subjected to numerous types of media, including both solid and liquid media, media containing different concentrations of auxins, cytokinins, ABA, GA3, sucrose, and activated charcoal in both light and dark, but no somatic embryos were induced. Additionally, partial dehydration did not induce improved peach palm multiplication nor butiá SE. However, 40% and 27.5% placed on MS media containing 2.5g/L activated charcoal and 300µM or 450µM, respectively, picloram responded with tissue growth similar to that found in peach palm highly embryogenic tissue. Açaí multiplication was greatly improved through optimizing multiplication media with addition 2.5g/L activated charcoal and increased picloram up to 50µM from 10µM. The effects of the activated charcoal led to 400% reduction in number of oxidized explants, an increase in number of explants producing embryos, embryos per explant, number of embryos producing polyembryogenic masses, and number of polyembryogenic masses per explant. However, instances of organogenic root growth and increased callogenesis were observed on açaí explants placed on media with activated charcoal, which suggests that the decreased effect of auxin caused by activated charcoal can reduce embryogenic potential. Together, these works contribute to better understanding the trends found in multiple palms, factors involved in the valuable technology of protoplast culture, the biochemical characteristics of several types of peach palm tissue with different embryogenic potential, and cultural optimization, especially for the economically valuable açaí palm.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000068.pdf: 816656 bytes, checksum: c8740fc970374a5b1d5b8e0e1ab000ba (MD5) Previous issue date: 2007 / A cólera é uma doença bacteriana historicamente conhecida por seu potencial de provocar epidemias, tendo levado milhares de indivíduos à morte. É causada pelo bacilo Gramnegativo Vibrio cholerae O1 toxigênico. No Brasil, apesar de grandes avanços no que se refere a prevenção, a infecção ainda persiste e, embora não seja causa de alta mortalidade, sua presença é motivo de preocupação para a rede de Saúde Pública local. A infecção colérica é endêmica no nordeste brasileiro e está relacionada, principalmente, a condições sanitárias precárias. O diagnóstico clássico da infecção é a cultura bacteriana, complementada pela detecção da toxina colérica, o que retarda o resultado do exame. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a técnica de nested PCR em tubo único com dois genes alvos (MSTNPCR) na detecção de V. cholerae O1 diretamente do meio de cultura. Utilizando DNA, a técnica foi capaz de amplificar até 1 pg de V. cholerae O1, além de ter possibilitado a detecção do vibrião diretamente do meio de cultura líquido, sem prévia extração de DNA, apresentando limite de detecção de três Unidades Formadoras de Colônia. Além disso, a MSTNPCR mostrou-se específica para V. cholerae O1 quando testada com vários microrganismos diferentes. Um kit diagnóstico foi montado e estocado a -20 ºC, permanecendo estável durante os quatro meses em que foi testado. A MSTNPCR descrita neste trabalho pode ser útil no diagnóstico da infecção colérica e em investigações epidemiológicas, complementando os resultados obtidos com a cultura bacteriana

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:38:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) carlos_castro_ipec_dout_2011.pdf: 5337638 bytes, checksum: 01bdb8d35a9c2a777d82aa1aa6e41ab1 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A diferenciação sorológica entre casos incidentes e prevalentes de infecção pelo HIV tem sido descrita como uma importante ferramenta para subsidiar a análise das tendências da epidemia de HIV/AIDS. Considerando a importância de tal abordagem para avaliar eventuais tendências na diversidade viral, na resistência primária aos antirretrovirais nas infecções recentes e no monitoramento de grupos em risco, avaliamos indivíduos que buscaram a testagem para o HIV de novembro de 2004 a dezembro de 2008 em CTAs localizados em 4 cidades do estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Nova Iguaçu, Duque de Caxias e São Gonçalo). As amostras soropositivas foram testadas para a diferenciação entre infecções recentes e de longo termo utilizando-se o teste BED-CEIA. Um subconjunto destas também foi avaliado pelo método de indice de avidez (IA) e por marcadores imunológicos - linfócitos TCD4+ e/ou \03B22 microglobulina, a fim de propor um algoritmo com maior especificidade para a detecção de amostras de indivíduos recém infectados pelo HIV-1. Amostras de soroconvertidos recentes (SR) e um subconjunto dos soroconvertidos de longo termo (SLT) foram selecionados para os protocolos de biologia molecular, sendo sequenciado um fragmento do gene pol da região que codifica a protease e a transcriptase reversa Nossos resultados destacam que os HSH continuam a ser uma população altamente vulnerável, tendo prevalência até onze vezes maior que os homens heterosexuais entre os SR. A aplicação de uma zona cinzenta e a avaliação do estado imune contribuiram para uma redução significativa da presença de amostras indeterminadas quando os testes BED-CEIA e de IA foram aplicados, sendo o de IA mais específico. Embora não tenha sido observado tendência de mudança importante no padrão de subtipos de HIV-1 quando comparou-se RS e LTS no primeiro ano, ao longo do estudo revelou-se um incremento da proporção de amostras recombinantes, bem como uma crescente proporção de amostras relacionadas com CRFs em comparação com URFs, o que alinha-se com dados recentes publicados pela OMS-UNAIDS. Em nosso estudo esta tendência se deveu ao aumento entre os homens, sendo este aumento mais pronunciado entre os heterossexuais do que entre os HSH. Entre estes genomas recombinantes foi encontrado pela primeira vez no Rio de Janeiro amostras relacionados ao subtipo K, assim como uma detecção crescente de amostras com recombinação envolvendo os subtipos A e G entre os indivíduos caracterizados como recém infectados. Nossos dados revelam que os níveis de resistência primária aos antirretrovirais permaneceram relativamente estáveis ao longo do tempo, mas em um patamar preocupante. Entre os HSH a taxa de resistência foi o dobro da registrada em homens heterosexuais, o que sugere uma distribuição desigual em relação a resistência primária em determinados subgrupos. Novos estudos devam ser realizados com foco em populações específicas de forma a contribuir para o monitoramento da dinâmica da epidemia nas mesmas / The serological differentiation between incident an d prevalent cases of HIV infection has been described as an important tool t o detect trends in HIV/AIDS. Considering the importance of such approach to asse ss possible trends in viral diversity and primary resistance to antiretroviral drugs in r ecent infections and monitoring of groups at risk, we evaluate individuals who sought testing for HIV from November 2004 to November 2008 in VCTs located in four cities in the state of Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Nova Iguaçu, Duque de Caxias and Sao Gonca lo). The seropositive samples were tested to differentia te between recent and long< term infections using the BED<CEIA test and a subse t was also evaluated by the avidity test (AI) and immunological markers, lymphocytes TC D4 + and/or β2 microglobulin, aiming to propose an algorithm with more specificit y for the detection of individuals newly infected with HIV<1. Samples of recent seroco nverted (SR) and a subset of long< term seroconverted (LTS) were selected for molecula r protocols, where sequences were obtained from the fragment of the pol gene region which encodes the protease and reverse transcriptase. Our results highlight that MSM continue to be a hig hly vulnerable population, with prevalence up to eleven times higher than among het erosexual men between the RS samples. In fact, prevention interventions focused on this group should be continuously implemented. The application of a gray zone area an d the evaluation of the immune status contributed to a significant reduction in th e presence of indeterminate samples when both BED<CEIA and AI tests were applied, and t he AI showed to be more specific than the BED<CEIA. Although no trend has been obser ved in the pattern of HIV<1 subtypes when RS and LTS in the first year were com pared, an increase in the proportion of recombinant samples as well as an inc reasing proportion of samples related to CRF compared with URFs < which aligns wi th recent data published by WHO< UNAIDS< were detected throughout the study. In ou r study this trend was due to the increase among men, and even more pronounced among heterosexual men than among MSM. Among the recombinant genomes, samples relate d to subtype K, were found for the first time in Rio de Janeiro and a growing prop ortion of samples with recombination involving subtypes A and G among individuals charac terized as newly infected was detected. Overall levels of primary resistance to a ntiretroviral drugs are a matter of concern, although remained relatively stable over t ime. Among MSM, the resistance rate was twice as high as among heterosexual men, sugges ting an uneven distribution in relation to primary resistance in certain groups. F urther studies should be implemented in order to monitor the dynamics of the epidemic in key populations

Made available in DSpace on 2014-12-22T16:37:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 livia_carvalho_ipec_mest_2012.pdf: 2880203 bytes, checksum: 7bd6bd57b25b05667dce1ddd625d140a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-08-11 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) apresenta formas clínicas variadas, podendo simular outras doenças. A forma esporotricóide da leishmaniose é relativamente incomum, e apresenta-se como úlcera de inoculação com nódulos e/ou gomas ao longo de trajeto linfático. Tal apresentação torna-se particularmente relevante no contexto da epidemia de esporotricose vivenciada no Rio de Janeiro há pouco mais de uma década, pois ambas as enfermidades compartilham espaços físicos semelhantes neste estado. No intuito de compreender melhor a forma esporotricóide da LTA (LE), em especial o papel da resposta imune celular na determinação desta apresentação clínica peculiar, estudamos o comportamento clínico, epidemiológico e imunológico in situ destes pacientes, comparando os resultados obtidos com os de pacientes que apresentam formas clínicas típicas de leishmaniose cutânea (LC). O estudo compreendeu 494 pacientes consecutivamente atendidos no Laboratório de Vigilância em Leishmanioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, entre janeiro de 2004 e dezembro de 2010, tendo sido excluídos os pacientes com leishmaniose mucosa e com leishmaniose difusa anérgica atendidos no período, e foi dividido em duas etapas Na primeira, foi feita uma análise clínica, comparando-se as características clínicas e epidemiológicas de 23 pacientes com diagnóstico de LE e 471 pacientes com LC. Demonstrou-se que 14 (60,9%) pacientes de LE eram do sexo feminino; a média de idade era de 44,74 anos; doze pacientes (52,2%) tiveram lesões localizadas em membros superiores (p = 0,037). Já no grupo com LC predominava o sexo masculino, com 304 (64,5%) pacientes (p = 0,024); a média de idade era de 35,94 anos (p = 0,032); e as lesões localizavam-se nos membros inferiores em 38% dos casos (p = 0,048). A distribuição entre os sexos, a idade e a localização das lesões foram consideradas significativamente diferentes entre os dois grupos. Na segunda etapa, realizou-se a análise imunohistoquímica de fragmentos obtidos através de biópsia de lesões cutâneas de 15 pacientes com LE comparados com os de 30 pacientes de LC. Observou-se que o infiltrado inflamatório, de distribuição heterogênea nas lesões de pacientes com LC, era mais intenso nas lesões dos pacientes com LE, que apresentavam ainda grande quantidade de tecido fibrótico Observamos elevação significativa do percentual de neutrófilos (média LE = 21,21; LC = 13,53; p=0,019), maior intensidade da Óxido Nítrico Sintase 2, e diminuição da concentração de células Bcl2 (média LE = 22,58; LC = ix 32,98; p=0,036), conferindo à forma esporotricóide de LTA um caráter mais inflamatório e destrutivo quando comparada com a forma típica da doença. Os resultados demonstram que a LTA esporotricóide pode se assemelhar clínica e imunologicamente com a esporotricose cutaneolinfática, sugerindo-se um estudo comparativo entre ambas / American Tegumentary Leishmania sis (ATL) has varied clinical presentations and can mimic other diseases. The sporotrichoid form of leishmaniasis is relatively uncommon and clinically may presents as an ulcer with nodules and / or gums along lymphatic pathways . This presentation is parti cularly relevant in the context of the epidemic of sporotrichosis in Rio de Janeiro State experienced for a little more than a decade, because both diseases share endemic areas there. In order to better understand sporotrichoid leishmaniasis (SL), in parti cular the role of cellular immune response in determining this peculiar clinical presentation , we studied the clinical , epidemiological and immunological in situ behavior of these patients , comparing the results with those of patients presenting typical cl inical forms of cutaneous leishmaniasis ( CL). T he study comprised 494 consecutive patients treated at the Leishmaniasis Surveillance Laboratory at Evandro Chagas Clinical Research Institute ( IPEC), Oswaldo Cruz Foundation ( FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazil, between January 2004 and December 2010 ; patients with mucosal leishmaniasis and cutaneous diffuse anergic leishmaniasis attended at this period of time were excluded. It was divided into two steps. At first a clinical analysis was made, comparing the clinical and epidemiological characteristics of 23 patients with S L and 471 patients with C L . I t was demonstrated that 14 (60.9 %) of the SL p atients were female; their average age was 44.74 years; twelve patien ts (52.2 %) had lesions in the upper limbs ( p = 0.037) . In the CL group males predominated , with 304 ( 64.5% ) of the patients ( p = 0.024); the average age was 35.94 years ( p = 0.032); and lesions were located in the lower limbs in 38% of cases ( p = 0.048) . G ender distribution , age and location of the lesions were considered significantly different between the two groups. In the second step , immunohistochemical analysis of lesion samples from skin lesions in 15 patients with S L was performed and compared with those of 30 C L patients . I t was observed that the inflammatory infiltrate , which was heterogeneously distributed in the lesions of patients with C L, wa s more intense in lesions of patients with SL , which additionally had large amounts of fibrotic tissue. We observed an increase in the percentage of neutrophils (mean SL = 21.21; C L = 13.53; p = 0.019) , greater intensity of nitric oxide synthase 2 , and decreased concentration of Bcl2 cells (mean SL = 22.58; LC = 32.98; p = 0.036) , giving the SL form more in flammatory and destructive characteristics when compared with the typical form of the disease. The results showed important differences in the characterization of clinical presentation of ATL that can be useful during the diagnostic procedures

Made available in DSpace on 2014-10-07T16:55:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 66913.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-05T15:56:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_quintella_ipec_dout_2010.pdf: 1999651 bytes, checksum: d5134bebbcaaadc74b1e395bf121db85 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose cutânea (LC) se caracteriza por lesões granulomatosas, comumente ulceradas, e a esporotricose é importante diagnóstico diferencial. O presente trabalho objetivou determinar alterações histopatológicas úteis para essa diferenciação e relatar um caso de LC em que houve hiperplasia pseudoepiteliomatosa exuberante que foi confundida com carcinoma de células escamosas. Foi realizado um estudo das alterações histopatológicas de 119 lesões cutâneas ativas de esporotricose em lâminas coradas pela hematoxilina e eosina e, posteriormente, uma comparação entre as alterações em 171 lesões ativas de LC e 97 de esporotricose em que não se encontrou o microorganismo ao exame histopatológico. Todos os casos foram diagnosticados pelo isolamento do agente em cultura A esporotricose se caracterizou histopatologicamente por uma dermatite difusa granulomatosa supurativa com necrose. A LC apresentou granulomas dos tipos \201Cclareira de Montenegro\201D e \201Ctuberculóide\201D e degeneração da matriz extracelular de forma significativamente mais freqüente do que a esporotricose. A esporotricose apresentou granulomas dos tipos \201Csupurativo\201D e \201Cestrelado\201D, células gigantes de diferentes tipos, granulomas associados a tecido de granulação e abscessos não associado aos granulomas de forma significativamente mais freqüente do que a LC. Uma análise múltipla dessas alterações por regressão logística demonstrou que elas podem distinguir as duas doenças corretamente em cerca de 90% dos casos. Assim, o exame histopatológico pode fornecer informações importantes na condução do diagnóstico diferencial entre a LC e a esporotricose. A hiperplasia pseudoepiteliomatosa na LC pode simular um carcinoma de células escamosas / Cutaneous leishmaniasis (CL) is characte rized by granulomatous lesions, often ulcerated, and sporotrichosis is an important differential diagnosis. This study aimed to determine histopathological changes that coul d assist in this differentiation and to report a case of CL which presented ex uberant pseudoepitheliomatous hyperplasia thas was mistaken for squamous cell carc inoma. A study of histopathological changes of 119 active cutaneous lesions of sporotrichosis in hematoxylin-eosin stained slides was conduct ed, and then a comparison between the changes in 171 CL and 97 sporotrichosis active lesions in which the microorgani sm was not found on histopathological examination. All cases were diagnosed by is olation of the agent in culture. Sporotrichosis was histopathologically characteri zed by a diffuse suppurative granulomatous dermatitis with necrosis. CL showed granuloma of "Montenegro clearing" and "tuberculoid" types and degeneration of extracellular matrix significantly more frequent than sporotrichosis. Sporotrichosis presented granulomas of "suppurative" and "stellate" types, giant cells of different types, granulomas associated with granulati on tissue, and abscesses not associated with granulomas significantly more frequent than CL. A multip le analysis of these changes by logistic regression demonstrated that they can correctly distinguish the two diseases in about 90% of cases. Thus, the histopathologic al examination can provide important information in guiding the differential diagnosis between CL and sporotrichosis. Pseudoepitheliomatous hyperplasia in CL can mimic squamous cell carcinoma

Made available in DSpace on 2015-02-27T17:39:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 47.pdf: 882272 bytes, checksum: 401f86c677016c9683a9566630f091be (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Produtos biológicos, tais como soros hiperimunes e vacinas, podem ser definidos como produtos derivados ou produzidos a partir de organismos vivos. Isso implica que suas características podem variar de um lote para outro. Conseqüentemente, um minucioso controle da qualidade na liberação de lotes é requerido para garantir que esses produtos sejam seguros e eficazes. O ensaio de potência com animais é um dos ensaios preconizados para garantir a qualidade das vacinas e soros hiperimunes. Somente para realização do ensaio de potência para o produto final de vacinas e soros antidiftéricos (SAD) e antitetânicos (SAT), são utilizados no INCQS cerca de 5.000 animais por ano, desses aproximadamente 4.500 animais são utilizados na etapa de soroneutralização e o restante na etapa de imunização. Neste contexto, e baseado nos princípios dos 3Rs, o objetivo deste trabalho foi padronizar e validar o método imunoenzimático de inibição da ligação da toxina (ToBI) capaz de avaliar a potência de SAD, SAT e de vacinas bacterianas combinadas: tétano-difteria uso adulto (dT) e uso infantil (DT) e tétano-difteria-pertussis (DTP), como alternativa da etapa de soroneutralização do ensaio de controle de potência. Os resultados encontrados indicam que o método proposto apresenta linearidade, especificidade e precisão (intra e inter-ensaio) satisfatórias e que é um ensaio confiável, rápido e conveniente para avaliar a potência de componentes diftérico e tetânico presentes em vacinas e soros hiperimunes. Além disso, reduz drasticamente o número de animais usados, o tempo na liberação de laudos e os custos associados ao controle da qualidade destes produtos. O método ToBI apresenta potencial para a substituição do ensaio em animais na determinação de potência de vacinas e soros antidiftéricos e antitetânicos... / Produtos biológicos, tais como soros hiperimunes e vacinas, podem ser definidos como produtos derivados ou produzidos a partir de organismos vivos. Isso implica que suas características podem variar de um lote para outro. Conseqüentemente, um minucioso controle da qualidade na liberação de lotes é requerido para garantir que esses produtos sejam seguros e eficazes. O ensaio de potência com animais é um dos ensaios preconizados para garantir a qualidade das vacinas e soros hiperimunes. Somente para realização do ensaio de potência para o produto final de vacinas e soros antidiftéricos (SAD) e antitetânicos (SAT), são utilizados no INCQS cerca de 5.000 animais por ano, desses aproximadamente 4.500 animais são utilizados na etapa de soroneutralização e o restante na etapa de imunização. Neste contexto, e baseado nos princípios dos 3Rs, o objetivo deste trabalho foi padronizar e validar o método imunoenzimático de inibição da ligação da toxina (ToBI) capaz de avaliar a potência de SAD, SAT e de vacinas bacterianas combinadas: tétano-difteria uso adulto (dT) e uso infantil (DT) e tétano-difteria-pertussis (DTP), como alternativa da etapa de soroneutralização do ensaio de controle de potência. Os resultados encontrados indicam que o método proposto apresenta linearidade, especificidade e precisão (intra e inter-ensaio) satisfatórias e que é um ensaio confiável, rápido e conveniente para avaliar a potência de componentes diftérico e tetânico presentes em vacinas e soros hiperimunes. Além disso, reduz drasticamente o número de animais usados, o tempo na liberação de laudos e os custos associados ao controle da qualidade destes produtos. O método ToBI apresenta potencial para a substituição do ensaio em animais na determinação de potência de vacinas e soros antidiftéricos e antitetânicos. Entretanto, para efeitos regulatórios, se faz necessária a realização de um estudo colaborativo, envolvendo laboratórios de diversos segmentos, para conclusão da validação da metodologia considerando os parâmetros já avaliados nessa etapa.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:59:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 joselio_araujo_ioc_dout_2009.pdf: 11696830 bytes, checksum: 45f6a57d0a27af32727404bbd7154585 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Dengue é uma importante arbovrirose (arthropod-bone virus) e contitui um grave problema de saúde pública não só no Brasil, mas também nos países de clima tropical. A Aedes aegypti é o principal vetor dos vírus dengue (DENV) e está presente na maioria dos países entre as latitudes 35ºN e 35ºS. Neste trabalho, apresentamos quatro estudos. No primeiro estudo, analisamos os níveis de RNA viral do DENV-3 e sua correlação com o tipo de infecção (primária ou secundária) em casos fatais e não fatais por dengue, ocorridos no estado do Rio de Janeiro, 2002. O grupo de casos fatais apresentou uma média de título viral significativamente mais elevada do que o grupo de casos não fatais. Considerando que infecções primárias foram confirmadas entre os casos fatais (52,1%), a teoria da infecção seqüencial por si só não explica todos os casos graves da doença. Estes resultados sugerem que altos níveis de DENV-3 podem ter contribuído para a forma grave do dengue no Rio de Janeiro, 2002.No segundo estudo, diferentes métodos de diagnóstico foram aplicados para investigar a presença dos DENV em amostras de tecidos humanos obtidos a partir de casos fatais (n = 29), ocorridos durante e grande epidemia em 2002 no estado do Rio de Janeiro, Brasil. A combinação de quatro métodos permitiu a confirmação da infecção por DENV-3 em 26 (89,6%) dos 29 casos suspeitos. . O isolamento viral foi obtido em 2,7% (2/74) das amostras, a partir da inoculação em cultura de células C6/36. A técnica de nested RT-PCR permitiu a identificação do DENV-3 em 30,5% (22/72) das analisadas. O método de RT-PCR em tempo real possuiu maior sensibilidade, detectando o RNA viral em 58,4% (45/77) dos espécimes clínicos, incluindo fígado (n=18), pulmão (n=8), cérebro (n=6), rim (n=3), medula óssea (n=1) e coração (n=1). A técnica de imunohistoquímica detectou o antígeno viral em 44% (26/59) das amostras analisadas A precisão e eficácia do RT-PCR em tempo real fez desta técnica uma ferramenta importante no diagnóstico rápido das infecções por dengue. No terceira estudo, revisamos a filogeografia dos três principais genótipos do DENV-3 e estimamos sua taxa de evolução, como base na análise do gene do envelope (E) de 200 isolados, provenientes de 31 países ao redor do mundo, durante um período de 50 anos (1956 \2013 2006). Nossa análise filogenética revelou uma subdivisão geográfica da população dos DENV-3, com grupamentos específicos em vários países. Os padrões migratórios dos principais genótipos dos DENV-3 mostraram que genótipo I circula principalmente na porção marítima do Sudeste Asiático do Sul do Pacífico, o genótipo II permaneceu dentro das zonas continentais do Sudeste Asiático, enquanto o genótipo III foi disseminado na Ásia, Leste da África e Américas. Não foi observada co-circulação de diferentes genótipos em uma única localidade, sugerindo que alguns fatores, além da distância geográfica podem limitar a contínua dispersão e re-introdução de novas variantes de DENV-3. As estimativas das taxas evolutivas não revelaram diferenças significativas entre os principais genótipos do DENV-3. A média da taxa de evolução em regiões que sofreram epidemias de dengue desde a década de 70 (por exemplo, Indonésia e Tailândia) foi semelhante ao observado em regiões que presenciam estas epidemias desde a década de 90 (por exemplo, Américas). Neste estudo, estimamos o ano de origem das atuais linhagens do DENV-3 em torno de 1890, e o surgimento da atual diversidade dos seus principais genótipos entre meados de 1960-1970, coincidindo com o crescimento da população humana, urbanização, movimento humano e descrição dos primeiros casos de febre hemorrágica por DENV-3 na Ásia No quarto estudo, examinamos a atual classificação filogenética dos DENV-3 circulantes no Globo, com destaque para o novo genótipo (GV) descrito no Brasil. A circulação de um novo genótipo de DENV-3 foi recentemente descrito no Brasil e na Colômbia, porém, sua classificação exata tem sido controversa. Análises de distância nucleotídica do gene E apóia a subdivisão do DENV-3 em cinco linhagens distintas, denominadas genótipos (GI-GV), e confirma a classificação deste novo genótipo na América do Sul como pertencente ao GV. Distâncias genéticas extremamente baixas entre isolados brasileiros pertencentes ao GV e a amostra protótipo Philippines/L11423 isolada em 1956 levantam questões impor tantes sobre a origem deste genótipos na América do Sul / Dengue is an important arbovirus (arthropod-borne virus) and constitutes a serious problem of public health not only in Brazil but also in the major tropical countries. Aedes aegypti is the main vector of dengue virus (DENV) and is present in most countries between latitudes 35ºN and 35ºS. In this manuscript, we present four distinct studies. In study 1, we examined levels of dengue virus type 3 RNA in association with the type of infection (primary or secondary) in patients with fatal and nonfatal outcomes in Rio de Janeiro State, 2002. Subjects with fatal outcomes had mean virus titers significantly higher than those who survived. Because primary infections were confirmed among the fatal cases (52.1%), antibody-dependent enhancement alone did not explain all the cases of severe disease in this study population. These findings suggest that high levels of DENV-3 may have contributed to the severe form of dengue in Rio de Janeiro, 2002. In the second study, we investigate by different diagnostic methods dengue virus in human tissue specimens obtained from fatal cases (n=29) during a large-scale dengue fever epidemic in 2002 in the State of Rio de Janeiro, Brazil. The combination of four procedures provided diagnostic confirmation of DENV-3 infection in 26 (89.6%) out of the 29 suspected fatal cases. Dengue virus (DENV) was isolated from 2/74 (2.7%) tissue samples, inoculated into C6/36 cells and identified as DENV-3, nested RT-PCR accusing 22/72 (30.5%) samples as DENV-3. Real-time RT-PCR yielded the highest positivity rate, detecting viral RNA in 45/77 (58.4%) clinical specimens, including the liver (n=18), lung (n=8), spleen (n=8), brain (n=6), kidney (n=3), bone marrow (n=1) and heart (n=1). Immunohistochemical tests recognized the DENV antigen in 26/59 (44%) specimens. Given the accuracy and effectiveness of real-time RTPCR in this investigation, this approach may play an important role for rapid diagnosis of dengue infections. In the third study, we revisited the phylogeography of the three of major DENV-3 genotypes and estimated its rate of evolution, based on the analysis of the envelope (E) gene of 200 strains isolated from 31 different countries around the world over a time period of 50 years (1956 to 2006). Our phylogenetic analysis revealed a geographical subdivision of DENV-3 population in several country-specific clades. Migration patterns of the main DENV-3 genotypes showed that genotype I was mainly circumspect to the maritime portion of Southeast-Asia and South Pacific, genotype II stayed within continental areas in South-East Asia, while genotype III spread across Asia, East Africa and into the Americas. No evidence for rampant co-circulation of distinct genotypes in a single locality was found, suggesting that some factors, other than geographic proximity, may limit the continual dispersion and reintroduction of new DENV-3 variants. Estimates of the evolutionary rate revealed no significant differences among major DENV-3 genotypes. The mean evolutionary rate of DENV-3 in areas with long-term endemic transmissions (i.e., Indonesia and Thailand) was similar to that observed in the Americas, which have been experiencing a more recent dengue spread. We estimated the origin of DENV-3 virus around 1890, and the emergence of current diversity of main DENV-3 genotypes between the middle 1960s and the middle 1970s, coinciding with human population growth, urbanization, and massive human movement, and with the description of the first cases of DENV-3 hemorrhagic fever in Asia. In the fourth study, we re-examined the current phylogenetic classification of DENV-3 strains, with emphasis on the new genotype (GV) described in Brazil. Circulation of a new DENV-3 genotype was recently described in Brazil and Colombia, but the precise classification has been controversial. Phylogenetic and nucleotide distance analyses of the envelope (E) gene support the subdivision of DENV-3 strains into five distinct genotypes (GI to GV), confirming the classification of this new genotype in South America as GV. The extremely low genetic distances of Brazilian GV strains to the prototype Philippines/L11423 strain isolated in the 1956 GV sample raise important questions regarding the origin of this genotype in South America.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 brunna_marques_ioc_mest_2013.pdf: 2715065 bytes, checksum: aaa9be9dc694a52d7bf82b8c0cd65be7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é feito pela detecção de marcadores sorológicos e moleculares, porém o custo destas metodologias é bastante elevado e a coleta de sangue para a realização destes ensaios além de requerer pessoal treinado, é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos e padronizar métodos de diagnóstico molecular para infecção pelo HCV em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SPF) para facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas ou com recursos limitados. Para isto, 99 indivíduos forneceram amostras pareadas de soro e SPF, dentre os quais 59 eram anti-HCV reagente e 40 eram não reagentes em suas amostras de soro. As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à técnica de quantificação comercial. Para o desenvolvimento da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) in house, uma curva padrão interna foi construída utilizando um plasmídeo contendo o inserto do HCV e iniciadores e sonda foram desenhados para a região 5´NC do HCV. Para otimização da técnica, a concentração de cDNA, transcriptase reversa e números de ciclos de reação foram avaliados. Para a extração de RNA de HCV em amostras de SPF, sete métodos foram avaliados. A sensibilidade, especificidade, correlação, reprodutibilidade e presença de inibidores da RT-PCR quantitativa também foram determinados. O conjunto de QIAamp DNA Mini Kit foi o método mais eficiente para extração do RNA do HCV em SPF. A RT-qPCR in house desenvolvida foi capaz de quantificar o HCV no soro de 44 amostras onde a mediana de carga viral foi inferior aquela observada na técnica comercial (log10 4,94 e log10 6 cópias de HCV/mL, respectivamente). A faixa de detecção do método in house foi de 10 a 109 cópias de HCV por reação Para a detecção de HCV em SPF foi necessário o aumento da transcriptase reversa e de cDNA, permitindo que 35 amostras fossem detectadas com um limite mínimo de detecção igual a 58,5 cópias/mL e a mediana de carga viral foi semelhante à observada nas respectivas amostras de soro avaliadas pela técnica comercial (log10 5,38 e log10 5,89 cópias de HCV/mL, respectivamente). Obteve-se boa reprodutibilidade da RT-qPCR in house através da análise da curva padrão e de amostras de soro e SPF. Não foi observada a presença de inibidores de reação utilizando o GAPDH como controle interno. Quando comparado com a metodologia comercial, a RT-qPCR apresentou sensibilidade de 74,58% (IC95% 61,5-85,0) em soro e 59,3% (IC95% 45,7-71,9) em SPF, e a especificidade foi igual a 100% para ambos espécimes. Quando a RT-qPCR foi avaliada entre os dois espécimes clínicos, a sensibilidade da técnica em SPF foi igual a 65,9% (IC95% 50,0-79,5) e a especificidade foi igual a 100%. Quarenta e cinco amostras de soro e quinze amostras de SPF foram amplificadas na RT-PCR qualitativa, onde 43 amostras de soro e 11 amostras de SPF foram sequenciadas. Entre as amostras de soro, 29 foram classificadas como subgenótipo 1b, 13 como subgenótipo 1a, 1 como genótipo 3. Entre as amostras de SPF, 9 foram classificadas como subgenótipo 1b e 2 como subgenótipo 1a. Foi observada alta homologia nucleotídica entre as sequencias de HCV das amostras pareadas de soro e SPF onde todas foram classificadas como genótipo 1. Conclui-se que o sangue em papel de filtro pode ser utilizado para detecção, quantificação e análise filogenética do HCV, sendo uma ferramenta promissora para estudos de epidemiologia da hepatite C / The d iagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection is made by detection of molecular and serologic al markers, but the cost of these methodologies is quite high and blood sample collection requires trained personnel what it is difficult in remote areas or prese nting few resources. The aim of this study was to optimize protocols and standardize molecular diagnostic methods for HCV infection in dried blood samples (DBS) to facilitate access to diagnosis in remote areas or with limited resources. For this, 99 indiv iduals provided paired serum and DBS samples , where 59 of them were anti - HCV rea ctive and 40 were non - reactive in their serum samples. A nti - HCV positive samples were subjected to commercial quantification technique. For the development of quantitative RT - P CR (RT - qPCR) in house, an internal standard curve was constructed using a plasmid containing the insert and HCV primers and probe designed for the 5' non coding ( NC ) region of HCV. For optimization of these technique s , the concentration of cDNA, reverse tr anscriptase and numbers of cycles of reaction were evaluated. For the extraction of HCV RNA in DBS samples, seven methods were evaluated. The sensitivity, specificity, correlation, reproducibility and presence of inhibitors in quantitative RT - PCR were also determined. Q IAamp DNA Mini Kit was the most efficient method for HCV RNA extraction among DBS samples . The in house RT - qPCR was able to quantify HCV among 44 serum samples where the median viral load was lower than that observed in commercial technique ( 4.94 log 10 and 6 log 10 copies of HCV / mL, respectively). The range of HCV detection using in house RT - qPCR was 10 - 10 9 copies of HCV per reaction. For HCV detection in DBS , it was necessary to increase reverse transcriptase and cDNA concentration giving 35 HCV RNA reactive samples with a limit of detection equal to 58.5 copies of HCV / m L and the median viral load was similar to that observed in their sera evaluated by commercial technique (5.38 log 10 and 5.89 log 10 copies of HCV / mL, respectively). In hous e RT - qPCR presented good reproducibility using standard curve and paired DBS and sera samples . It was not observed the presence of inhibitors of the reaction using GAPDH as internal control. In house RT - qPCR showed a sensitivity of 74.58% (95% CI 61.5 to 8 5.0) in serum and 59.3% (95% CI 45.7 to 71.9) in DBS, and the specificity was 100% for both specimens compared to the commercial methodology . When the RT - qPCR was evaluated in two clinical specimens, the sensitivity of the technique in DBS was equal to 65. 9% (95% CI 50.0 to 79.5) and specificity was 100%. Forty - five serum samples and 15 DBS samples were amplified in qualitative RT - PCR, where 43 serum samples and 11 DBS samples were sequenced. Among the serum samples, 29 were classified as HCV subgenotype 1b , 1 3 as subgenotype 1a, genotype 1 and 3. Among DBS samples, 9 were 9 classified as HCV subgenotype 1b and 2 as HCV subgenotype 1a. HCV nucleotide sequences presented high homology between paired DBS and sera samples and all of them were classified as geno type 1. It is conclude that dried blood spot may be used for detection, quantification and phylogenetic analysis of HCV and it is a promising tool for studying the epidemiology of hepatitis C

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:45:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 liana_pereira_ioc_mest_2014.pdf: 4702231 bytes, checksum: 2246716c6d5dbccb2563a99addb4684d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A síndrome pulmonar por hantavírus (SPH) tem sido registrada no Brasil desde 1993 e a transmissão para o homem ocorre através da inalação de partículas virais presentes em aerossóis de excretas de roedores infectados. No Brasil, nove genótipos virais caracterizados a partir de roedores e/ou humanos foram descritos, sendo seis comprovadamente patogênicos. Desde os primeiros registros, mais de 1600 casos humanos foram confirmados, com ampla distribuição entre a maioria dos estados brasileiros e alta taxa de letalidade. A SPH apresenta-se como doença febril aguda caracterizada pelo grave comprometimento cardiovascular e respiratório. Os pacientes podem exibir uma ampla variedade de manifestações clínicas, onde os sinais e sintomas podem ser confundidos com os de outras doenças. Assim é necessário o diagnóstico diferencial separando casos de SPH de outros agravos com manifestações clínicas semelhantes, como é o caso da dengue. Embora não existam relatos de casos humanos no estado do Rio de Janeiro, foram encontradas evidências sorológicas em humanos e confirmação de circulação de hantavírus patogênico entre roedores silvestres, mais especificamente, na espécie Oligoryzomys nigripes, no Parque Nacional da Serra dos Órgãos, em Teresópolis Neste cenário, este estudo teve como objetivos avaliar a infecção por hantavírus em amostras humanas e em amostras de roedores silvestres e sinantrópicos provenientes de diversos municípios fluminenses. Um total de 497 amostras de soro de pacientes negativos para dengue pelos testes sorológicos, cedidas pelo LACEN/RJ, provenientes de 25 municípios, e de 235 amostras de roedores provenientes de sete municípios, foram analisadas através do ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos anti-hantavírus da classe IgM e IgG (ELISA IgM e IgG) e de testes moleculares. Cinco amostras de pacientes (1%) procedentes dos municípios de Valença, Vassouras e Nova Friburgo foram ELISA-IgM reativas. Um roedor (0,42%) da espécie Oligoryzomys nigripes ELISA-IgG foi reativo no município de Valença. A ausência de RNA nas amostras humanas impossibilitou a realização de testes moleculares para caracterização e identificação do vírus, porém na amostra do roedor reativo foi possível detectar a variante viral Juquitiba como responsável pela infecção deste espécime Em conclusão, a identificação do hantavírus patogênico Juquitiba em roedores silvestres e a evidência sorológica de infecção em amostras humanas neste estudo reforçam a importância e a necessidade de vigilância da SPH no estado do Rio de Janeiro / Toxoplasma gondii usually causes an asymptomatic infection, but it can present severity during pregnancy and in immunocompromised patients . Current therapies for toxoplasmosis are restricted only against tachyzoites, and have little or no effect on bradyzoites, which are kept in tissue cysts like source of the infection recrudescent. Consequently, new therapeutic alternatives have been proposed, as the use of Atovaquone that showed some effica cy against tachyzoites and bradyzoites in tissue cysts. In this work, we propose to study the effect of 3 - BrPA, a compound that is being tested against cancer cells, on the infection of LLC - MK 2 cells with tachyzoites of T. gondii (RH strain) . N o effect of 3 - BrPA on host cell proliferation and viability was observed. Evaluation of 3 - BrPA interference on in vitro growth of T. gondii showed a reduction in intracellular parasite proliferation about 55% after 24 h of treatment, and 61% after 48 h. Intracellular d evelopment of parasite, analyzed by SEM, showed morphological characteristics commonly found in tissue cysts. Incubation of cultures with DBA lectin confirmed the development of cysts and TEM showed the presence of bradyzoites. Moreover, we revealed the pr esence of degraded parasites and the influence of compound on endodyogeny. Another approach used was the treatment of infected cultures with combination of 3 - BrPA and Atovaquone. This r esulted in the reduction of intracellular parasites of 73% after 24 h o f treatment and 71% after 48 h, compared to control, besides the absence of cyst wall formation in these cultures. The refore, it is concluded that use of 3 - BrPA may pres ent as an important tool for study of: (i) in vitro c ystogenesis , (ii) the metabolism o f the parasite, requiring deeper understanding of the target of action of the compound in T. gondii , (iii) the alternatives metabolic pathways of the parasite, and (iv) the molecular / cellular triggered that led to death of the parasites mechanisms.