Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-19T13:29:29Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina(jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2013-11-26T11:00:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2014-09-26T10:49:49Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-03-10T13:27:33Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As células-tronco (CTs) têm potencial de se diferenciar em vários tipos celulares servindo como um sistema de reparação de tecidos. Quando uma CT se divide mantém o mesmo potencial da célula que a originou em um mecanismo chamado de autorrenovação. O entendimento desse mecanismo ajudará a compreender a senescência e a perda do potencial de diferenciação das CTs. Em nível de regulação pós-transcricional, as proteínas DZIP1 e PUM2 estão envolvidas na autorrenovação de CT embrionárias e germinativas de diversos organismos, incluindo humanos. Contudo, o trabalho visou o estudo do envolvimento de PUM2 e DZIP1 nos mecanismos de autorrenovação e diferenciação em CTs mesenquimais humanas (CTMs). Por RT-PCR, foi observada a expressão dos transcritos de dzip1 e pum2 em CTMs derivadas de medula óssea (MO), sangue de cordão umbilical e placentário (SCU) e tecido adiposo (TA). A expressão dos transcritos também foram analisada durante a adipogênese das CTMs por qRT-PCR. Os resultados demonstram que o perfil de expressão dos dois transcritos sofre redução durante o processo, enquanto o transcrito de fabp4 (marcador adipogênico) aumenta. Por citometria de fluxo foi verificada a porcentagem de CTMs de TA que expressam DZIP1 (mais de 90% da população) e PUM2 (cerca de 50% da população). A expressão das proteínas PUM2 e DZIP1 foi confirmada por western blot em extratos totais de CTMs. Durante a diferenciação celular, a expressão da proteína DZIP1 se manteve constante enquanto PUM2 sofreu redução após induzida da diferenciação. A discrepância entre os níveis de mRNA e da proteína DZIP1 sugere regulação pós-transcricional. As imunofluorescências de DZIP1 e PUM2 nas CTMs indicaram que essas proteínas são nucleares em células de culturas recém sub-cultivadas e a localização dessas são translocadas para o citoplasma ao longo do tempo da cultura. As células diferenciadas expressam as duas proteínas no citoplasma e/ou núcleo. Análise dos transcritos de dzip1 e pum2 também foi verificada em culturas com proliferação celular intensa e reduzida. Dzip1 não apresentou mudanças significativas de expressão nas duas situações. No entanto, a expressão de pum2 aumentou nas CTMs com proliferação intensa, sugerindo uma possível participação nesse processo. Ensaios futuros serão realizados para confirmar a participação de PUM2 na proliferação celular. Além disso, a interferência de dzip1 e pum2 por RNA será providenciada para análise funcional desses genes. / Stem Cells (SCs) have the potential of differentiating into several cellular types, serving as a repair system for the organism. The ability of stem cells to replicate themselves by dividing into the same non-specialized cell type over long periods is a mechanism knows as self-renewal. The understanding of this mechanism will also help to understand the senescence and hence, the loss of SCs differentiation potential. PUMILIO2 and DZIP1 RNA binding proteins regulate the translation of specific mRNAs during self-renewal and differentiation of germ-line and embryonic stem cells of diverse organisms, including humans. In this work, we aimed to study the relevance of PUM2 and DZIP1 in self-renewal and differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We have found that dzip1 and pum2 transcripts are expressed in hMSCs derived from bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and umbilical cord blood (UC) by using RT-PCR analysis. We have found that more than 90% of the MSCs population express DZIP1 and about 50% express PUM2 by flow cytometry. The expression pattern of pum2 and dzip1 transcripts was followed during differentiation of adipose derived MSCs into adipocytes. Quantitative PCR analysis showed that mRNA levels of both genes drop during differentiation, showing an opposite pattern to the fabp4 adipocyte marker. The presence of the PUM2 and DZIP1 proteins was confirmed by western blot of total protein extracts of AT derived hMSCs. During cell differentiation, the expression of the protein DZIP1 was constant while PUM2 decreased. The discrepancy between the levels of the dzip1 mRNA and protein suggests a regulated transcriptional and post-transcriptional expression of these genes. DZIP1 and PUM2 in immunofluorescence assays in hMSCs indicated that they are nuclear in freshly plated cells and translocate to the cytoplasm over time. The differentiated cells present the two proteins in the cytoplasm and nucleus. The expression pattern of the dzip1 and pum2 transcripts was also followed in cultures of MSCs derived from AT undergoing intense and reduced cell proliferation. Dzip1 showed no significant changes of expression in both situations. However, the expression of pum2 is higher in hMSCs with intensive proliferation than with reduced proliferation suggesting a possible participation in this process. To pave the way to a better understanding of DZIP1 and PUM2 function in hMSCs, RNA interference experiment are in progress.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-23T16:32:24Z No. of bitstreams: 1 carmen_b_vieira_ioc_bcm_0002_2010.pdf: 1656859 bytes, checksum: 62b8e8b68ef938a3f60ee88a24b5056c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-23T16:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carmen_b_vieira_ioc_bcm_0002_2010.pdf: 1656859 bytes, checksum: 62b8e8b68ef938a3f60ee88a24b5056c (MD5) Previous issue date: 2010 / Dra. Ana Maria Coimbra Gaspar / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O aumento das atividades recreacionais na água tem contribuído para a transmissão de doenças de veiculação hídrica. Os parâmetros de balneabilidade avaliados para exposição humana em águas naturais incluem indicadores bacteriológicos. Entretanto, a presença de vírus nestas águas não é considerada. Neste contexto, os vírus excretados nas fezes de pessoas infectadas são importantes contaminantes de águas superficiais em função do contínuo despejo de esgoto doméstico. Este estudo tem como objetivo avaliar a contaminação pelos principais agentes etiológicos da gastroenterite viral aguda, rotavírus grupo A (RV-A) e norovírus (NV), em águas superficiais da Lagoa Rodrigo de Freitas pela detecção, quantificação e caracterização molecular destes agentes, correlacionando-os com parâmetros microbiológicos e físico-químicos de qualidade da água. A Lagoa é um ponto turístico e de lazer de grande expressão na cidade do Rio de Janeiro, tem sua água classificada como água de recreação de contato primário e, atualmente, está passando por um programa de despoluição para reverter o seu estado de degradação ambiental. Entre Agosto de 2007 e Julho de 2008, 2L de água superficial foram coletados mensalmente em 12 pontos, incluindo 10 pontos na Lagoa Rodrigo de Freitas, um no Rio dos Macacos, que desemboca na Lagoa, e um na praia do Leblon, onde a água da Lagoa é escoada, totalizando 144 amostras. As amostras foram concentradas 1000X pelo método de adsorção-eluição utilizando uma membrana carregada negativamente e reconcentradas a uma volume final de 2mL em Centriprep®YM-50. RV-A e NV foram detectados e quantificados pelas técnicas de reação em cadeia pela polimerase convencional e quantitativa (cPCR / qPCR) precedidas por transcrição reversa (RT). Pela análise conjunta destas metodologias, RV-A e NV-GII foram detectados em 24,3% (35/144) e 18,8% (27/144) das amostras estudadas, respectivamente. A quantificação de RV-A e NV- GII variou de 3,34 a 4680 cg/100mL e 1,57 a 26,5 cg/100mL, respectivamente. As amostras positivas de RV-A foram caracterizadas pelo sequenciamento parcial do segmento 6 (VP6) como subgrupo I e genótipo I2 segundo a nova classificação proposta para estes vírus. E.coli foi quantificada por Kit Colilert-18Kit Quanti-Tray®/ 2000 em cada ponto de coleta como um indicador bacteriológico de contaminação fecal e 87,5% (126/144) das amostras de água foram caracterizadas como próprias conforme estabelecido pela legislação vigente. RV-A e/ou NV-GII foram detectados em 38,1% (48/126) dessas amostras, evidenciando a presença de vírus em águas que estão dentro dos padrões aceitáveis para E.coli, não sendo observada a associação entre este parâmetro e a detecção destes vírus. Adenovirus humano (HuAdV) foram pesquisados como possíveis marcadores virais de contaminação fecal humana, sendo detectados em 16,7% (24/144) das amostras, apresentando distribuição não homogênea em relação aos resultados de E.coli, RV-A e NV-GII. Parâmetros físico-químicos como salinidade, temperatura, pH, cloro e turbidez foram determinados, sendo demonstrada uma distribuição não homogênea entre RV-A e turbidez e NV-GII e pH. Os dados obtidos neste estudo enfatizam a necessidade do estabelecimento de parâmetros virais para a avaliação da qualidade da água e a necessidade de se disponibilizar protocolos de detecção viral que auxiliem para a adoção de medidas de controle de contaminação ambiental pelas autoridades Municipal e Estadual. / The increase of recreational activities in water has contributed to the transmission of waterborne diseases. The bathing parameters evaluated for human exposure in natural waters include bacteriological criteria. However the presence of virus is not considered. In this context, viruses excreted in feces of infected people are important contaminants of surface water due to the continuous discharge of domestic sewage.This study aims to evaluate the contamination by the main etiologic agents of viral acute gastroenteritis, group A rotavirus (RV-A) and norovirus (NV), in surface waters of the Rodrigo de Freitas Lagoon by detection, quantification and molecular characterization of these agents, correlating with the microbiological and physico- chemical standards for water quality. From August 2007 to July 2008, 2L of surface water were monthly collected at 12 sites, including 10 sites in the Rodrigo de Freitas Lagoon, one in the Macacos River, which flows into Lagoon, and one at Leblon Beach, where water Lagoon is drained, totalizing 144 samples. The samples were concentrated 1000X by an adsorption-elution method using a negatively charged membrane and reconcentrated to a final volume of 2mL in Centriprep ®YM-50 concentrator. RV-A and NV were detected and quantified by conventional and quantitative polymerase chain reaction (cPCR/qPCR) preceded by reverse transcription (RT). For the joint analysis of these methodologies RV-A and NV-GII were detected in 24,3% (35/144) and 18,8% (27/144) of the studied samples, respectively. Quantification of RV-A and NV-GII ranged from 3,34 to 4680 cg/100mL and 1,57 to 26,5 cg/100mL, respectively. The RV-A positive samples were characterized by partial sequencing of segment 6 (VP6) as subgroup I and I2 genotype according to the new classification proposed. E.coli was quantified using Colilert®-18Kit Quanti-Tray®/2000 in each collection site as bacterial standard of fecal contamination and 87.5% (126/144) of water samples analyzed were characterized as suitable for bath as established by legislation. RV-A and/or NV-GII were detected in 38,1% (48/126) of these samples, showing the presence of viruses in waters that are within the standards for acceptable E.coli and there was no association between this parameter and viral detection. Human adenoviruses (HuAdV) were investigated as possible viral markers of human fecal contamination and were detected in 16,7% (21/144) of the samples showing non-homogeneous distribution in relation to the results of E. coli, RV-A and NV-GII. Physico-chemical parameters, like salinity, temperature, pH, chlorine and turbidity, were determined in loco. It was demonstrated a non-homogeneous distribution of positive and negative samples between RV-A and turbidity and NV-GII and pH. Data obtained in this study emphasize the need for the establishment of viral parameters for the assessment of water quality and the need to provide viral detection protocols that lead to the adoption of measures to control environmental contamination by municipal and state authorities