Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (σE) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (σE) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (σE) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (σE) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.

A Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema e é o agente responsável por doenças em plantas cultivadas. No Brasil, a principal doença causada por esta bactéria é a CVC (Clorose Variegada dos Citros), a qual traz grandes prejuízos à produção de laranja dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Apesar do atual controle da doença, ainda não se desenvolveu um método específico para o controle da bactéria. Durante a interação planta-patógeno ocorre uma geração exacerbada de oxidantes por parte do hospedeiro, na tentativa de eliminar o patógeno de seu organismo. Dessa forma, os patógenos são expostos a hidroperóxidos derivados de ácidos graxos, formados a partir da ação de lipoxigenases ou ainda pela reação direta de lipídeos com espécies oxidantes. Durante o processo evolutivo, foram selecionados mecanismos de defesa contra estas espécies oxidantes por parte dos patógenos. Dentre estes mecanismos, encontra-se a enzima Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein), uma peroxidase baseada em resíduos de cisteínas, dependente de grupos lipoil e que possui alta atividade frente à hidroperóxidos orgânicos. Esta proteína provavelmente atua na proteção da célula bacteriana e possui algumas particularidades que fazem dela um alvo em potencial para o desenvolvimento de drogas. Os objetivos deste projeto foram caracterizar possíveis substratos fisiológicos de Ohr de X. fastidiosa, e ainda, buscar moléculas capazes de inibir a atividade peroxidásica desta enzima. Inicialmente demonstramos que Ohr é capaz de reduzir hidroperóxidos de ácido graxo com alta eficiência (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1)e, além disso, estes hidroperóxidos são capazes de inativar Ohr em um processo dose dependente, provavelmente devido à alta afinidade entre estes e a enzima. Porém, a enzima não apresentou atividade frente à hidroperóxido de fosfolipídeo (fosfatidilcolina) e hidroperóxido de colesterol. Ademais, elucidamos a estrutura de Ohr na conformação oxidada (ponte dissulfeto), auxiliando no entendimento da dinâmica do ciclo catalítico da enzima. Por fim, selecionamos um composto capaz de inibir a atividade peroxidásica de Ohr in vitro, e temos indícios de que este é capaz de afetar o crescimento bacteriano em situação de estresse oxidativo. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium that colonizes the xylem and is the causative agent for several plant diseases. In Brazil, the main disease caused by this bacterium is the CVC (Citrus Variegated Chlorosis), which provokes large losses to the orange production in São Paulo and Minas Gerais states. Despite the current disease control, it has not been yet developed a specific method to eliminate the bacterium. During the plant-pathogen interactions, hosts produce an exacerbated amount of oxidants, in an attempt to eliminate the pathogen. Among them, fatty acids hydroperoxides are formed by the lipoxygenase action or even by the direct reaction between lipids and oxidant species. During the evolutionary process, pathogen defense mechanisms against oxidative species have evolved. Among them, Ohr (Organic Hydroperoxide Resistance protein) that is a Cys-based, lipoyl dependent peroxidase, displaying high activity towards organic hydroperoxides. This protein probably plays a central role in oxidative stress response and presnts some particularities, which make it a potential target for drug design. The objectives of this project were to characterize possible physiological substrates of Ohr from X. fastidiosa and search for molecules capable of inhibiting its peroxidase activity. Initially, we demonstrated that Ohr reduced fatty acid hydroperoxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1). Moreover, these hydroperoxides inactivated Ohr in a dose-dependent manner, probably due to the high affinity between them and the enzyme. However, the enzyme did not display any activity towards phospholipids (posphatidilcholine) hydroperoxides and cholesterol hydroperoxide. Besides, we elucidated the structure of Ohr in the oxidized form (disulfide bond), which gave us insights on the dynamics of structural elements in the catalytic site. Ultimately, we identified a compound that was able to inhibit the peroxidase activity of Ohr in vitro, and we gained evidences that this compound can affect the bacterial growth under oxidative stress.