La règlementation européenne requiert l’évaluation de la reprotoxicité des ingrédients cosmétiques sans avoir recours aux tests sur les organismes définis par la directive européenne sur les animaux utilisés à des fins scientifiques. Pour cribler par exclusion des substances chimiques, l’industrie cosmétique a besoin de développer une méthode alternative à l’expérimentation animale prédictive et spécifique à l’identification d’agents tératogènes (substances entraînant au cours du développement embryonnaire et de manière définitive des malformations physiques et/ou fonctionnelles). Pour cela, le poisson zèbre, le poisson médaka et l’amphibien xénope aux stades embryonnaires ont été évalués sur une liste de 43 substances de référence. Le médaka a été sélectionné pour la fiabilité de son approvisionnement, la robustesse de ses stades embryonnaires lors des manipulations, ainsi que pour les performances du test l’utilisant. De plus, ce test permet de détecter les agents tératogènes les plus puissants, près de la moitié des 26 substances tératogènes de notre liste. Son taux de spécificité est fixé à 100% pour identifier correctement les 17 substances négatives dont l’absence d’effets tératogènes chez l’homme ou un organisme modèle mammifère, est avérée. Néanmoins, les performances de ce test pourraient être améliorées par son automatisation et par l’intégration de la quantification de nouveaux paramètres pour l’identification de malformations fonctionnelles. Enfin, pour prédire l’innocuité d’une substance chimique chez l’Homme, le test prédictif de tératogénicité utilisant les embryons de médaka doit être intégré dans une stratégie globale d’évaluation de la tératogénicité. / European legislation requires the assessment of reproductive toxicity of cosmetic ingredients without using tests on the organisms defined by the European directive on animals used for scientific purposes. To screen by excluding chemicals, cosmetics industry needs to develop an alternative method to animal testing, which needs to be predictive and specific in identifying teratogen agents (during embryonic development substances causing definitive physical and / or functional defects). For this, zebrafish, medaka fish and Xenopus amphibian at embryonic stages were assessed on a list of 43 reference substances. Medaka has been selected to the reliability of its supply, the robustness of its embryonic stages during handling, as well as for performance of its test. In addition, this test can detect the most potent teratogen agents, nearly half of the 26 teratogens of our list. Its specificity rate is set at 100% for correctly identifying 17 negative substances for which the absence of teratogenic effects is proved in humans or mammalian model organism. However, the performance of this test may be improved by its automation and integration of new quantification parameters for the identification of functional defects. Finally, to predict the safety of a chemical in humans, the predictive teratogenicity test using medaka embryos must be integrated into a comprehensive strategy for assessing the teratogenicity.

La majorité des polluants organiques persistants, tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), sont hydrophobes et de ce fait s'accumulent au cours du temps dans les sédiments aquatiques. Dans ce contexte, des tests ont été mis en œuvre sur embryons et pro-larves de truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss et de médaka japonais Oryzias latipes pour étudier la toxicité de ces contaminants. Un sédiment artificiel et de nouveaux critères d'effets sur l'intégrité de l'ADN et l'activité natatoire ont été développés pour améliorer la reproductibilité et la sensibilité des tests. Ces bioessais ont été appliqués à la comparaison de la toxicité de trois mélanges de HAP : un extrait pyrolytique et deux extraits issus d'un pétrole léger Arabian Light et lourd de type Erika. Les trois mélanges de HAP ont été enrobés sur un sédiment artificiel ou sur des graviers à des concentrations comparables à celles retrouvées dans l'environnement. L'exposition des embryons à ces matrices contaminées a provoqué des perturbations de l'expression de gènes impliqués dans le fonctionnement mitochondrial, le métabolisme de la vitamine A, la formation de dommages à l'ADN ainsi que la synthèse d'hormones. Parallèlement ces mélanges ont induit des effets tératogènes, des perturbations de l'activité natatoire et des effets génotoxiques. Le degré de toxicité et le spectre d'effets induits étaient différents selon la composition des mélanges testés. Les mélanges pétrogéniques présentant une forte proportion en HAP de faibles poids moléculaires et HAP alkylés, se sont avérés plus toxiques envers les jeunes stades de développement de poissons que le mélange pyrolytique, composé en majorité de HAP à hauts poids moléculaires non substitués. Des résultats comparables ont été obtenus avec les modèles médaka japonais et truite arc-en-ciel.

Les sédiments agissent comme de véritable puits pour certains polluants organiques persistants et métaux représentant ainsi une source de contamination secondaire pour les milieux aquatiques. Dans ce contexte, un test embryo-larvaire utilisant le Medaka japonais (Oryzias latipes) a été développé afin d’évaluer la toxicité des polluants fixés aux particules sédimentaires. Le bioessai consiste à maintenir les embryons de Medaka en contact direct avec le sédiment durant tout leur développement embryonnaire puis à évaluer les effets létaux et sublétaux induits au niveau phénotypique et moléculaire chez les embryons et larves exposés. Tout d’abord, le bioessai a été appliqué à la caractérisation de la toxicité et des modes d’action de substances organiques et métalliques pures. Le pyrène et son dérivé, le méthylpyrène, se sont avérés fortement tératogènes avec un spectre de malformations rappelant le syndrome de la maladie du sac bleu. L’étude du profil d’expression génique a révélé la perturbation de certains processus cellulaires notamment la voie AhR, le métabolisme mitochondrial et la voie de signalétique et de métabolisation des rétinoïdes. Le cuivre et le cadmium ont induit de nombreuses malformations squelettiques et cardio-vasculaires, des dommages à l’ADN ainsi que l’altération de l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial, la régulation du cycle cellulaire et la réparation de l’ADN. Enfin, le bioessai a été appliqué à l’évaluation du potentiel toxique de sédiments naturels du système Lot-Garonne et du Bassin d’Arcachon. L’ensemble des sédiments testés a montré un large spectre d’effets tératogènes et seuls quelques-uns ont conduit à des effets létaux. Par ailleurs, l’expression plusieurs gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial, la voie AhR, le contrôle du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN et la détoxication des métaux a été modifiée lors de l’exposition à certains sédiments contaminés de la zone d’étude. / Aquatic sediments act as real sink for numerous anthropogenic chemicals such as persistent organic pollutants and heavy metals as well as a secondary contamination source. In this context, a fish embryo-larval assay was developed using the Japanese Medaka (Oryzias latipes) as a test organism to evaluate de toxicity of particle-bound contaminants. In this aim, fish embryos are kept in direct contact to sediment during their whole embryonic development and induced lethal and sub-lethal effects are measured at the phenotypical and molecular levels. This test was first applied to the toxicity evaluation and modes of action characterization of organic and metallic single compounds. Pyrene and its alkylated derivative, methylpyrene, revealed a high teratogenic potency inducing developmental deformities similar to the blue sac disease syndrome. Gene expressions response pattern using RT-PCR method highlighted the alteration of several cellular process including AhR pathway, mitochondrial metabolism and retinoids signaling and metabolism pathways. Copper and cadmium mainly induced numerous skeletal and cardiovascular injuries, DNA damage as well as modifications of gene expression involved in mitochondrial metabolism, DNA damage repair and cell cycle regulation. Finally, the Medaka embryo-larval assay was applied to analyze the toxic potential of natural sediments form the Lot-Garonne system and the Arcachon bay. All tested sediments showed a wide range of teratogenic effects but only few of them revealed to be acutely toxic. Moreover, the expression of several genes involved in mitochondrial metabolism, AhR pathway, cell cycle arrest, DNA repair and heavy metals detoxication proved to be modified in the presence of some contaminated sediments from the studied area.

De nombreuses substances chimiques sont utilisées par l’industrie cosmétique pour entrer dans la composition de formules. En dehors de la nécessité d’évaluer leur efficacité, l’industrie cosmétique se doit surtout d’évaluer la sécurité de leurs substances pour l’humain. L'évaluation toxicologique des substances chimiques est réalisée dans le but de révéler un effet toxique potentiel de la substance testée. Parmi les effets potentiels que l’on souhaite détecter, la toxicité du développement (tératogénicité), c’est-à-dire la capacité d’une substance à provoquer l’apparition d’anomalies lors du développement embryonnaire, est fondamentale. En accord avec les législations internationales qui interdisent à l’industrie cosmétique d’avoir recours à des tests sur animaux de laboratoire pour l’évaluation de leurs substances, l’évaluation toxicologique de ces substances se base sur les résultats de tests in silico, in vitro et de tests faits sur des modèles alternatifs aux animaux de laboratoire. Pour le moment cependant, peu de méthodes alternatives existent et ont été validées pour la toxicologie du développement. Le développement de nouvelles méthodes alternatives est donc requis. D'autre part, en plus de l’évaluation de la sécurité des substances chez l’humain, l’évaluation de la toxicité pour l’environnement est nécessaire. L’usage de la plupart des produits cosmétiques et d’hygiène corporelle conduit, après lavage et rinçage, à un rejet à l’égout et donc dans les cours d’eau. Il en résulte que les environnements aquatiques (eaux de surface et milieux marins côtiers) sont parfois exposés aux substances chimiques incluses dans les formules cosmétiques. Ainsi, l’évaluation toxicologique environnementale des cosmétiques et de leurs ingrédients nécessite de connaître leur toxicité sur des organismes représentatifs de chaînes alimentaires aquatiques. Dans ce contexte, le modèle embryon de poisson présente un double avantage pour l’industrie cosmétique. Ce modèle, jugé par les législations internationales comme étant éthiquement acceptable pour les évaluations toxicologiques réalisées par l’industrie cosmétique, est représentatif des organismes aquatiques. Il est donc pertinent pour évaluer la toxicité environnementale des substances chimiques. D'autre part, ce modèle apparaît prometteur pour évaluer l’effet tératogène de substances chimiques chez l’humain. Pour ces raisons, un test d’analyse de la tératogénicité des substances chimiques est actuellement développé. Ce test se base sur l’analyse d’embryons de medaka (Oryzias Latipes) à 9 jours post fertilisation, après exposition des embryons par balnéation à des substances à concentrations déterminées. L’analyse de paramètres fonctionnels et morphologiques conduit au calcul d’un indice tératogène, qui permet de tirer une conclusion quant à l’effet tératogène de la substance testée. Cet indice est calculé à partir des mesures du taux de mortalité et du taux de malformations chez les embryons. L’objectif de ce projet est d’automatiser le test d’analyse de la tératogénicité, par classification automatique des embryons faite à partir d’image et de vidéo. La première méthode développée concerne la détection des battements cardiaques à partir de séquences vidéos, dans le but de calculer le taux de mortalité. Nous nous sommes ensuite concentrés sur deux types de malformations courantes qui sont les malformations axiales, et l'absence de vessie natatoire, en utilisant une méthode d'apprentissage automatique. Cette analyse doit être complétée par l'analyse d'autres malformations et conduire à un calcul du taux de malformations et de l’indice tératogène pour la substance testée / Numerous chemicals are used as ingredients by the cosmetics industry and are included in cosmetics formula. Aside from the assessment of their efficacy, the cosmetics industry especially needs to assess the safety of their chemicals for human. Toxicological screening of chemicals is performed with the aim of revealing the potential toxic effect of the tested chemical. Among the potential effects we want to detect, the developmental toxicity of the chemical (teratogenicity), meaning its capability of provoking abnormalities during the embryonic development, is crucial. With respect to the international regulations that forbid the use of animal testing for the safety assessment of cosmetics, the toxicological assessment of chemicals must base on an ensemble of in silico assays, in vitro assays and alternative models based assays. For now, a few alternative methods have been validated in the field of developmental toxicology. The development of new alternative methods is thus required. In addition to the safety assessment, the environmental toxicity assessment is also required. The use of most of cosmetics and personal care products leads to their rejection in waterways after washing and rince. This results in the exposition of some aquatic environments (surface waters and coastal marine environments) to chemicals included in cosmetics and personal care products. Thus, the environmental assessment of cosmetics and of their ingredients requires the knowledge of their toxicity on organisms that are representative of aquatic food chains. In this context, the fish embryo model, which is ethically acceptable according to international regulations, presents a dual advantage for the cosmetics industry. Firstly, as a model representative of aquatic organisms, it is accurate for the environmental assessment of chemicals. Secondly, this model is promising for the assessment of the teratogenic effect of chemicals on human. For this reason, a teratogenicity assessment test is developed. This test is based on the analysis of medaka fish embryos (Oryzias Latipes) at 9 days post fertilization, after balneation in a predetermined concentration of the chemical under study. The analysis of functional and morphological parameters allows to calculate a teratogenicity index, that depends on both rates of dead and malformed embryos. This index allows to to draw a conclusion concerning the teratogenic effect of the chemical.The objective of this project is to automate the teratogenicity test, by automated image and video classification. A first method is developed that aims to automatically detect embryo heart beats from acquired video sequences. This method will allow to calculate the proportion of dead embryos. We then focus on the detection of two common malformations: axial malformations and absence of a swim bladder, based on a machine learning classification. This analysis must be completed by the detection of other malformations so that we can measure the rate of malformed embryos and thus, calculate the teratogenicity index of the tested chemical

La majorité des polluants organiques persistants, tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), sont hydrophobes et de ce fait s’accumulent au cours du temps dans les sédiments aquatiques. Dans ce contexte, des tests ont été mis en œuvre sur embryons et pro-larves de truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss et de médaka japonais Oryzias latipes pour étudier la toxicité de ces contaminants. Un sédiment artificiel et de nouveaux critères d’effets sur l’intégrité de l’ADN et l’activité natatoire ont été développés pour améliorer la reproductibilité et la sensibilité des tests. Ces bioessais ont été appliqués à la comparaison de la toxicité de trois mélanges de HAP : un extrait pyrolytique et deux extraits issus d’un pétrole léger Arabian Light et lourd de type Erika. Les trois mélanges de HAP ont été enrobés sur un sédiment artificiel ou sur des graviers à des concentrations comparables à celles retrouvées dans l’environnement. L’exposition des embryons à ces matrices contaminées a provoqué des perturbations de l’expression de gènes impliqués dans le fonctionnement mitochondrial, le métabolisme de la vitamine A, la formation de dommages à l’ADN ainsi que la synthèse d’hormones. Parallèlement ces mélanges ont induit des effets tératogènes, des perturbations de l’activité natatoire et des effets génotoxiques. Le degré de toxicité et le spectre d’effets induits étaient différents selon la composition des mélanges testés. Les mélanges pétrogéniques présentant une forte proportion en HAP de faibles poids moléculaires et HAP alkylés, se sont avérés plus toxiques envers les jeunes stades de développement de poissons que le mélange pyrolytique, composé en majorité de HAP à hauts poids moléculaires non substitués. Des résultats comparables ont été obtenus avec les modèles médaka japonais et truite arc-en-ciel. / Most persistent organic pollutants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), are hydrophobic and therefore accumulate over time in aquatic sediments. In this context, tests were performed on rainbow trout Oncorhynchus mykiss and Japanese medaka Oryzias latipes embryos and prolarvae to study the toxicity of these contaminants. Artificial sediment and new integrative endpoints including DNA integrity and swimming activity were developed to improve reproducibility and sensitivity of the tests. These bioassays were applied to the toxicity assessment of three PAH mixtures: a pyrolytic extract and two petrogenic extracts from Arabian Light and Erika oils. The three PAH mixtures were spiked onto sediment or gravel at environmental relevant concentrations. Embryonic exposure to these contaminated matrices induced alteration of gene expressions involved in mitochondrial functions, vitamin A metabolism, DNA damages and hormone synthesis. In parallel, these mixtures induced teratogenicity, alteration of swimming activity and genotoxicity. The toxicity potency and spectrum of effects differed according to PAH mixture composition. The petrogenic mixtures, with high proportions of low molecular weight PAHs and alkylated PAHs, were more toxic to fish early life stages than the pyrolytic mixture, mainly composed of high molecular weight PAHs non substituted. Comparable results were obtained with Japanese medaka and rainbow trout early life stages.

L'écotoxicité de différentes nanoparticules de carbone (NPC) a été évaluée chez des organismes aquatiques, en particulier chez Xenopus laevis. Il a été montré que la surface des NPC est le paramètre le plus pertinent pour décrire l'inhibition de croissance chez le xénope, indépendamment de leur forme allotropique et de leur état de dispersion. L'induction des micronoyaux a aussi été étudiée chez le xénope, et l'oxyde de graphène (GO) s'est révélé génotoxique à faible dose, résultat corroboré par l'étude de l'expression des gènes. Les mécanismes de toxicité impliqués seraient notamment liés aux fonctions oxygénées de la particule. De plus, le GO a aussi entrainé de la génotoxicité chez Pleurodeles waltl. et de la tératogénicité, des retards de développement et de l'inhibition de croissance chez Chironomus riparius. La mise en interaction de ces organismes au sein d'un mésocosme a également conduit à l'observation de génotoxicité chez le pleurodèle en présence de GO. / The ecotoxicity of different carbon-based nanoparticles (CNPs) was assessed in freshwater organisms, especially in Xenopus laevis. The surface of the CNPs was shown to be the more relevant parameter to describe the growth inhibition in Xenopus, regardless of their allotropic form and their state of dispersion. Micronucleus induction was also studied in Xenopus and graphene oxide (GO) was found genotoxic at low dose. This result was in compliance with the study of genes expression. The involved toxicity mechanisms would be related to the oxidized functions of the CNP. Moreover, GO was also found responsible for genotoxicity in Pleurodeles waltl. and for teratogenicity, development delay and growth inhibition in Chironomus riparius. These organisms have finally been put together in a mesocosm, which has also led to genotoxicity in Pleurodeles in the presence of GO.

Différents effets de nanotubes de carbone (NTC) sur des diatomées benthiques ont été évalués via des approches microscopiques et biochimiques. Il a été montré que la structure du frustule, paroi silicifiée propre aux diatomées, est déterminante sur l'entrée ou non des NTC dans les cellules. Une internalisation des NTC dans la cellule a conduit à des effets génotoxiques et tératogènes. L'interaction des NTC avec les substances polymériques extracellulaires (SPE) produites par les diatomées a aussi été évaluée. Les SPE ont favorisé l'agglomération des NTC entre eux, ainsi que leur isolement physico-chimique vis-à-vis des diatomées. Une réponse des diatomées à la présence des NTC par la surproduction de SPE explique partiellement le retard de croissance observé. De plus, Des interactions entre SPE et NTC, majoritairement hydrophobes, ont été révélées. Ces interactions ont permis de réduire considérablement les effets des NTC sur les diatomées au cours du temps. / Various effects of carbon nanotubes (CNTs) on benthic diatoms were assessed via microscopic and biochemical approaches. It has been shown that the structure of the specific to diatoms silicified frustule has a key role in the entry or not of CNTs into the cells. Moreover, Internalization of CNTs in the cell led to genotoxic and teratogenic effects. The interaction of the CNTs with the extracellular polymeric substances (EPS) produced by diatoms was also evaluated. EPS favored agglomeration of CNTs between them as well as their physico-chemical isolation for diatoms. A response of diatoms in the presence of CNTs by the overproduction of EPS partially explains the observed growth retardation. In addition, interactions between the EPS and CNTs, mainly hydrophobic, have been revealed. These interactions significantly reduced the effects of CNTs in diatoms over time.