Le facteur de transcription GATA4 est un puissant régulateur du développement cardiaque, gonadique et digestif. Bien qu'un grand nombre de ses gènes cibles soient connus, les mécanismes contrôlant son expression et son activité demeurent incertains. GATA4 est phosphorylé par la PKA en réponse à l'AMPc en serine 261 et des MAPK en serine 105. L'objectif de mon projet de maîtrise est donc de définir l'importance de ces sites de phosphorylations et plus particulièrement par les MAPK sur l'activité transcriptionnelle de GATA4 sur certains promoteurs cibles. Les résultats de transfection transitoire au phosphate de calcium montrent que la stimulation par les MAPK potentialise l'activité transcriptionnelle de GATA4 sur les promoteurs Star, Inha et Cypl9. Cette stimulation potentialise également la coopération de GATA4 avec ses partenaires transcriptionnels comme LRH1 et SF1 sur le promoteur Inha. Ceci a permits de mettre en évidence l'importance des MAPK dans la régulation de l'activité transcriptionnelle de GATA4 sur certains promoteurs cibles.

Les facteurs de transcription GATA tirent leur nom de leur capacité à se lier à la séquence consensus WGATAR sur les promoteurs de leur gènes cibles. Le facteur GATA4, joue un rôle décisif dans le développement de multiples organes comme le cœur, le tractus digestif, et les gonades. Malgré son rôle central au cours du développement, le mécanisme d'action de GATA4 et son mode de régulation dans différents tissus, et plus particulièrement les gonades, reste mal compris. Le principal objectif du travail rapporté dans cette thèse a été de mieux caractériser comment GATA4 acquiert sa spécificité d'action pour réguler ses gènes cibles gonadiques. Un de ces mécanismes est la coopération avec différents partenaires transcriptionnels. Le facteur WT1 a été identifié comme un nouveau partenaire pour GATA4 dans la régulation de l'expression de SRY et de MIS/AMH, deux gènes fondamentaux de la détermination et la différenciation du sexe. Le récepteur nucléaire LRH-1/NR5A2 a lui aussi été identifié comme partenaire de GATA4 dans la régulation du gène HSD3B2 humain codant pour une enzyme cruciale de la stéroïdogenèse. Un mode de régulation alternatif est la modification post-traductionelle du facteur GATA4 lui-même, le processus le plus étudié étant la phosphorylation. Dans les cellules gonadiques, GATA4 est sujet à la phosphorylation par la protéine kinase A. Toutefois, GATA4 est aussi une cible pour la MAP kinase sur une série distincte de résidus serine. Ainsi, la phosphorylation sélective de GATA4 en réponse à différents stimuli et impliquant différentes voies de signalisation apparaît comme un mécanisme clé de la régulation de l'activité de GATA4 dans les cellules gonadiques. Enfin, l'interruption des interactions entre GATA4 et ses partenaires transcriptionnels est liée à des maladies chez l'homme. En effet, une mutation du gène GATA4 humain (hG296S) empêche son interaction avec TBX5, ce qui est à l'origine de défauts cardiaques congénitaux. Contrairement au cœur, la mutation ne semble pas avoir d'effet sur la capacité de GATA4 à coopérer avec ses partenaires transcriptionels gonadiques. Ainsi, bien que préjudiciable à la fonction cardiaque, cette mutation n'est pas supposée à provoquer des effets sur la reproduction chez l'homme. / The GATA family of transcription factors is named for the consensus nucleotide sequence (WGATAR) that they bind in the promoter region of target genes. One member of this family, GATA4, plays a prominent role in the development of multiple ventrally-located organs such as the heart, digestive tract, and gonads. Despite this pivotal developmental role, the mechanism of action of GATA4 and its regulation in different tissues, especially the gonads, remains poorly understood. The main objective of the work presented in this thesis was to better understand how GATA4 acquires its specificity of action to regulate gonadal target genes. One mechanism is through cooperative interactions with different transcriptional partners. WT1 was identified as a novel partner for GATA4 in the regulation of sex-determining region Y (SRY) and Mullerian inhibiting substance (MIS/AMH), two critical genes involved in the mammalian sex determination and differentiation pathway. The nuclear receptor LRH-1/NR5A2 was also identified as a new transcriptional partner for GATA4 in the regulation of the human 3(3- hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene (HSD3B2) involved in steroidogenesis. An alternate mechanism for regulating GATA4 activity is via post-translational modifications of the factor itself. The most studied has been the role of phosphorylation. In gonadal cells, GATA4 is a target for phosphorylation by protein kinase A (PKA). GATA4, however, was also found to be a target for MAP kinasemediated phosphorylation on a distinct set of serine residues. Thus, selective phosphorylation of GATA4 in response to different stimuli and involving different signaling pathways appears to be a key mechanism for regulating GATA4 activity within gonadal cells. Finally, disruption of cooperative interactions between GATA4 and its transcriptional partners has also been linked to human disease. Indeed, a human GATA4 mutation (hG296S) has been reported to abrogate its interaction with TBX5, resulting in congenital heart defects. Unlike the heart, the mutation was found to have no effect on the ability of GATA4 to cooperate with its major gonadal transcriptional partners. Thus, although detrimental to heart function, the hG296S mutation would not be expected to cause human reproductive defects.

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 octobre 2023) / L'expression tumorale des enzymes UDP-glucuronosyltransférase (UGT) est associée à un pronostic défavorable dans plusieurs types de cancers. Un membre de cette famille, UGT2B17, est impliqué dans l'inactivation d'agents anticancéreux et de certains composés endogènes jouant un rôle dans le développement et la progression du cancer. L'expression élevée du gène UGT2B17 a été identifiée par notre groupe comme un marqueur indépendant de mauvais pronostic en leucémie lymphoïde chronique (LLC), associée à une survie réduite et à une moins bonne réponse au traitement. L'expression d'UGT2B17 au niveau des cellules B-LLC se caractérise par la présence de transcrits alternatifs n2, n3 et n4, dont la transcription est issue des promoteurs P2 et P3. En revanche, le transcrit canonique v1 est absent et prédomine dans d'autres tissus comme le foie, pour lequel la régulation de la transcription a été principalement étudiée. Mon projet a porté sur les mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression d'UGT2B17 au niveau des cellules B-LLC, et visait à démontrer l'implication de facteurs de transcription préalablement identifiés et potentiellement impliqués dans l'expression des transcrits alternatifs. Mon hypothèse stipulait que l'expression d'UGT2B17 dans les lymphocytes B-LLC implique ces facteurs de transcription et sous-tend un programme transcriptionnel distinct du foie n'impliquant pas le transcrit canonique. Expérimentalement, les données présentées dans ce mémoire supportent l'implication de facteurs de transcription tels que STAT3, Nf-kB et IRF dans l'activité transcriptionnelle d'UGT2B17 dans les cellules B-LLC. Ces facteurs de transcription sont connus pour leur implication en LLC. Nous concluons que la régulation de la transcription de ce gène diffère de celle du foie. / Tumor expression of UDP-glucuronosyltransferase (UGT) enzymes is associated with poor prognosis in several cancers. A member of this family, UGT2B17, is involved in the inactivation of anticancer agents and certain endogenous compounds that play a role in the development and progression of cancer. High expression of the UGT2B17 gene has been identified by our group as an independent marker of poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia (CLL), associated with reduced survival and poor response to treatment. The expression of UGT2B17 in B-CLL cells is characterized by the presence of alternative transcripts n2, n3 and n4, whose transcription comes from the P2 and P3 promoters. On the other hand, the canonical transcript v1 is absent and predominates in other tissues such as the liver, for which the regulation of transcription has been mainly studied. My project focused on the mechanisms involved in the regulation of UGT2B17 expression in B-CLL cells, and aimed to support the involvement of previously identified transcription factors potentially involved in the expression of alternative transcripts. My hypothesis was that expression of UGT2B17 in B-CLL cells involves these transcription factors and underlies a distinct transcriptional program than observed the liver, not involving the canonical transcript. The data presented in this thesis support the involvement of transcription factors such as STAT3, Nf-kB and IRF in the transcriptional activity of UGT2B17 in B-CLL cells. These transcription factors are known to be involved in CLL. We conclude that the regulation of transcription of this gene differs from that of the liver.

La famille des facteurs de transcription NFI comprend les isoformes NFI-A, -B, -C et -X, qui peuvent agir comme activateurs ou répresseurs de la transcription génique. Récemment, nous avons démontré le rôle répresseur de NFI dans la transcription du gène encodant la sous-unité α5 de l'intégrine α5βl. Dans cette étude, nous avons démontré que la suppression de certains isoformes du facteur de transcription NFI altère l'expression du gène α5 dans une lignée particulièrement agressive de mélanome uvéal humain (T97). Nous avons démontré que la diminution de l'expression de certains isoformes permet l'augmentation significative l'expression de l'intégrine α5β1 à la surface des cellules de la lignée T97. Nous avons également identifié quelques protéines qui intéragissent in vitro avec NFI et qui pourraient ainsi modifier ses propriétés modulatrices en regard du gène de α5β1.

La biogenèse ribosomale débute avec la transcription de l'ARN ribosomal (ARNr). La structure du nucléole, la formation des ribosomes et le recrutement des centaines de protéines et de Small Nucleolar Ribonucleic Acid (snoRNA) qui sont essentiels pour la biogenèse ribosomale dépendent de l'activité transcriptionnelle des gènes d’ARNr. Les génomes haploïdes murins et humains possèdent à peu près 200 copies de gènes d’ARNr présents sur le bras court de cinq chromosomes acrocentriques. Ces loci correspondent aux Nucleolar Organizer Regions (NORs) et restent en majorité hypocondensés par rapport au reste des chromosomes durant la mitose. Au commencement de chaque cycle cellulaire, les nucléoles se reforment autour des gènes d’ARNr actifs. Ces gènes d’ARNr sont transcrits par l'ARN polymérase I, ce qui nécessite la formation d'un complexe de pré-initiation de la transcription (Pre-Initiation Complex, PIC). À partir d'expériences in vitro, deux facteurs basaux pour l'ARN polymérase I ont été identifiés: Selectivity Factor 1 (SL1) et Upstream Binding Factor (UBF). Le complexe SL1 contient la protéine TATA-box Binding Protein (TBP) ainsi que plusieurs TBP-Associated Factor (TAF) qui permettent de reconnaître les séquences promotrices des gènes d’ARNr. Les données existantes à ce jour suggèrent qu'UBF est un facteur architectural qui permet la formation d'une structure nucléoprotéique, l'enhancesome, dans laquelle un dimère d'UBF forme une boucle d'ADN de 360° d'environ 140 paires de bases (pb) d'ADN, et de ce fait, aide à la formation du PIC. UBF a également été impliqué dans la régulation de l'élongation de la transcription. Cependant, il n'a pas encore été déterminé si UBF accomplit ces deux fonctions in vivo et si UBF est essentiel pour la transcription des gènes d'ARNr. Pour résoudre cette question fondamentale, nous avons généré des souris ainsi que des cellules murines qui portent une mutation conditionnelle du gène Ubf. L'inactivation du gène Ubf a entraîné un arrêt développemental au stade morula, ceci révélant l'importance du facteur pour la prolifération des cellules et pour le développement embryonnaire. L'inactivation conditionnelle du gène Ubf en culture cellulaire a mené à l'arrêt de la transcription ribosomale, à l'absence de formation du complexe PIC sur les gènes d’ARNr, à la mise en état inactif des gènes d’ARNr sans méthylation de l'ADN, à l'altération de la structure nucléolaire et à la formation d'une structure nucléaire qui contient les facteurs de l'initiation de la transcription et de la maturation des ARNr mais qui est dépourvue des NORs. L'inactivation conditionnelle d'Ubf dans les cellules a conduit à un arrêt de la prolifération cellulaire et à l'apoptose des cellules de manière indépendante p53, et ceci exclusivement dans les cellules transformées de manière oncogénique. Ces résultats suggèrent qu'UBF constituerait une cible de choix pour la chimiothérapie. / Ribosomal biogenesis starts with transcription of ribosomal RNA (rRNA). Nucleolus structure, ribosomes formation and recruitment of hundreds of proteins and snoRNAs Small Nucleolar Ribonucleic Acid essential for ribosomal biogenesis depend on transcription of rRNA. Human and mouse haploid genomes contain around 200 copies of rDNA genes on the short arms of five acrocentric chromosomes. These loci correspond to the NORs Nucleolar Organizer Regions and stay undercondensed during mitosis as compared with the rest of the chromosomes. At the beginning of each cell cycle, nucleoli are reformed around rDNA genes. rDNA genes are transcribed by RNA polymerase I, which requires the formation of the PIC. Two RNA polymerase I basal transcription factors were identified; SL1 Selectivity Factor 1 and UBF Upstream Binding Factor. The SL1 complex contains the TBP TATA-box Binding Protein protein and the TAF TBP-Associated Factor allowing the promoter sequences recognition on rDNA genes. Data suggest that UBF is an architectural factor that allows the formation of a nucleoproteic structure, the enhancesome, in which a UBF dimer forms a DNA loop of 360° of almost 140 bp of DNA and in this way aids PIC formation. However, UBF has also been implicated in the regulation of transcription elongation. But whether or not UBF actually performs either of these functions in vivo, or indeed is even essential for the transcription of the rRNA genes at all is still unknown. To resolve this fundamental question we have generated mice and mouse cells conditionally lacking the single copy Ubf gene. Inactivation of the Ubf gene in mouse leads to developmental arrest at morula stage, this revealing the factor's importance for cell proliferation and embryonic development. Conditional inactivation of Ubf gene in cell culture leads to shut-down of ribosomal transcription, to failure of PIC formation loss on rDNA genes, to a DNA methylation-independent inactivation of rDNA genes, to nucleolus structure alteration and to the formation of a sub-nuclear structure containing the initiation of transcription and the processing factors lacking the NORs. Conditional inactivation of Ubf gene in cells leads to a proliferation cell arrest and to a p53-independent apoptosis exclusively in oncogenically transformed cells, suggesting that UBF could represent a unique target for chemotherapy.

NOTCH1 est un récepteur transmembranaire qui, suite à la liaison de son ligand, subit une série de clivages protéolytiques libérant un fragment intracellulaire actif NIC1. Une fois libéré, NIC1 transloque au noyau où il s’associe à des cofacteurs transcriptionnels tels CSL et MAML1 afin d’initier la transcription de gènes cibles dont HES1. La voie Notch joue un rôle dans différents processus cellulaires, dont la prolifération, la mort cellulaire et la différenciation cellulaire. En conséquence, une mauvaise régulation ou une perte d’activité de cette voie de signalisation mène à des maladies humaines telles que des pathologies du développement et le cancer. De ce fait, la voie Notch est grandement régulée à divers niveaux. Entre autres, NIC1 subit des modifications post-traductionnelles qui régulent sa stabilité et par conséquent influence la durée du signal NOTCH1. L’activité transcriptionnelle de NIC1 est également régulée via le recrutement coordonné de cofacteurs transcriptionnels. Malgré tout, très peu de choses sont connues quant aux modifications post-traductionnelles pouvant moduler spécifiquement l’activité du complexe transcriptionnel formé par NIC1. De plus, les études jusqu’à présent n’ont pas permis d’identifier tous les partenaires d’interaction se retrouvant dans le complexe transcriptionnel NIC1/CSL/MAML1 et pouvant moduler son activité. Ainsi, l’objectif de cette étude était d’établir un système permettant l’identification de nouveaux partenaires transcriptionnels de NIC1. Nous avons exprimé une forme tronquée et constitutivement clivée de Notch1 et, suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec des membres du complexe médiateur et d’autres protéines impliquées dans la régulation génique. Nous avons également exprimé un NIC1-GFP et nos travaux ont permis de montrer qu’il était principalement localisé au noyau, où il s’associe à l’ARN polymérase II, et qu’il est dégradé par le protéasome. Suivant des analyses par spectrométrie de masse, nos résultats suggèrent l’interaction possible de NIC1 avec plusieurs régulateurs transcriptionnels et des protéines impliqués dans l’ubiquitination/Sumoylation. Bref, les analyses protéomiques sont un bon système d’exploitation pour l’identification de nouveaux partenaires d’interaction de NIC1. Ainsi, notre étude permettra une meilleure compréhension de la signalisation Notch d’apparence simple, mais plutôt complexe.

Drosophila chordotonal (Ch) organs are internal stretch receptors required for coordination, balance and hearing. The outer dendritic segment of the Ch neuron is a compartmentalised motile cilium, a feature that is exclusive to this neuron subtype. Ch organs are specified early in development by expression of the proneural gene atonal in the proneural cluster and sense organ precursors (SOPs) (Jarman et al., 1993). However little is known about how chordotonal SOP specification is linked to differentiation of Ch organs. fd3F encodes a forkhead transcription factor which has been identified as a potential downstream target of atonal in microarray experiments (Cachero et al., 2011). I have shown that fd3F is exclusively expressed in Ch neurons and their precursors in Drosophila embryos and Ch SOPs in larval imaginal discs. I have also generated an fd3F deletion mutant by imprecise excision of a P element. Mutant adults and larvae exhibit impaired coordination characteristic of Ch neuron defects and a similar phenotype was observed in fd3F RNAi lines. fd3F mutant Ch neurons do not show gross morphological defects, however the tips of the Ch neuron cilia appear swollen when analysed by electron microscopy and there is also some mis-localisation of proteins within the cilia. I have identified several Ch-specific genes that show strongly reduced mRNA expression in fd3F mutant embryos compared with wild type and could therefore be downstream targets of fd3F. These include a number of genes known to be essential for Ch neuron function such as transient receptor potential (TRP) ion channels, dyneins required for motility of the Ch neuron cilium and components of the retrograde transport machinery that may be required for protein localisation within the cilium. In addition several uncharacterised genes were identified as fd3F targets and these genes may therefore also be important for Ch neuron function. I have shown that fd3F directly regulates two of these genes, nanchung and inactive using GFP enhancer constructs and gel retardation assays. I therefore hypothesise that fd3F is an important component of the gene regulatory network that links atonal expression in SOPs to differentiation of Ch organs. In particular fd3F regulates genes required specifically for Ch neuron function and enhances expression of retrograde transport genes that may be required to ensure correct distribution of proteins within the compartmentalised Ch neuron cilium.

published_or_final_version / abstract / Biological Sciences / Doctoral / Doctor of Philosophy

published_or_final_version / Paediatrics and Adolescent Medicine / Master / Master of Philosophy

No description available.