Neste trabalho tentamos traçar quais seriam os efeitos funcionais e de expressão gênica de mutações patogênicas no gene TCOF1 em células não embrionárias. A partir do estabelecimento de culturas celulares oriundas de periósteo facial de quatro pacientes portadores da síndrome de Treacher Collins (STC), obtivemos populações celulares com mais de 95% de marcação positiva para antígenos que caracterizam células de origem mesenquimal. Demonstramos que as células-tronco mesenquimais e fibroblastos provenientes de pacientes com STC apresentaram redução da expressão de TCOF1 de aproximadamente 31% quando comparados aos controles. Tal redução se mostrou compatível com a diminuição da expressão dos transcritos portadores de mutação patogênica observada no seqüenciamento do cDNA dos pacientes. Portanto, estes resultados sugerem que há degradação do transcrito mutado, que muito possivelmente deve ser regulada pelo mecanismo de non-sense mediated mRNA decay (NMD) e corroboram o modelo de haploinsuficiência da Treacle. Como o pico de expressão do gene Tcof1 é detectado durante o estágio embrionário de formação das células da crista neural e embriões de camundongos Tcof1+/- apresentam redução da proliferação das células neuroepiteliais, testamos se haveria alteração da capacidade proliferativa de células mesenquimais adultas com mutações no TCOF1. A análise das taxas de crescimento das culturas celulares provenientes de pacientes com STC se mostrou semelhante aos controles normais, indicando que menores níveis de transcritos do gene não interferem na capacidade proliferativa celular. Além disso, avaliamos o potencial de diferenciação óssea in vitro, mostrando que menores níveis de TCOF1 também não parecem influenciar a capacidade de diferenciação celular. Apesar de ainda não termos identificado um fenótipo celular, a deficiência de TCOF1 em células não embrionárias resulta na alteração da expressão gênica, já que a análise da expressão genômica das culturas celulares identificou uma série de genes diferencialmente expressos. Ademais, genes de parada do ciclo celular e apoptose com expressão aumentada em células embrionárias de camundongo Tcof1+/- não apresentaram expressão aumentada nas células humanas com mutações patogênicas no TCOF1, sugerindo que a via da p53 não está ativa nestas células não embrionárias. Dentre os genes diferencialmente expressos encontrados, o aumento dos transcritos de DAXX nas células-tronco mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 poderia modular as funções da p53 nessas células, constituindo um bom alvo de investigações futuras para a elucidação da função do TCOF1 em células não embrionárias. Os resultados obtidos sugerem que deficiência de TCOF1 em células mesenquimais leva à ativação de outras vias de sinalização, cujo efeito funcional é ainda desconhecido. Quais seriam as funções e em quais vias celulares o TCOF1 agiria, são questões a serem elucidadas a respeito do papel do gene na fase adulta. / In this work we tried to outline the effects of functional and gene expression of pathogenic mutations in the gene TCOF1 in non-embryonic cells. From the establishment of facial periosteum derived cell culture of four patients with Treacher Collins syndrome (TCS), we obtained cell populations that are more than 95% positive for mesenchymal origin characteristic antigens. We demonstrated that mesenchymal stem cells and fibroblasts from patients with TCS showed reduction of approximately 31% in the TCOF1 expression when compared to controls. This reduction was consistent with the decrease in the expression of transcripts carrying the pathogenic mutations observed when sequencing the cDNA of the patients. Therefore, these results suggest that degradation of the mutated transcript occurs and it may possibly be governed by the mechanism of non-sense mediated mRNA decay (NMD), thus corroborating the Treacle haploinsufficiency model. As the peak of TCOF1 gene expression is detected during the embryonic stage of the formation of neural crest cells and Tcof1+/- mice embryos had shown reduction of neuroepithelium cells proliferation rate, we tested if there is a change in proliferative capacity of adult mesenchymal cells with mutations in TCOF1. The analysis of the growth rate of TCS patients cells was similar to normal controls, indicating that lower levels of transcripts of the gene does not interfere with cellular proliferative capacity. Furthermore, we evaluated the bone differentiation potential of these cells in vitro, showing that lower levels of TCOF1 also seem does not influence cell differentiation ability. Although a cellular phenotype has not yet been identified, deficiency of TCOF1 in non-embryonic cells results in gene expression change, since genomic analysis of the expression of cell cultures identified a number of differentially expressed genes. Furthermore, arresting cell cycle and apoptosis related genes with increased expression in embryonic cells of Tcof1+/- mice showed no increased expression in human cells with pathogenic mutations in TCOF1 suggesting that the p53 pathway is not active in these non-embryonic cells. Among the differentially expressed genes found, the increase of DAXX transcripts in mesenchymal stem cells with pathogenic mutations in TCOF1 could modulate the function of p53 in these cells, providing a good target for future investigations to elucidate the function of TCOF1 in non-embryonic cells. The results suggest that deficiency of TCOF1 in mesenchymal cells leads to activation of other signaling pathways, whose functional effects are still unknown. The functions and cellular pathways in which the TCOF1 act, are issues yet to be elucidated concerning the role of the gene during adulthood.

A síndrome de Treacher Collins (STC) é um distúrbio do desenvolvimento craniofacial de herança autossômica dominante causada por mutações no gene TCOF1, localizado no cromossomo 5 (5q32). Utilizando as técnicas de SSCP e seqüenciamento, estabelecemos um método eficiente para a detecção de mutações no gene TCOF1, o que permitiu oferecer o teste diagnóstico aos pacientes com suspeita clínica de STC. Identificamos a mutação responsável pela síndrome em 39/43 (90,7%) dos pacientes atendidos pelo Centro de Estudos do Genoma Humano e em 23/48 (48%) dos pacientes encaminhados pelo Johns Hopkins Medical Institute. Desse modo, caracterizamos 43 novas mutações patogênicas e 16 novos polimorfismos no gene TCOF1. A detecção de uma troca de aminoácido de caráter patogênica em uma região conservada da proteína nos levou a propor a existência de um domínio funcional importante nessa região. Realizamos triagem de mutações no gene TCOF1 em 24 pacientes com anomalias faciais em estruturas derivadas do 1o e 2o arcos branquiais, mas sem diagnóstico de STC. Nenhuma mutação patogênica foi encontrada nesses casos, indicando que a STC, apesar de apresentar uma grande variabilidade clínica, é uma entidade circunscrita. Triamos também, pela primeira vez, duas famílias cujo padrão de segregação do quadro clínico sugere um padrão de herança autossômico recessivo. Também nesse caso não encontramos mutação no gene TCOF1, apesar de uma análise de segregação com marcadores da região 5q31-q34 não ter excluído essa região de uma possível relação com a síndrome. Testamos, empregando pela primeria vez ferramentas moleculares, a hipótese que as mutações esporádicas que causam a STC têm origem preferencial na linhagem germinativa de homens mais velhos. Ao contrário do sugerido pela literatura, em dez casos informativos encontramos 70% das mutações no cromossomo herdado do pai e 30% de origem materna e nenhuma correlação com aumento de idade paterna. / Treacher Collins syndrome (TCS) is an autosomal dominant disorder affecting craniofacial development. The syndrome is caused by mutations in the TCOF1 gene, located in chromosome 5 (5q32). Combining SSCP and sequencing, we established an efficient method of screening for mutations in the TCOF1 gene, allowing us to offer diagnostic tests to patients with clinical signs of TCS. We detected a pathogenic mutation in 39/43 (90.7%) of patients ascertained at the Centro de Estudos do Genoma Humano and in 23/48 (48%) of patients referred to Johns Hopkins Medical Institute. We therefore characterized 43 novel pathogenic mutations and 16 novel polymorphisms in the TCOF1 gene. We described a pathogenic missense mutation located in a conserved region of the protein, which led us to propose the existence of a critical function domain in its N-terminus. After screening 24 patients with craniofacial anomalies resembling TCS but without a precise clinical diagnosis for mutations in the TCOF1 gene, we found no pathogenic mutation and concluded that, despite its broad clinical spectrum, TCS is well characterized in clinical grounds. We also screened, for the first time, two families in which the segregation of the phenotype suggested autosomal recessive inheritance. No mutation was detected in these families, despite linkage analysis with markers from 5q31-34 not excluding this region. We used molecular techniques for the first time to test the hypothesis that sporadic mutations in TCS arise preferentially in the male germ line and their frequency increases with age. As opposed to what the literature suggested, in ten informative cases we had 7 mutations of paternal origin and 3 originating in the female germ line, with no detectable age effect.

Neste trabalho tentamos traçar quais seriam os efeitos funcionais e de expressão gênica de mutações patogênicas no gene TCOF1 em células não embrionárias. A partir do estabelecimento de culturas celulares oriundas de periósteo facial de quatro pacientes portadores da síndrome de Treacher Collins (STC), obtivemos populações celulares com mais de 95% de marcação positiva para antígenos que caracterizam células de origem mesenquimal. Demonstramos que as células-tronco mesenquimais e fibroblastos provenientes de pacientes com STC apresentaram redução da expressão de TCOF1 de aproximadamente 31% quando comparados aos controles. Tal redução se mostrou compatível com a diminuição da expressão dos transcritos portadores de mutação patogênica observada no seqüenciamento do cDNA dos pacientes. Portanto, estes resultados sugerem que há degradação do transcrito mutado, que muito possivelmente deve ser regulada pelo mecanismo de non-sense mediated mRNA decay (NMD) e corroboram o modelo de haploinsuficiência da Treacle. Como o pico de expressão do gene Tcof1 é detectado durante o estágio embrionário de formação das células da crista neural e embriões de camundongos Tcof1+/- apresentam redução da proliferação das células neuroepiteliais, testamos se haveria alteração da capacidade proliferativa de células mesenquimais adultas com mutações no TCOF1. A análise das taxas de crescimento das culturas celulares provenientes de pacientes com STC se mostrou semelhante aos controles normais, indicando que menores níveis de transcritos do gene não interferem na capacidade proliferativa celular. Além disso, avaliamos o potencial de diferenciação óssea in vitro, mostrando que menores níveis de TCOF1 também não parecem influenciar a capacidade de diferenciação celular. Apesar de ainda não termos identificado um fenótipo celular, a deficiência de TCOF1 em células não embrionárias resulta na alteração da expressão gênica, já que a análise da expressão genômica das culturas celulares identificou uma série de genes diferencialmente expressos. Ademais, genes de parada do ciclo celular e apoptose com expressão aumentada em células embrionárias de camundongo Tcof1+/- não apresentaram expressão aumentada nas células humanas com mutações patogênicas no TCOF1, sugerindo que a via da p53 não está ativa nestas células não embrionárias. Dentre os genes diferencialmente expressos encontrados, o aumento dos transcritos de DAXX nas células-tronco mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 poderia modular as funções da p53 nessas células, constituindo um bom alvo de investigações futuras para a elucidação da função do TCOF1 em células não embrionárias. Os resultados obtidos sugerem que deficiência de TCOF1 em células mesenquimais leva à ativação de outras vias de sinalização, cujo efeito funcional é ainda desconhecido. Quais seriam as funções e em quais vias celulares o TCOF1 agiria, são questões a serem elucidadas a respeito do papel do gene na fase adulta. / In this work we tried to outline the effects of functional and gene expression of pathogenic mutations in the gene TCOF1 in non-embryonic cells. From the establishment of facial periosteum derived cell culture of four patients with Treacher Collins syndrome (TCS), we obtained cell populations that are more than 95% positive for mesenchymal origin characteristic antigens. We demonstrated that mesenchymal stem cells and fibroblasts from patients with TCS showed reduction of approximately 31% in the TCOF1 expression when compared to controls. This reduction was consistent with the decrease in the expression of transcripts carrying the pathogenic mutations observed when sequencing the cDNA of the patients. Therefore, these results suggest that degradation of the mutated transcript occurs and it may possibly be governed by the mechanism of non-sense mediated mRNA decay (NMD), thus corroborating the Treacle haploinsufficiency model. As the peak of TCOF1 gene expression is detected during the embryonic stage of the formation of neural crest cells and Tcof1+/- mice embryos had shown reduction of neuroepithelium cells proliferation rate, we tested if there is a change in proliferative capacity of adult mesenchymal cells with mutations in TCOF1. The analysis of the growth rate of TCS patients cells was similar to normal controls, indicating that lower levels of transcripts of the gene does not interfere with cellular proliferative capacity. Furthermore, we evaluated the bone differentiation potential of these cells in vitro, showing that lower levels of TCOF1 also seem does not influence cell differentiation ability. Although a cellular phenotype has not yet been identified, deficiency of TCOF1 in non-embryonic cells results in gene expression change, since genomic analysis of the expression of cell cultures identified a number of differentially expressed genes. Furthermore, arresting cell cycle and apoptosis related genes with increased expression in embryonic cells of Tcof1+/- mice showed no increased expression in human cells with pathogenic mutations in TCOF1 suggesting that the p53 pathway is not active in these non-embryonic cells. Among the differentially expressed genes found, the increase of DAXX transcripts in mesenchymal stem cells with pathogenic mutations in TCOF1 could modulate the function of p53 in these cells, providing a good target for future investigations to elucidate the function of TCOF1 in non-embryonic cells. The results suggest that deficiency of TCOF1 in mesenchymal cells leads to activation of other signaling pathways, whose functional effects are still unknown. The functions and cellular pathways in which the TCOF1 act, are issues yet to be elucidated concerning the role of the gene during adulthood.

A síndrome de Treacher Collins (STC) é um distúrbio do desenvolvimento craniofacial de herança autossômica dominante causada por mutações no gene TCOF1, localizado no cromossomo 5 (5q32). Utilizando as técnicas de SSCP e seqüenciamento, estabelecemos um método eficiente para a detecção de mutações no gene TCOF1, o que permitiu oferecer o teste diagnóstico aos pacientes com suspeita clínica de STC. Identificamos a mutação responsável pela síndrome em 39/43 (90,7%) dos pacientes atendidos pelo Centro de Estudos do Genoma Humano e em 23/48 (48%) dos pacientes encaminhados pelo Johns Hopkins Medical Institute. Desse modo, caracterizamos 43 novas mutações patogênicas e 16 novos polimorfismos no gene TCOF1. A detecção de uma troca de aminoácido de caráter patogênica em uma região conservada da proteína nos levou a propor a existência de um domínio funcional importante nessa região. Realizamos triagem de mutações no gene TCOF1 em 24 pacientes com anomalias faciais em estruturas derivadas do 1o e 2o arcos branquiais, mas sem diagnóstico de STC. Nenhuma mutação patogênica foi encontrada nesses casos, indicando que a STC, apesar de apresentar uma grande variabilidade clínica, é uma entidade circunscrita. Triamos também, pela primeira vez, duas famílias cujo padrão de segregação do quadro clínico sugere um padrão de herança autossômico recessivo. Também nesse caso não encontramos mutação no gene TCOF1, apesar de uma análise de segregação com marcadores da região 5q31-q34 não ter excluído essa região de uma possível relação com a síndrome. Testamos, empregando pela primeria vez ferramentas moleculares, a hipótese que as mutações esporádicas que causam a STC têm origem preferencial na linhagem germinativa de homens mais velhos. Ao contrário do sugerido pela literatura, em dez casos informativos encontramos 70% das mutações no cromossomo herdado do pai e 30% de origem materna e nenhuma correlação com aumento de idade paterna. / Treacher Collins syndrome (TCS) is an autosomal dominant disorder affecting craniofacial development. The syndrome is caused by mutations in the TCOF1 gene, located in chromosome 5 (5q32). Combining SSCP and sequencing, we established an efficient method of screening for mutations in the TCOF1 gene, allowing us to offer diagnostic tests to patients with clinical signs of TCS. We detected a pathogenic mutation in 39/43 (90.7%) of patients ascertained at the Centro de Estudos do Genoma Humano and in 23/48 (48%) of patients referred to Johns Hopkins Medical Institute. We therefore characterized 43 novel pathogenic mutations and 16 novel polymorphisms in the TCOF1 gene. We described a pathogenic missense mutation located in a conserved region of the protein, which led us to propose the existence of a critical function domain in its N-terminus. After screening 24 patients with craniofacial anomalies resembling TCS but without a precise clinical diagnosis for mutations in the TCOF1 gene, we found no pathogenic mutation and concluded that, despite its broad clinical spectrum, TCS is well characterized in clinical grounds. We also screened, for the first time, two families in which the segregation of the phenotype suggested autosomal recessive inheritance. No mutation was detected in these families, despite linkage analysis with markers from 5q31-34 not excluding this region. We used molecular techniques for the first time to test the hypothesis that sporadic mutations in TCS arise preferentially in the male germ line and their frequency increases with age. As opposed to what the literature suggested, in ten informative cases we had 7 mutations of paternal origin and 3 originating in the female germ line, with no detectable age effect.

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