Einleitung: Jeder sechste Mann und jede siebte Frau in der westlichen Welt werden am Myokardinfarkt und seinen Folgepathologien sterben. Nach einem Infarkt ist das Herz nicht fähig die nekrotisierten Kardiomyozyten zu regenerieren, es findet lediglich eine Defektheilung statt. Das entstehende Platzhaltergewebe besteht aus Bindegewebe und ist Ziel fortlaufender Heilungs- und Umbauprozesse. Ob diese in einer stabilen funktionalen Narbe oder in einem Herzwandaneurysma mit sich verschlechternder Herzfunktion enden, hängt im Wesentlichen von dem physiologischen Abschluss des Entzündungsprozesses ab. Den ersten Schritt der Heilung stellt die sterile Entzündung dar, welche durch Proteolyse und Phagozytose die strukturelle Grundlage für die Proliferation des Narbengewebes schafft. Doch auch in späteren Heilungsphasen steuern immunologische Prozesse den regenerativen Ablauf und kommen im besten Fall mit der Ausheilung der Narbe zum Erliegen. Es kann allerdings auch zu einem pathologischen Persistieren dieser Entzündungsantwort kommen, was meist zu einer chronischen Verschlechterung der Organfunktion führt. In welche Richtung sich diese Entzündungsantwort entwickelt, scheint maßgeblich von der Art der Reaktivität des adaptiven Immunsystems auf das ausheilende Gewebe abzuhängen. Nachdem Autoimmunität lange Zeit nur in ihrem pathologischen Kontext untersucht wurde, zeigten mehrere Wundheilungsmodelle die notwendige Beteiligung des adaptiven Immunsystems für eine physiologische Regeneration. Dabei reagieren heilungsförderliche Lymphozyten auf gewebespezifische Autoantigene. Dies zeigte sich auch durch die Aktivierung regulatorischer T-Helfer-Zellen nach einem experimentellen Myokardinfarkt (EMI) in Mäusen, die ihrerseits myokardiale Entzündungsprozesse, Heilung und Remodeling positiv modulieren. Ein Autoantigen, welches in diesem Kontext diskutiert wird, ist das Kardiomyosin. Es wird ausschließlich herzrestriktiv exprimiert und ist in der Lage immunstimulierend zu wirken. Ziele der Untersuchung: In der vorliegenden Arbeit wurde die Relevanz der Antigenspezifität bezüglich Kardiomyosin in immunologischen Heilungsprozessen untersucht. Dabei wurde im Speziellen auf die Beeinflussung der T-Zell-Reaktivität durch das Milieu des infarzierten Herzens eingegangen. Tiere, Material und Methoden: Es wurden Kardiomyosin-spezifische Thy1.1+ CD4+ T- Helfer-Zellen (TCR-M) in gesunde Thy1.2+ Wildtyp-BALB/c- und transgene Do11.10- Empfängermäuse transferiert. Einen Tag später wurde durch die Ligatur eines Herzkranzgefäßes ein permanenter Infarkt ausgelöst. An Tag 7 post operationem wurden die Qualität des Heilungsvorganges und die Herzfunktion mittels Echokardiographie beurteilt. An Tag 7 und 49 post operationem wurden die Organe (Herz, Mediastinallymphknoten, Kniefaltenlymphknoten und Milz) entnommen und das T-Zellkompartiment, sowie dessen organspezifische Abundanz mittels Durchflusszytometrie und Light-Sheet Flourescence Microscopy (LSFM) charakterisiert. Die Experimente wurden mit 3-23 Mäusen pro Gruppe jeweils 2-5 Mal unabhängig voneinander durchgeführt. Für die statischen Analysen wurden die Mittelwerte der Variablen mittels ungepaarter t-Tests (Vergleich zweier Mittelwerte) oder two-way ANOVA gefolgt durch die Šidák Korrektur (Vergleich von mehr als zwei Mittelwerten) verglichen. Wahrscheinlichkeitswerte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Ergebnisse: Durchflusszytometrie und LSFM Analysen stellten eine erhöhte Akkumulation und Aktivierung der TCR-M in Herzen infarzierter Mäuse zur Hochphase des Heilungsprozesses (Tag 7) im Vergleich zur Sham-Gruppe (Kontroll-operierte Mäusen ohne Infarkt) dar. Dieses Phänomen konnte nicht an anderen untersuchten Orten im Körper (Milz, Kniefaltenlymphknoten) festgestellt werden. In den Mediastinallymphknoten kam es sowohl unter Kontroll-, als auch Infarktbedingungen zu einer Akkumulation und Aktivierung der TCR-M, was auf konstitutiv ablaufende autoimmune Prozesse hindeutet. In der chronischen Heilungsphase (Tag 49) verteilte sich diese Zellpopulation gleichmäßig auf die untersuchten Organe, was für eine selbstlimitierende Autoreaktivität post-EMI der T-Zellen spricht. Bemerkenswerterweise differenzierten transferierte TCR-M, die in ihren Spendertieren pathogen wirken und eine letale Autoimmunmyokarditis auslösen, in infarzierten Mäusen zu regulatorischen T-Zellen. Dort agieren sie kardioprotektiv, was letztendlich zum Erhalt der echokardiographisch erhobenen Herzfunktionsparameter führte. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Evidenz für die ursächliche Rolle des herzspezifischen Antigens Kardiomyosin in der postinfarziellen T-Zell-Reaktivität. Weiterhin wird der determinierende Einfluss des Infarktkontextes unabhängig von Antigenspezifität demonstriert. Dieser polarisiert T-Helfer-Zellen in ihrer Funktion zu regulatorischen T-Zellen und führt zu einer protektiven und heilungsförderlichen Autoimmunantwort.
:1. Einleitung - 1 2. Literaturübersicht und Zielstellung - 3 2.1. Der Myokardinfarkt - 3 2.2. Pathophysiologie des Myokardinfarktes - 4 2.3. T-Zellen - 10 2.3.1. Die funktionelle Rolle der T-Zellen - 10 2.3.2. Konventionelle T-Zellen - 11 2.3.3. Regulatorische T-Zellen - 14 2.3.4. Der T-Zell-Rezeptorkomplex - 16 2.3.5. Genesis und Toleranz des T-Zell Kompartiments - 19 2.3.6. T-Zellen im Myokardinfarkt - 22 2.4. Antigenspezifität und Autoimmunität im Myokardinfarkt - 23 2.5. Zielstellung der Studie - 24 3. Material und Methoden - 25 3.1. Versuchsaufbau - 25 3.2. Versuchstiere - 25 3.3. Organentnahmen - 26 3.4. Adoptiver CD4+ T-Zell Transfer - 26 3.5. Fluorescence-Activated Cell Sorting - 27 3.6. Experimenteller Herzinfarkt - 31 3.7. Echokardiographie - 33 3.8. Light-Sheet Fluorescence Microscopy - 35 3.9. Statistische Analysen - 35 4. Ergebnisse - 36 4.1. TCR-M Akkumulation post-EMI in med-LN und Herz - 36 4.2. TCR-M Aktivierung und Differenzierung zu Tregs post-EMI - 40 4.3. Kardioprotektion post-EMI durch TCR-M in DO11.10-Empfängertieren - 43 5. Diskussion - 46 5.1. Wahl des Kandidatenantigens - 46 5.2. Kritische Betrachtung der Analysemethoden - 47 5.3. Interpretation der Daten - 48 5.4. Vergleich der Tiermodelle - 52 5.5. Vergleich der chirurgischen Modelle - 53 5.6. Belastungseinschätzung - 54 6. Zusammenfassung - 56 7. Summary - 58 8. Literaturverzeichnis - 60 9. Danksagung - 74

Das Nutzen von 3D-Anmerkungselementen unter PTC Creo-Parametric ermöglicht die Erstellung von 3D-CAD-Modellen mit ausführlichen Informationen zu Funktion, Tolerierung und Fertigung. Dadurch kann der Archivierungs- und Versionspflegeaufwand von Produktdaten und ein besseres, räumliches Verständnis für das Produkt in seiner Entstehungsphase erreicht werden.

Produkte werden in ihrem Lebenszyklus verschiedenartig strukturmechanisch belastet. Die Folge ist eine Verformung aufgrund dieser Belastung und die mangelnde Formhaltigkeit. Die Frage ist, welche Toleranzen sollen die mangelnde Formhaltigkeit einschließen oder gar ausgleichen? Eine Toleranz gibt vor, in welcher Maßabweichung ein Maß gefertigt werden darf, um die Produktanforderungen zu erfüllen. Der Fertigungsprozess muss innerhalb der Toleranzangabe fertigen. Mit Creo Simulate kann eine Toleranzkette simuliert werden. In diesem Vortrag wird ein grundsätzlicher Simulationsansatz für die Toleranzanalyse innerhalb der FEM beschrieben und findet eine Ergänzung mit der Toleranzsoftware CETOL 6σ.

Germany is presently transforming into a modern immigration state, leaving behind its image of a “guest worker” country. Parallely, it is confronted with growing religious plurality and rising religious conflicts. Moreover, religious labeling of groups other than the Christian or undenominational majority population becomes more significant. Against this background, the paper discusses the views of the population in Germany towards religious plurality, practices of religious minorities as well as attitudes towards members of different religious groups. The results reveal a considerable amount of negative attitudes towards foreign religious groups in Germany. More specifically, Islam and Muslims are mostly viewed as negative by the German population. Structural equation models with manifest variables show that, in particular, the frequency of contacts have positive impacts on attitudes towards people of different religious affiliations.

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit T-Helferzellen und ihren Interaktionen mit Gewebszellen, wie sie im gesunden Organismus und in Autoimmunerkrankungen auftreten. Es werden Fragen der Toleranzinduktion durch orale Gabe von Antigenen, speziell der oralen Verabreichung von Collagen II bei Patienten mit rheumatoider Arthritis diskutiert. Eine Immundeviation als Mittel, inflammatorische Th1-Zellantworten in anti-inflammatorische Th2-Zellantworten zu verwandeln, kann durch Eingriffe in die T-Zell-Signaltransduktion erreicht werden. Es werden neue Ansätze zu Mechanismen diskutiert, die das Immunprivileg des Zentralnervensystems gewährleisten. Die hirnresidenten Immunzellen, zu denen Mikrogliazellen und Astrozyten zählen, besitzen Eigenschaften, die eine Entzündung unwahrscheinlich machen. Sie müssen aktiviert werden, um Antigene präsentieren zu können. In organtypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen konnte gezeigt werden, dass Mikrogliazellen durch Th1-Zellen aktiviert, von Th2-Zellen hingegen deaktiviert werden. Die Möglichkeit, dass die Costimulation über CD80 oder CD86 differentielle Effekte auf den Charakter der Immunantwort hat, wird diskutiert. Der Einfluß von pro-inflammatorischen Zytokinen auf Mikrogliaaktivierung und den Erhalt von Nervenfasern wurde ebenfalls in Hirnschnittkulturen untersucht. Astrozyten sind wesentlicher Bestandteil der Blut-Hirn-Schranke. Diese kann jedoch von aktivierten T-Zellen überwunden werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Astrozyten über eine Expression von CD95L in aktivierten T-Zellen Apoptose induzieren können. Davon sind jedoch nicht alle T-Zellen betroffen. Andererseits wird eine T-Zellproliferation unterdrückt, indem T-Zellen unter Astrozyteneinfluß verstärkt CTLA-4 exprimieren, was einen Zellzyklusarrest zur Folge hat. Darüber hinaus ist eine verstärkte Produktion von Nervenwachstumfaktor (NGF; nerve growth factor) nach antigenspezifischer Interaktion von Astrozyten mit Th1- und Th2-Zellen als zusätzliches Mittel, eine Neuroinflammation einzudämmen, anzusehen. Die Arbeit stellt diese Ergebnisse in fünf Kapiteln dar, welche gleichzeitig eine Einführung in die als Anlagen enthaltenen zehn Publikationen geben. / This thesis deals with T helper cells and their interactions with tissue cells as they occur in the healthy organism and in autoimmune diseases. Questions of tolerance induction by oral application of antigens are discussed especially oral treatment with type II collagen in patients with rheumatoid arthritis. In order to transform inflammatory Th1 responses into anti-inflammatory Th2 responses, immune deviation can be reached by interference with T-cell signal transduction. New approaches towards the different ways that the immune privilege of the central nervous system is maintained are discussed. The resident immune cells, i.e. microglia and astrocytes possess properties that make inflammation unlikely. They have to be activated in order to present antigens. It has been shown in organotypic entorhinal-hippocampal slice cultures that Th1 cells activate whereas Th2 cells deactivate microglial cells. The possibility is discussed as to whether costimulation via CD80 or CD86 differentially influences the character of the immune response. The influence of pro-inflammatory cytokines on microglial activation and preservation of nerve fibers has also been studied in brain slice cultures. Astrocytes are an essential part of the blood-brain barrier, which can be crossed by activated T cells. The thesis shows that astrocytes can induce apoptosis in activated T cells via expression of CD95L. However, not all T cells are affected. T cell proliferation is suppressed by increased CTLA-4 expression in T cells under the influence of astrocytes, resulting in a cell cycle arrest. An additional mechanism of confining neuroinflammation is increased production of the nerve growth factor (NGF) following antigen-specific interaction of astrocytes and Th1 and Th2 cells, respectively. These results are presented in five chapters that also introduce the ten attached publications.

Während der letzten 10 Jahre, wurden viele neue immunsuppremierende Medikamente für die Verbesserung des Kurzzeit-Transplantationsergebnisses entwickelt (Halbwertzeit bzw. Abstoßung einer Niere nach ca. 10-12 Jahren). Das heutige therapeutische Ziel besteht auf der einen Seite aus der Minimierung der Kosten bzw. der Minimierung der Nebenwirkungen verursacht durch die Immunsuppressiva und auf der anderen Seite der Verbesserung des Langzeit-Überleben eines Transplantates. Um eine dosis-abhängige Zerstörung des Transplantates durch die Immunsuppressiva zu vermeiden, bedarf es der spezifischen Entwicklung von zusätzlichen Toleranzprotokollen. Ein Top-Kandidat für die Toleranzinduktion in Transplantationen stellen die CD4+CD25high regulatorischen T Zellen dar. Da humane regulatorische T Zellen jedoch nur 1-2 % der peripheren CD4+ T Zellen repräsentieren, ist es nicht möglich ausreichende Zellmengen auf zu reinigen. Dazu ist die Etablierung adäquater Protokolle für die Isolation und ex vivo Expansion von CD4+CD25high Treg’s notwendig. In unserem System ist es uns möglich die CD4+CD25high zellen mit einer sehr hohen Reinheit zu isolieren ( ca. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Danach werden die isolierten Treg’s mit verschiedenen Protokollen, wie der Expansion mit CD2-,CD3- und CD28 Expansionbeads oder allogenen Feederzellen, expandiert. Das suppressive Potential der expandierten CD4+CD25+ Treg’s wurde in drei funktionellen Assays, einem CFSE-basierenden Proliferationsassay, einem Cytokin-Bead-Array und einem Elispot bestimmt. Basierend auf den genannten Methoden wurde das Proliferationspotential allogen stimulierter Responder T Zellen, die IFNg Produktion und das Th1/TH2 Cytokinprofil in einer gemischten Lymphozytenreaktion mit unterschiedlichen Mengen der expandierten Treg’s untersucht Ein weiterer Aspekt dieses Projektes ist die Expansion isolierter regulatorischer T Zellen mit zusätzlichem Rapamycin. Das immunsuppremierende Medikament Rapamycin blockiert die Il2-abhängige T Zellproliferation durch die Inhibition von mTOR und induziert die Expansion regulatorischer T Zellen. / During the last decade, a broad set of immunosuppressive drugs has been developed which improve short-term transplant results (1yr survival, acute graft rejection), but not long-term results (graft half life, e.g. kidney rejection after approx. 10-12 years). In this regard, the therapeutic aim is to minimise costs and long-term side effects caused by immunosuppressive drugs on the one hand, and on the other to considerably improve the long term survival of transplanted patients. To avoid dose-dependent damage of the transplant by immunosuppressive drugs, a specific development of additional tolerance protocols is mandatory. One top candidate for the tolerance induction in transplantation is the population of CD4+CD25high regulatory T cells (Treg’s). Because Tregs constitute 1-2% of peripheral CD4+ T cells in human, it may not be possible to purify sufficient cells ex vivo. Therefore it is necessary to establish appropriate protocols for isolation and expansion of CD4+CD25high Treg’s. In our system we are able to isolate CD4+CD25high cells with a very high purity (approx. 80% CD4+CD25highFoxp3+). Afterwards we expand the isolated Treg’s by different expansion protocolls such as expansion with CD3-, CD2- and CD28-expansionsbeads as well as allogeneic feedercells. The suppressive potential of the expanded CD4+CD25+ Treg’s was determined by three different functional assays, a CFSE-based proliferationassay, a Cytokine-Bead-Array, and an IFNGamma-Elispot. Based on mentioned methods, the proliferative potential of allogenic stimulated responder T cells, IFNGamma production and Th1/Th2 cytokine profile, as well as the IFNGamma producing T-cells in a mixed lymphocyte reaction with different amounts of the expanded regulatory T cells were tested. Another aspect of our project is the expansion of the isolated regulatory T cells with additional rapamycin. The immunosuppressive drug rapamycin is a powerful pharmacological agent which blocks IL2-dependent T cell proliferation by accumulation with mTOR and induces expansion of regulatory T cells.

Das grundlegende Problem in der Transplantationsimmunologie ist es, die Langzeitakzeptanz eines fremden (allogen) Organs zu erreichen, ohne die sonstige Immunkompetenz des Empfängers zu beeinträchtigen. Die Induktion einer solchen spenderspezifischen Toleranz würde eine Alternative zum Langzeiteinsatz von Immunsuppressiva darstellen. Deswegen versucht man, während der Transplantation die Aktivierung der für die Abstoßung entscheidenden T-Helferzellen zu unterdrücken, bis eine Akzeptanz des Spenderorgans etabliert ist. Wichtig für eine Aktivierung der T-Zellen ist das für alle T-Helferzellen typische Zelloberflächenmolekül CD4. Antikörper gegen CD4 können in Tiermodellen eine Transplantattoleranz induzieren. Ein besonderes Interesse gilt der Charakterisierung der genauen Mechanismen dieser induzierten Transplantatakzeptanz, da diese noch wenig verstanden sind. Der von uns verwendete nicht-depletierende Maus-anti-Ratten-CD4mAk (RIB5/2) besitzt im allogenen Nierentransplantationsmodell der Ratte eine hohe toleranzinduzierende Wirkung und erzielt eine permanente Transplantatakzeptanz bei >80% der Empfängertiere. In dieser Arbeit wurde versucht, die Effekte dieses monoklonalen Antikörpers auf die T-Zellaktivierung näher zu untersuchen. Ausdruck der blockierten T-Zellaktivierung ist eine verminderte T-Zell-Proliferation und die Reduzierung der Synthese von TH-1-Effektorzytokinen, welche eine zelluläre Immunantwort fördern. Zu diesen für die Abstoßung gefährlichen Th-1-Effektorzytokinen gehören Interleukin 2 (=IL-2, Hauptwachstumsfaktor aktivierter T-Zellen) und Interferon gamma (=IFNgamma, wichtiger Aktivator von APC''s). Während die IL-2 Produktion vollständig verhindert wird, ist die Alloantigen-induzierte IFNgamma mRNA Expression nicht reduziert. Allerdings kommt es unter dem Einfluss des Antikörpers nicht zur IFNgamma Proteinsekretion. Wird jedoch das fehlende IL-2 ersetzt, kann sowohl die defekte Proliferation als auch die posttranskriptionelle Blockade der IFNgamma Produktion wieder aufgehoben werden. Das spiegelt sich auch in vivo wieder, da rekombinantes IL-2 auch hier den Toleranzstatus brechen kann. In dieser Arbeit konnte ein Kandidat dieser IFNgamma Translationskontrolle ermittelt werden. Zusätzlich wurde das Kochaperon p23, Teil eines Hsp90-Komplexes, in unsere Untersuchungen miteinbezogen, da es als ein differentiell reguliertes Gen in allogenen und anti-CD4mAk-behandelten T-Zellen identifiziert wurde. Hsp90 stabilisiert z.B. Kinasen, die wichtige Mediatoren der Signaltransduktion sind. p23 könnte aufgrund seiner Funktion als Kofaktor von Hsp90 an der Regulierung dieser Kinasen beteiligt sein, ist jedoch bisher kaum im Zusammenhang mit T-Zellaktivierung analysiert worden. Meine Untersuchungen ergaben, dass die p23 Expression ebenfalls durch den anti-CD4mAk reduziert wird. Da die Proliferation/p23 und die IFNgamma Synthese IL-2-abhängig reguliert werden, wurden IL-2-induzierte Signalwege auf ihre Relevanz für Proliferation und IFNgamma Regulation hin untersucht. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der anti-CD4mAk-Behandlung auf die T-Zellaktivierung soll mit dazu beitragen, Grundlagen für ein besseres Verständnis des Abstoßungsprozesses und damit Transplantatfunktions-Monitoring zu schaffen. / The major problem in transplantation immunology is the development of long-term donor-specific nonresponsiveness without reduction of the normal recipient immunocompetence. A tolerant state would obviate the need for continuing immunosuppressive therapy. One level of immunosuppression for inducing graft acceptance involves antibodies specific for T-cells of the recipient leading to donorspecific tolerance (e.g. by using of anti-CD4 monoclonal antibodies = aCD4mAb). CD4+ T cells play a predominant role in the cascade of immune processes following transplantation of foreign tissues. The anti-rat CD4 mAb RIB5/2 is very potent in inducing allo-specific tolerance to renal and heart allografts in rat recipients. Here I investigated the molecular mechanisms underlying anti-CD4 antibody mediated inhibition of allo-specific T cell activation and how this is antagonised by exogenous IL-2. IL-2 acts as growth factor for antigen-activated T cells by inducing the expression of cell cycle proteins and also enhances the expression of cytokines, e.g. IFNgamma in T cells. IFNgamma profoundly affects a variety of immune responses, including activation of antigen presenting cells. Anti-CD4 treatment, in vivo and in vitro, completely abrogated IL-2 production by alloreactive T cells. In contrast, anti-CD4 treated allo-activated T cells showed similar IFNgamma mRNA expression as untreated allo-activated T cells, but did not secrete any protein. Thus, the anti-CD4 antibody cannot prevent IFNgamma mRNA expression but is interfering with posttranscriptional mechanisms controlling IFNgamma production during allo-activation of T cells. The investigations revealed a candidate of these IFNgamma translation control. Additionally I investigated the heat shock protein 90 (Hsp90)-associated cochaperone p23. p23 upregulation during T cell activation is also abrogated by anti-CD4 treatment. Hsp90 chaperoning is critical for proper folding, stabilization and trafficking of a number of cellular signaling proteins as e.g. kinases. Hsp90-kinase complexes play an important role in T-cell signal transduction and little is known about the importance or even regulation of Hsp90-cochaperones like p23 during T-cell activation. I analysed the regulation of p23 and downstream effects on different kinases involved in T-cell signaling. These findings are supposed to contribute to a better understanding of the mechanisms underlying tolerance induction.

Einleitung: CTLA-4Ig blockiert CD28-vermittelte co-stimulatorische Signale und inhibiert kompetitiv in vitro und in vivo immunologische Reaktionen. Der signifikante immunsuppressive Effekt von CTLA4-IG konnte in verschiedenen tierexperimentellen Untersuchungen zur Entwicklung von Toleranz nach Organtransplantation aufgezeigt werden. Allerdings waren die Ergebnisse nach CTLA-4Ig Therapie in den nachfolgenden Untersuchungen variable und ein Großteil der transplantierten Organe wurde letztendlich abgestoßen. Neuere Studien zeigen das die Effizienz der CTLA-4Ig Therapie von dem Zeitpunkt der Gabe abhängen. Weiterhin gibt es Anhalte dafür, daß dieser Effekt durch spenderabgeleitete Transfusionen noch verstärkt werden kann. Für uns stellte sich daher die Frage ob durch die Kombination von CTLA-4IG und Applikation spenderabgeleiteter Splenozyten ein additiver immunsuppressiver Effekt zu erreichen ist und untersuchten dies im Modell der Rattenlebertransplantation (ORLT). Methodik: Wir führten Rattenlebertransplantationen (ORLT) im arterialisierten, voll allogenen Modell Da (RT1a) auf Lew (RT1l) in Standardtechnik durch. Die Ratten erhielten in verschiedenen Gruppen vor/nach der Transplantation CTLA-4Ig oder die Kombination von CTLA-4Ig mit spenderabgeleiteten oder unspezifischen Milzzellen. Ergebnisse: Bei der Vorbehandlung der Empfänger, entweder mit spenderabgeleiteten Zellen oder CTLA-4Ig, ließ sich eine Verbesserung des Transplantatüberlebens, aber keine Langzeitakzeptanz des Transplantates erreichen. Erst die Kombinationstherapie vor der Transplantation gewährleistete ein langfristiges Organüberleben ohne Zeichen für chronische Rejektionen nach mehr als 150 Tagen. Die Therapie mit spenderabgeleiteten Zellen am Tag der Transplantation oder verzögert nach 4 Tagen nach Transplantation veränderte die Überlebenszahlen nicht. Die verzögerte postoperative Therapie mit CTLA-4Ig, wie sie auch von anderen Gruppen durchgeführt wurde, resultierte in unseren Versuchen in einem verlängertem Überleben, führte aber nur bei 2/7 Tieren zur langfristigen Transplantatakzeptanz. Die zusätzliche Applikation nicht abgeleiteter Milzzellen verbesserte die Ergebnisse nicht signifikant. Transplantatakzeptanz bei allen Tieren ließ sich wiederum nur durch die Kombination spenderabgeleiteter Zellen und CTLA-4Ig erreichen. Spenderabgeleiteter Mikrochimärismus trat bei allen Tieren, also auch bei Kontrolltieren trotz ablaufender Abstoßung am 6. POD nach ORLT auf. Am 12. POD zeigten tolerante Gruppen noch spenderabgeleitete Zellen, wohingegen diese bei abstoßenden Gruppen nicht mehr nachweisbar waren. Im Langzeitverlauf waren diese spenderabgeleiteten Zellen auch in toleranten Tieren nur noch vereinzelt nachzuweisen. Eine Verschiebung der Zytokinantwort von TH1- Richtung TH2-Zytokinen konnte bei langfristig überlebenden Tieren nicht aufgezeigt werden. Im Gegenteil, die TH1-Antwort mit INF-g und IL-12b war bei toleranten, kombiniert mit CTLA-4Ig und adoptivem Zelltransfer behandelten Ratten früher und stärker ausgeprägt, aber schneller wieder rückläufig als bei unbehandelten Kontrollen. Dies galt nicht für IL-2, das in allen Gruppen, die mit CTLA-4Ig behandelt wurden, stark unterdrückt war. Langfristig überlebende Tiere zeigten mehr als 150 Tage nach ORLT nahezu keine Expression dieser TH1-Zytokine mehr, wohingegen IL-4 deutlich exprimiert wurde. Dies spricht gegen eine ausschließliche Verschiebung der Zytokinantwort nach TH2 und betont die Bedeutung von TH1-Zytokinen in der initialen Phase der Toleranzentwicklung. In toleranten Tieren mit adoptivem Zelltransfer zeigte sich im Vergleich zu abstoßenden Tieren eine stärkere Ausprägung von Apoptose in den Transplantaten, die zeitlich parallel zu der mRNA-Expression der TH1-Zytokine verlief. Dies läßt darauf schließen, daß Apoptose aktivierter T-Zellen der Mechanismus ist, der die additiven Effekte der CTLA-4Ig-Behandlung und des adoptiven Zelltransfers vermittelt. Die CTLA4-Ig Behandlung verhindert effektiv Abstoßungsepisoden nach ORLT. Die Effizienz der Behandlung kann durch die Applikation von spenderabgeleiteten Zellen noch signifikant verbessert werden. Hierbei spielt die Herunterregulation von IL-2 und Hochregulierung von INF-g eine maßgebliche Rolle, wohingegen der spenderabgeleitete Chimärismus von nachgeordneter Rolle zu sein scheint. Parallel zu dem Nachweis von IFN-g finden sich mehr apoptotische Zellen am Tag 6 in den Transplantaten der später toleranten Ratten, verglichen mit den abstoßenden Kontrolltieren. Dies weist in diesem Modell, im Gegensatz zu anderen Theorien, auf einen immunaktivierten Mechanismus mit nachfolgender Apoptose aktivierter Lymphozyten hin / Blockage of co-stimulatory CD28-mediated signals by CTLA4-Ig inhibits in vitro and in vivo immune responses. However, in recent trials monotherapy with CTLA4-Ig failed to introduce long-term survival in several animal transplant models. The study was conducted to investigate the effectiveness of CTLA-4Ig treatment with additional application of donor splenocytes in preventing rejection and improving graft function in rat liver allografts. DA rats (RT1a) were used as donors and Lew (RT1l) rats as recipients in an orthotopic liver transplantation model (ORLT). Recipients were divided in 3 groups depending on the start of treatment: The first group was treated prior to transplantation with CTLA-4Ig (0.5 mg i.p.) alone or in combination with donor derived or donor unspecific 2.5 x 108 splenocytes. The second group was treated simultaneously at transplantation with CTLA-4Ig or received no further treatment and served as controls. The third group received an ORLT and was treated postoperatively on day 3 and 4 with CTLA4-Ig alone or in combination with donor derived or unspecific spleen cells. Only the combination of CTLA-4Ig and donor derived cells pre- or postoperatively led to a 100% graft survival in the long-term. The treatment with CTLA-4Ig alone at each time point led to prolonged graft survival but not to a long-term graft survival. The additional administration of donor unspecific cells could improve these results, however, the differences were not significantly different between these groups. All rats without any treatment died within 12 days after ORLT. When treating the rats with donor derived spleen cells prior to transplantation the survival was significantly prolonged. The application of donor unspecific cells alone pre- and postoperatively had no effect on the survival rates. Microscopic and macroscopic studies of the liver demonstrated no signs of ongoing rejection after 150 days in rats treated with the combination of CTLA4-Ig and donor derived cells. All other long term survivors demonstrated signs of chronic rejection with bile duct loss. Immunohistological staining for DA specific surface antigen demonstrated donor specific chimerism with no predominance in any group. In the early postoperative course, the expression of IL-2 in liver specimen was significantly reduced in all groups receiving CTLA-4Ig. In contrast to this the tolerant rats surviving long-term showed a marked expression of IFN-g in the early course after ORLT. Additionally, these rats showed on day 6 after ORLT more apoptosis in the liver graft specimens compared to rejecting controls. CTLA4-Ig treatment is highly effective in rat liver transplantation and ensure long term survival. Pretransplant or delayed treatment with CTLA4-Ig alone prolongs survival but does not introduce long term tolerance. The effectiveness of the treatment can be markedly improved by the additional application of donor derived cells. The downregulation of IL-2 is mainly involved in the development of tolerance whereas detection of donor specific chimerism is not correlated to the development of tolerance in our study. Additionally an activation induced cell death via IFN-g may be involved in the tolerance induction. Although the mechanisms are still not completely understood immunomodulation by adaptive cell transfer and costimulatory blockage is an interesting and promising option for the future of clinical liver transplantation.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden T-Lymphozyten verstärkt als Zielzellen für genetische Modifikationen eingesetzt, mit der Absicht vererbbare oder erworbene Krankheiten zu behandeln. Vor kurzem konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass alloantigen-spezifische, genmodifizierte T-Lymphozyten ein enormes Potential besitzen, als Transport- Systeme für therapeutische Gene in allogene Transplantate zu dienen. Diese T-Lymphozyten migrieren und akkumulieren spezifisch in das allogene Transplantat, in welchem es zu einer lokalen und starken T-Zell aktivierungsabhängigen Expression des Transgens kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential von viralem IL-10 als therapeutisches Transgen untersucht. Dazu wurde zunächst in der gemischten Lymphozyten-Kultur (MLR) eine Lewis T-Zelllinie spezifisch für Ratten-DA Alloantigene generiert. Während der MLR wurden die Lymphozyten retroviral transduziert, so dass sie vIL-10 stabil exprimieren. Der Zytokin-Level der TvIL-10-Lymphozyten liegt 48h nach der T-Zellaktivierung zwischen 1-2ng/m. Die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten zeigen einen CD4+CD25+ Phänotyp und sezernieren neben vIL-10 auch Ratten IL-10 und IFN-g aber kein IL-4, ähnlich wie T-regulatorische Zellen Typ 1 (Treg1). Zunächst wurden die vIL-10 transgenen T-Lymphozyten hinsichtlich ihres Potentials untersucht, die alloantigen-spezifische Immunantwort in vitro zu modulieren. Dazu wurden 5% vIL-10 transgener T-Lymphozyten zu einer MLR hinzugegeben. Zuvor wurden die naiven Lewis T-Lymphozyten mit einem Membranfarbstoff markiert, um die Proliferation und die Zytokin-Expression dieser Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu Kontroll-MLRs ohne transgene oder mit EGFP-transgenen Lymphozyten konnte eine signifikante Inhibierung der Proliferation als auch der INF-g Expression von naiven T-Lymphozyten detektiert werden. Trotz dieses großen Potentials in vitro, führte der adoptive Transfer der vIL-10 transgenen Zellen allein oder in Kombination mit Cyclosporin (0,5mg/kg/Tag) nicht zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit im allogenen Herztransplantationsmodell. Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von vIL-10 im Transplantat eines starken Abstoßungsmodells nicht zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führt. Außerdem kann das in vitro gezeigte regulatorische Potential dieser T-Zellen nicht zwangsläufig auf ihr in vivo Potential übertragen werden. / During last two decades T lymphocytes have become key targets for genetic modification in order to treat inherited or acquired human diseases. Recently, we demonstrated the capacity of allospecific gene-engineered T lymphocytes as a transport shuttle for therapeutic transgenes into allografts. These lymphocytes migrate and accumulate specifically in allografts where alloantigen-driven T cell activation strongly enhances local expression of the gene of interest. In this study, the influence of viral IL-10 as a therapeutic transgene was addressed. Lewis T cell lines specific for DA rat alloantigens were generated in a modified mixed lymphocyte reaction protocol (MLR). During MLR, lymphocytes were genetically modified to express vIL-10 using a retroviral gene expression system. The cytokine level in the supernatant of TvIL-10-lymphocytes varied between 1-2 ng/ml 48h after T-cell activation. Like T regulatory 1 (Treg1) cells, vIL-10 transgenic T lymphocytes express the phenotype CD4+25+ and secrete, in addition to vIL-10, rat IL-10 and IFN-g but no IL-4. First we evaluated the potential of vIL-10 transgenic T cell lines to modulate alloantigen-specific immune responses in vitro. Small numbers of TvIL-10-lymphocytes were added to MLR (less than 5%). Naive cells were stained with membrane dyes to trace proliferation and to analyze cytokine expression. In comparison to control MLR with no transgenic cells or equal numbers of TEGFP-lymphocytes, the proliferation as well as the production of IFN-g of naive responder cells were significantly diminished. Despite this regulatory capacity in vitro, the vIL-10 transgenic T lymphocytes were not able, either alone or in combination with suboptimal cyclosporine (0,5mg/kg/day), to prolong the survival of DA rat cardiac allografts in LEW recipients. These data demonstrate that intragraft IL-10 overexpression is not sufficient to prolong allograft survival in a high-responder strain combination and that the regulatory capacity of T cells in vitro does not predict their in vivo efficiency.

Leben und Werk des berühmten Mäzens König Alfons X. von Kastilien sind vielfach gelobt und getadelt worden. In den letzten Jahrzehnten hat die Forschung dabei insbesondere auf den Widerspruch hingewiesen zwischen dem großen Interesse Alfons’ an orientalischem Wissen und einem friedlichen Wissensaustausch an seinem Hof einerseits und der Unterdrückung religiöser Minderheiten unter seiner Herrschaft andererseits. Doch wie und wo beeinflussten das im Werk Alfons’ dargestellte Weltbild seine politischen Handlungen gegenüber Nicht-Christen (insbesondere gegenüber den Mauren)? Welche Vorstellung und Ausübung von Toleranz war in der Regierungszeit Alfons’ vorherrschend und inwiefern vertrat Alfons den Geist seiner Zeit? Diese Fragen sind geeignet, Zweifel an dem behaupteten Widerspruch zu wecken. Nach seinen Weltanschauungen konzipierte Alfons sein Königreich als Ganzes, wobei die drei religiösen Gruppen in einer klar hierarchisierten Gesellschaftsordnung ihren jeweiligen Platz mit einer jeweils unterschiedlichen Bedeutung zugewiesen bekamen. Sowohl in seiner idealisierten als auch in der realen Gesellschaft war Toleranz für Alfons X. von Kastilien überwiegend eine pragmatische Haltung. Im gesellschaftlichen Bereich verteidigten Mudejaren, Sepharden und Christen des mittelalterlichen Spaniens ihre Identitäten, die sie bedroht sahen, weil die kulturellen Verflechtungen im Laufe der Jahrhunderte sehr stark geworden waren. Und im Ringen um die Bildung und den Erhalt eigener Identität stellen Pragmatismus und Toleranz keinen Widerspruch dar, sondern sind vielmehr Bedingung und Folge des „Zusammenlebens“. / The life and the works of famous patron King Alfonso X of Castile have often been praised and critized. In the last decades, research has particular referred to the contradiction between Alfons’great interest in oriental knowledge und a peaceful exchange of knowledge at his court on the one hand and the oppression of religious minorities under his rule on the other hand. But how and where did the conception of the world as presented in Alfons’ work affect his political actions against non-Christians (especially against the Muslims)? Which conception and practice of tolerance were predominant in his reign and to what extent did Alfons represent the spirit of his time? These questions are suitable to cast doubts on the maintained contradiction. According to his view of the word, Alfonso considered his kingdom as a whole, in which the three religious groups were assigned to their respective place with a different meaning to each in a clearly hierarchical social order. In his idealized as well as in the real society, tolerance was predominantly a pragmatic attitude for Alfonso X of Castile. Within the social field, the Islamic Moors (Mudéjares), Sephardics Jews and Christians of medieval Spain defended their identities which they considered to be threatened, because cultural interconnections had become very strong in the course of centuries. And in the struggle for the formation and preservation of one’s own identity, tolerance and pragmatism do not mean contradiction, but rather a condition and consequence of "living together".