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Les toxi-infections alimentaires collectives staphylococciques représentent ces dernières années en France la seconde cause de toxi-infections alimentaires bactériennes. Ces dernières sont dues à l'ingestion de toxines préformées dans les aliments : les entérotoxines. Actuellement, une vingtaine d'entérotoxines (SEA àSElV) ont été décrites dans la littérature ; parmi celles-ci, toutes possédent une activité superantigéniques mais seules quelques unes possèdent une activité émétique prouvée et présentent donc un risque sanitaire pour le consommateur. Deux problèmes majeurs se posent pour confirmer le diagnostic des épisodes toxiques à staphylocoques. D'une part, les staphylocoques sont sensibles aux traitements thermiques appliqués aux aliments alors que les entérotoxines ne le sont pas, et d'autre part les méthodes de détection des entérotoxines staphylococciques actuellement disponibles ne couvrent pas l'ensemble des entérotoxines décrites à ce jour. Ainsi, et afin de proposer une alternative innovante aux tests immuno-enzymatiques utilisés pour la recherche des entérotoxines staphylococciques dans les matrices alimentaires, nous avons mis en place une démarche intégrée « du gène à la protéine » utilisant des outils de biologie moléculaire, d'immunochimie et de physisco-chimie des protéines pour caractériser, comprendre et élucider les toxi-infections alimentaires collectives à staphylocoques.

DESCRIPTION DU SUJET ABORDE Certains Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) ou Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) sont responsables de toxi-infections dorigine alimentaire qui se traduisent par des diarrhées mais aussi par des syndromes plus graves pour lhomme comme le syndrome hémolytique urémique pouvant provoquer la mort. Ils apparaissent comme un problème important de santé publique. La souche de STEC du sérotype O157:H7 est responsable dépidémies dans le monde causant des milliers de malades et des dizaines de morts. Le réservoir principal est le bovin et les autres ruminants. Les principaux modes de transmission des infections à STEC à lhomme sont la consommation daliments contaminés, la transmission de personne à personne, lingestion deau contaminée et le contact avec des animaux (notamment les bovins) et leur environnement. Les facteurs de virulence des Escherichia coli producteurs de Shigatoxines (STEC) sont principalement les protéines codées par un îlot de pathogénicité, le LEE Locus of Enterocyte Effacement, impliquées dans la formation de la lésion dattachement et deffacement et de la diarrhée et les toxines de Shiga codées par des bactériophages et impliquées dans les syndromes extra- intestinaux. A partir des années nonante, le nombre croissant dépidémies liées à STEC, en Amérique du Nord et en Europe, ont interpellé les professionnels du secteur qui ont concentré leurs efforts pour mettre au point des moyens de recherche, didentification, de maîtrise et de prévention du danger. Le premier objectif de ce travail était donc dapprocher le plus précisément possible la situation en Belgique dans les principales filières de production de denrées alimentaires dorigine animale (DAOA). Pour ce faire, les études suivantes ont été entreprises: i) une étude préliminaire de la contamination par les STEC O157 des carcasses de buf et de porc (étude I) ; ii) une étude visant à la détermination du taux de contamination des viandes hachées de buf par les STEC O157 et autres sérotypes ; iii) des études extensives basées sur des plans annuels de surveillance couvant toute la production nationale visant à établir le taux de prévalence et lévolution temporelle de la contamination par les STEC O157 dans les principales DAOA mais surtout dans la filière de la viande de buf. Les plans de recherche de ces pathogènes ont été couplés à la détermination du nombre dE. coli totaux pour juger du niveau de maîtrise de la contamination fécale dans les établissements afin dapporter des éléments quantitatifs pour une évaluation du risque lié aux STEC. Le second objectif visait à déterminer le taux de contamination par les STEC et les STEC O157 dans deux abattoirs algériens, lun de buf, lautre de moutons afin de savoir si ces pathogènes posaient des problèmes de santé publique en Algérie. Le niveau de contamination fécale a aussi été étudié afin de juger de la maîtrise de lhygiène de labattage. RESULTATS En Belgique Evaluation du taux de contamination par les STEC de sérotype O157 de carcasses de buf et de porcs dans 9 abattoirs en 1996 Dans le cadre de limplémentation du système HACCP (directive 93/43/CE), trois cent dix carcasses de buf et 245 carcasses de porcs ont été soumises à un écouvillonnage en surface au niveau de sites spécifiques. La méthode de recherche était basée sur les étapes i) un enrichissement non sélectif, ii) une méthode de séparation immuno-magnétique, iii) une détection immuno-enzymatique (VIDAS ECO, BioMérieux), iv) un isolement sur milieu Mac Conkey au sorbitol. Cette étude a permis de standardiser la méthode déchantillonnage et a révélé, pour la première fois en Belgique, la présence dune souche STEC O157 :H- (stx1+, stx2+, eae+) potentiellement pathogène sur des carcasses bovines. Prévalence des Escherichia coli producteurs de shigatoxines dans les viandes hachées en 1997 Aucune souche de STEC O157 (eae stx) na été isolée à été isolée à partir des 627 échantillons de viande hachées analysées. La PCR a permis de détecter le gène stx dans 5,1 % des échantillons positifs (n=45). Seulement 7 souches ont été isolées par une méthode dhybridation ADN/ADN sur colonies basée sur les principaux gènes des facteurs de virulence des STEC : Deux E. coli de sérotype O91 (stx2+, eae-), deux des E. coli entéropathogènes de sérotype O128 et trois de sérotypes non identifiés. La qualité bactériologique des viandes hachées testées était satisfaisante puisque plus de 80 % des échantillons avaient un taux dE. coli inférieur à 50 unités formant colonies (ufc) par gramme donc au critère légal de m=50 ufc/gramme (Arrêté Royal du 4 juillet 1996) Surveillance du taux de contamination des denrées alimentaires dorigine animale par des souches dEscherichia coli du sérotype O157 de 1998 à 2004 Cette étude répond aux exigences des directives (92/117/CEE et 2003/99/CEE) et présente les plans de surveillance des STEC O157 dans les denrées alimentaires. Aucune souche de STEC O157 na été isolée à partir des 1025 échantillons (matrices issues de bovins, porcs, volailles, lapins) testés en 1997. En 1998, une modification de la méthode analytique (méthode SP-VG M001) a permis disoler neuf souches dE. coli de sérotype O157 (stx+) à partir de surfaces de 6010 carcasses regroupées en pools de 5 carcasses par échantillon. Quatre vingt pourcents des souches STEC O157 sont stx2 eae et ehxA et 90 % portaient lantigène H7. Une majorité de firmes nont pas satisfait aux critères microbiologiques pour les E. coli (arrêté royal du 20 Août 2002). Cependant, aucune relation statistiquement significative entre les niveaux de contamination par les E. coli totaux et la présence dE. coli O157 na pu être établie. Les années 1999 à 2004 ont été marquées par une surveillance des STEC O157 sur un plus grand nombre dentreprises, un plus grand nombre déchantillons (filière bovine, porcine, poulet, poule et poissons), une plus grande surface de carcasses écouvillonnées (décision 2001/471/CE) et des recherches au stade du consommateur. La méthode de recherche des STEC O157 a été la méthode SP-VG M001. Le dénombrement des E. coli a été réalisé selon la méthode validée par lAFNOR, SDP-07/1-07/93. Des prévalences de STEC O157 égales à 1,3 % (n=1984) en 1999, 0,4 % (n=1501) en 2000, 1,08 % (n=1388) en 2001, 1,07% (n=1225) en 2002, 0,82 % (n=1497) en 2003 et à 1,35 % (n=1337) en 2004 ont été mises en évidence sur les surfaces de carcasses de buf, ce qui correspond à une moyenne pondérée de 0,95 %. En ce qui concerne les viandes hachées, la prévalence des STEC O157 est faible soit 0,1 % (1/974) en 1999, 0,4 % (1/487) en 2000, 1,68 % (5/298) en 2003 et aucun STEC O157 en 2001, 2002 et 2004 pour une moyenne pondérée de 0,27 %. La présence de souches dans du haché de buf prélevé en grandes surfaces montre que des souches pathogènes se retrouvent parfois au stade de la distribution. Entre 1999 et 2004, Deux souches STEC O157 ont été isolées en 2003 et deux autres en 2004 à partir de 764 viandes de découpe de buf analysées soit une prévalence de 0,52 %. Les matrices de porcs, de poules, poulets et de poissons ne semblent pas présenter un danger à lheure actuelle puisque aucun STEC O157 ny a été mis en évidence à ce jour en Belgique. Une amélioration de la contamination par les Escherichia coli a pu être observée au cours des années dans les firmes échantillonnées. Les 106 souches de STEC O157 isolées à partir des matrices de bovins sont en majorité des E.coli O157 :H7, stx2, eae et ehxA, fréquemment impliqué dans les formes graves des infections. En Algérie Evaluation du taux de contamination des carcasses bovines par les Escherichia coli entérohémorragiques du sérotype O157 et dautres Escherichia coli pathogènes Une méthode simplifiée de la recherche des STEC O157 a permis de révéler la présence de 18 souches (7,8 %) STEC O157 à partir de 230 carcasses de buf échantillonnées. Septante huit pourcents dentre elles sont stx2, eae et ehxA. De même, 66 colonies possédant au moins un des gènes de virulence recherchés, ont été isolées à partir de trente carcasses positives à lhybridation ADN/ADN sur colonies. Quarante (60,6 %) sont des E. coli entéropathogénes (eae+, stx-), 23 (34,8 %) sont (stx+, eae-) et trois (4,5 %) sont (eae+, stx+). Aucune des trois nappartient aux sérotypes STEC les plus fréquents (O26, O111, O128, O103, O91, O145). Plus de 65 % des carcasses avaient des niveaux dE. coli supérieurs à la limite dacceptabilité (M) définie par le critère microbiologique belge (20 ufc/cm2). Evaluation du taux de contamination par les Escherichia coli producteurs de shigatoxines sur les carcasses ovines et dans les matières fécales. Cette étude a permis de mettre en évidence, la présence de STEC O157:H7 sur 2,5 % des 160 carcasses écouvillonnées (décision 2001/471/CE). Le pathotype principal était stx2 eae et ehxA. Parmi les neuf souches STEC O157 stx2 isolées et testées par PCR pour les sous-types c, d, e, f, seulement trois sont stx2d. Létude du portage des STEC dans les matières fécales dovins a montré la présence du gène stx dans 25,4% des prélèvements (n=106). Le pathotype principal identifié sur un échantillon composite était stx1 (50 %) suivi du pathotype stx1, eae (46, 4%). Lovin est donc aussi un réservoir potentiel de STEC pathogènes et une source de contamination pour lhomme CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES, Lexistence de souches STEC O157 potentiellement pathogènes a été confirmée dans la filière bovine. La prévalence de ces agents pathogènes observée sur les carcasses bovines en Belgique (en moyenne de 0,95%) est proche des valeurs enregistrées dans dautres pays : 0,7 % au Danemark, (EC, 2001), 1 % en Tchécoslovaquie (Lukasova, 2004) et 1,4 % en Grande Bretagne (Chapman, 2001). La prévalence des STEC O157 enregistrée en Algérie (7,8 % dans cette étude) est significativement supérieure aux prévalences observées en Belgique. Des prévalences du même ordre de grandeur ont été rapportées dans la littérature soit 17,1% aux USA (Elder et al., 2000), 12% en Italie (Bonardi etal., 2001), 11% en Irlande (Mc Evroy et al., 2003). La prévalence des STEC O157 dans les viandes hachées est faible, en général inférieure à 1 %. Elle est de 0,27 % en Belgique (cette étude). De plus, la présence de souches dans du haché de buf prélevé en grandes surfaces a montré que des souches pathogènes se retrouvent parfois au stade de la distribution et constituent un danger direct pour le consommateur. Des résultats similaires ont été enregistrés 0,15 % en Angleterre (Chapman, 2001), 0,11 % en France (AFSSA, 2003). Les matrices de porcs, de poules, poulets et de poissons ne semblent pas présenter un danger à lheure actuelle puisque aucun STEC O157 ny a été mis en évidence à ce jour en Belgique. Comme lont mentionné la plupart des études relatives à la prévalence des STEC O157, il est difficile de comparer les résultats obtenus à cause des différences constatées au niveau de la taille des échantillons, des méthodes de prélèvements et de détection de ces agents pathogènes. La standardisation de la méthode de détection des Escherichia coli O157 (norme ISO16654) ainsi que lapplication de la directive de la commission européenne (2001/471/ CE) définissant les quatre sites découvillonnage au niveau des carcasses de buf et dovins ont permis dasseoir une méthodologie de recherche performante. La majorité des souches STEC O157 isolées en Belgique et en Algérie présentent le pathotype stx2 eae ehxA considéré comme le plus dangereux pour la santé publique Aucune association directe entre les taux élevés dE. coli totaux et la présence de STEC O157 na pu être établie. E. coli ne semble pas être un indicateur pour la présence de cet agent pathogène mais, bien sûr, le niveau de contamination par les souches pathogènes doit diminuer en parallèle à la charge en E. coli totaux et que, donc, globalement le risque quelles présentent doit diminuer. En ce qui concerne lespèce ovine, Une prévalence égale à 0,7 % a été mise en évidence dans une autre étude en Grande Bretagne (Chapman et al., 2001). les résultats obtenus concernant le portage des STEC obtenus sont proches des résultats dune étude en Suisse qui a révélé la présence de STEC sans préciser le sérotype dans 29,9 % des matières fécales (Zweifel et al., 2004). Les taux élevés de contamination fécale observés en Algérie laissent supposer que, si les animaux sont porteurs de STEC O157, le niveau de contamination des carcasses devrait être plus important quen Belgique. En perspectives, au niveau belge, les plans de surveillance doivent être maintenus surtout au niveau des matrices bovines: carcasses, viandes hachées, découpes afin dévaluer les évolutions. Ces études devraient être couplées en amont avec des études de prévalence au niveau des exploitations agricoles et en aval avec les données en pathologie humaine. Une plus grande coordination devrait sopérer entre le secteur vétérinaire et la santé publique. En Belgique, le laboratoire de référence pour les EHEC est le même dans les deux cas (UZ-Brussel) ce qui signifie que les méthodes de typage appliquées aux souches des deux origines sont les mêmes. Les critères microbiologiques européens du Règlement (CE) N°2073/2005 vont encore accentuer les efforts des industriels pour la maîtrise des agents pathogènes dans les filières à risque, même si les STEC O157 ne sont pas encore repris dans les critères de sécurité de ce Règlement. Le développement de méthodes efficaces pour la recherche des autres sérotypes devrait permettre détendre la surveillance aux STEC non O157 les plus importants. Les données collectées au cours des plans de surveillance vont permettre de compléter les données disponibles pour une analyse du risque STEC O157 dans les filières à risque et particulièrement la filière bovine. En Algérie, une application des plans HACCP au niveau des entreprises agroalimentaires et une surveillance des agents zoonotiques sont nécessaires. Des études complémentaires et approfondies grâce à la mise en place de moyens de diagnostic doivent être menées aussi bien au niveau humain quau niveau vétérinaire. Les résultats de ces études devront être considérés par la Direction des Services Vétérinaires du Ministère de lAgriculture en Algérie. REMERCIEMENTS Cette étude a été menée grâce au soutien financier de lInstitut dExpertise Vétérinaire(IEV) puis de lAgence Fédérale pour la sécurité de la Chaine Alimentaire (AFSCA) par le laboratoire de microbiologie des denrées alimentaires de la Faculté de Médecine Vétérinaire de lUniversité de Liège (ULg) et la collaboration du laboratoire Vakgroep Diergeneeskundig Toezicht op Eetwaren, Diergeneeskunde Faculteit, Universiteit Gent (U Gent); le laboratoire de microbiologie alimentaire de lInstitut Scientifique de la Santé Publique : Louis Pasteur (ISP-LP) et deux laboratoires de lAFSCA qui ont participé aux analyses à partir de 2003 et le laboratoire de.(UZ-Brussel) Les études en Algérie ont été réalisées grâce au soutien du Ministère de lEnseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique et de lEcole Nationale Vétérinaire dAlger avec la collaboration du laboratoire national de référence de microbiologie alimentaire de la faculté de médecine vétérinaire de lULg.