A transferência gênica mediada por espermatozóide (TGME) por ser um método teoricamente simples e barato tem sido usada na produção de animais transgênicos. Entretanto, os resultados são variáveis e inconstantes. Para otimizar a TGME é necessário estabelecer o tempo, a quantidade e o tipo de DNA exógeno que será incubado com os espermatozóides. O estudo dos efeitos destes parâmetros na TGME foi o objetivo deste trabalho. Para avaliar o efeito da adição do DNA exógeno durante 0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação na viabilidade espermática foram utilizadas as sondas fluorescentes Hoechst 33342, Iodeto de propídeo, JC-1 e FITC-PSA. Na avaliação do efeito do tempo de incubação (60, 90 e 120 minutos) nos índices de apoptose e necrose, os espermatozóides foram corados com as sondas fluorescentes Yo-pro e Iodetoto de propídeo e avaliados pelo citômetro de fluxo, e os índices de transfecção avaliados pela PCR em tempo real. Para avaliar o efeito da quantidade e da seqüência de DNA exógeno foram construídas seqüências de tamanhos e estruturas diferentes. Para as seqüências de tamanhos diferentes, foram utilizadas seqüências de 2,2; 5,5 e 8,5kb nas concentrações de 500ng ou 130ng da seqüência de 2,2kb, 323ng da seqüência 5,5kb e 500ng da seqüência de 8,5kb. Para as seqüências de diferentes estruturas foram utilizadas seqüências ricas em oligonucleotideos AT, GC ou intermediária (IN). Foram avaliados o efeito das seqüências de diferentes tamanhos, estruturas e concentrações na indução de apoptose dos espermatozóides pelo citômetro de fluxo e os índices de transfecção por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que não houve efeito da adição do DNA exógeno sobre a viabilidade espermática. Entretanto, houve efeito do tempo de incubação onde foi observado maior viabilidade espermática com 1 hora de incubação (35,7%). O tempo de incubação não teve efeito na indução de apoptose, mas foi observado efeito no índice de transfecção apresentando maior quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides às 2 horas de incubação. A quantidade, o tamanho e a estrutura de DNA exógeno não influenciaram o índice de apoptose, assim como a quantidade de DNA não teve efeito nos índice de transfecção. Entretanto, foi observado efeito do tamanho e da estrutura do DNA, no qual a seqüência de 5,5kb apresentou melhores resultados de transfecção tanto na quantidade de 500ng e 323ng. A seqüência rica em AT também apresentou melhor resultado de transfecção em relação à seqüência rica em GC e a intermediária. Em conclusão, o tempo de incubação reduziu a viabilidade espermática, porém, aumentou os índices de transfecção. A transfecção dos espermatozóides não foi influenciada pela quantidade da seqüência, mas foi influenciada pelo tamanho e estrutura da seqüência. A apoptose e necrose das células espermáticas não foram influenciadas pela quantidade, tamanho e estrutura do DNA exógeno / Sperm-mediated gene transfer (SMGT) has been used for transgenic animal production because it is a theoretically simple and low cost method. However, results are various and without repetibility. In order to optimize SMGT it is necessary to determine the time, amount and sequence of exogenous DNA for incubation with spermatozoa. The objective of this study was to verify the effect of these three parameters on SMGT. To assess the effect of exogenous DNA addition on sperm viability after 0, 1, 2, 3 and 4 hours of incubation, fluorescent probes Hoechst 33342, propidium iodide, JC-1 and FITC-PSA were used. To evaluate effects of incubation time (60, 90 and 120 minutes) on apoptosis and necrosis rates, spermatozoa were stained with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide and analyzed by flow cytometry; transfection rates were evaluated by real-time PCR. To assess the effect of exogenous DNA amount and sequence, different sized and structured sequences were made. Different sized sequences of 2.2, 5.5 and 8.5kb were used, with concentration of 500ng or 130ng of 2.2 sequence, 500 or 323ng of 5.5 sequence and 500ng of 8.5 sequence. Different structured sequences were rich in AT, GC or intermediate (IN). The effect of different size, structure and concentration on spermatozoa apoptosis induction were analyzed by flow cytometer and transfection rates by real-time PCR. Results show that no effects occurred on spermatozoa viability after exogenous DNA addition. However, time effect occurred: higher spermatozoa viability was observed after 1 hour of incubation (35.7%). Incubation time had no effect on apoptosis induction; otherwise, transfection rates presented higher amounts of exogenous DNA associated to spermatozoa after 2 hours of incubation. Amount, size and structure of DNA did not influence apoptosis and necrosis rates and DNA amount had no effect on transfection rates. However, size and structure effect were observed: 5.5kb sequence presented better transfection results using 500ng or 323ng. AT- rich sequence also presented better transfection rates than GC-rich and IN sequences. In conclusion, incubation time reduced spermatozoa viability, although enhanced the transfection levels. Spermatozoa transfection was not influenced by DNA sequence amount, but was influenced by the size and structure of the sequence. Apoptosis and necrosis of sperm cells were not influenced by amount, size and structure of exogenous DNA

A transferência gênica mediada por espermatozóide (TGME) por ser um método teoricamente simples e barato tem sido usada na produção de animais transgênicos. Entretanto, os resultados são variáveis e inconstantes. Para otimizar a TGME é necessário estabelecer o tempo, a quantidade e o tipo de DNA exógeno que será incubado com os espermatozóides. O estudo dos efeitos destes parâmetros na TGME foi o objetivo deste trabalho. Para avaliar o efeito da adição do DNA exógeno durante 0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação na viabilidade espermática foram utilizadas as sondas fluorescentes Hoechst 33342, Iodeto de propídeo, JC-1 e FITC-PSA. Na avaliação do efeito do tempo de incubação (60, 90 e 120 minutos) nos índices de apoptose e necrose, os espermatozóides foram corados com as sondas fluorescentes Yo-pro e Iodetoto de propídeo e avaliados pelo citômetro de fluxo, e os índices de transfecção avaliados pela PCR em tempo real. Para avaliar o efeito da quantidade e da seqüência de DNA exógeno foram construídas seqüências de tamanhos e estruturas diferentes. Para as seqüências de tamanhos diferentes, foram utilizadas seqüências de 2,2; 5,5 e 8,5kb nas concentrações de 500ng ou 130ng da seqüência de 2,2kb, 323ng da seqüência 5,5kb e 500ng da seqüência de 8,5kb. Para as seqüências de diferentes estruturas foram utilizadas seqüências ricas em oligonucleotideos AT, GC ou intermediária (IN). Foram avaliados o efeito das seqüências de diferentes tamanhos, estruturas e concentrações na indução de apoptose dos espermatozóides pelo citômetro de fluxo e os índices de transfecção por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que não houve efeito da adição do DNA exógeno sobre a viabilidade espermática. Entretanto, houve efeito do tempo de incubação onde foi observado maior viabilidade espermática com 1 hora de incubação (35,7%). O tempo de incubação não teve efeito na indução de apoptose, mas foi observado efeito no índice de transfecção apresentando maior quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides às 2 horas de incubação. A quantidade, o tamanho e a estrutura de DNA exógeno não influenciaram o índice de apoptose, assim como a quantidade de DNA não teve efeito nos índice de transfecção. Entretanto, foi observado efeito do tamanho e da estrutura do DNA, no qual a seqüência de 5,5kb apresentou melhores resultados de transfecção tanto na quantidade de 500ng e 323ng. A seqüência rica em AT também apresentou melhor resultado de transfecção em relação à seqüência rica em GC e a intermediária. Em conclusão, o tempo de incubação reduziu a viabilidade espermática, porém, aumentou os índices de transfecção. A transfecção dos espermatozóides não foi influenciada pela quantidade da seqüência, mas foi influenciada pelo tamanho e estrutura da seqüência. A apoptose e necrose das células espermáticas não foram influenciadas pela quantidade, tamanho e estrutura do DNA exógeno / Sperm-mediated gene transfer (SMGT) has been used for transgenic animal production because it is a theoretically simple and low cost method. However, results are various and without repetibility. In order to optimize SMGT it is necessary to determine the time, amount and sequence of exogenous DNA for incubation with spermatozoa. The objective of this study was to verify the effect of these three parameters on SMGT. To assess the effect of exogenous DNA addition on sperm viability after 0, 1, 2, 3 and 4 hours of incubation, fluorescent probes Hoechst 33342, propidium iodide, JC-1 and FITC-PSA were used. To evaluate effects of incubation time (60, 90 and 120 minutes) on apoptosis and necrosis rates, spermatozoa were stained with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide and analyzed by flow cytometry; transfection rates were evaluated by real-time PCR. To assess the effect of exogenous DNA amount and sequence, different sized and structured sequences were made. Different sized sequences of 2.2, 5.5 and 8.5kb were used, with concentration of 500ng or 130ng of 2.2 sequence, 500 or 323ng of 5.5 sequence and 500ng of 8.5 sequence. Different structured sequences were rich in AT, GC or intermediate (IN). The effect of different size, structure and concentration on spermatozoa apoptosis induction were analyzed by flow cytometer and transfection rates by real-time PCR. Results show that no effects occurred on spermatozoa viability after exogenous DNA addition. However, time effect occurred: higher spermatozoa viability was observed after 1 hour of incubation (35.7%). Incubation time had no effect on apoptosis induction; otherwise, transfection rates presented higher amounts of exogenous DNA associated to spermatozoa after 2 hours of incubation. Amount, size and structure of DNA did not influence apoptosis and necrosis rates and DNA amount had no effect on transfection rates. However, size and structure effect were observed: 5.5kb sequence presented better transfection results using 500ng or 323ng. AT- rich sequence also presented better transfection rates than GC-rich and IN sequences. In conclusion, incubation time reduced spermatozoa viability, although enhanced the transfection levels. Spermatozoa transfection was not influenced by DNA sequence amount, but was influenced by the size and structure of the sequence. Apoptosis and necrosis of sperm cells were not influenced by amount, size and structure of exogenous DNA

Durante a anidrobiose (um estado ametabólico muito estável), o nematóide Panagrolaimus superbus tolera vários tipos de estresses físicos. A fim de melhor compreender essa extremotolerância, P. superbus foi submetido a regimes de hiperaceleração (RHA) de até 400.000 x g. Surpreendentemente, foi observado que esse verme tolera a exposição à RHA tanto dessecado (i.e., em anidrobiose) como hidratado. Para verificar se esse fenômeno era específico para essa espécie ou algo observável em outros organismos, os mesmos procedimentos experimentais foram realizados no organismo modelo Caenorhabditis elegans. Intrigantemente, C. elegans também mostrou o mesmo perfil de sobrevivência. Ademais, o desenvolvimento, comportamento, morfologia e crescimento populacional desse nematóide também foram analisados após a exposição ao RHA, não sendo observada quaisquer mudanças nesses parâmetros em função da exposição à hipergravidade. Em seguida, foram realizadas buscas (tBLASTn) no genoma de C. elegans por homólogos de genes relacionados ao gravitropismo que são naturalmente encontrados em plantas. Essa busca resultou nos genes dnj- 16 (homólogo ao ARG1), ipla-1 (homólogo ao SGR2) e uma sequência não caracterizada (homóloga a TWD1). Especial atenção foi despendida ao gene dnj-16, uma vez que é o mais conservado entre eles. As análises de RT-qPCR revelaram que o dnj-16 é ligeiramente regulado para baixo durante o RHA, o que não era esperado caso ele possuísse função semelhante ao seu homólogo em plantas. A análise do estado metabólico desse nematoide durante o RHA lançou luz sobre os dados de RT-qPCR, mostrando que a queda na expressão de dnj-16 é provavelmente devida à centrifugação. Posteriormente, diversas análises in silico foram realizadas a fim de caracterizar o gene dnj-16 e a sua respectiva proteína. Inicialmente, a análise comparativa dos domínios DnaJ, transmembrana e coiled coil das proteínas dnj-16, ARG1, ARL1 e ARL2 apontou para uma grande semelhança não apenas na sequência como na estrutura dessas proteínas. Essa grande similaridade motivou análises para desvendar o papel e a origem do gene dnj-16. Três hipóteses ((i) homologia, (ii) convergência e (iii) transferência gênica horizontal (TGH)) foram consideradas na investigação desse intrigante gene. Os resultados obtidos nas análises in silico apontaram para uma TGH mediada por RNA, potencialmente ocorrida a 1325 m.a., como a hipótese mais plausível para explicar a origem de dnj-16 e algumas espécies parasitas do gênero Phytophthora como prováveis mediadores dessa transferência. Dessa forma, os dados apresentados nessa tese mostram pela primeira vez que C. elegans é tolerante a RHA ordens de magnitude mais altas do que se pensava serem compatíveis com a vida multicelular. Além disso, os dados sugerem que dnj-16 foi transferido horizontalmente de plantas para nematoides e que a ultracentrifugação leva a uma redução no metabolismo de C. elegans, o que ajudaria a explicar a sua sobrevivência sob tal condição extrema. Por fim, o conjunto de dados desse trabalho representa contribuições originais para a compreenção da biologia, da genética e da evolução de C. elegans. / During anhydrobiosis (a very stable ametabolic state), the nematode Panagrolaimus superbus tolerates many types of physical stresses. In order to better understand this extremotolerance, P. superbus underwent hyperacceleration regimes (RHA) of up to 400,000 x g. Surprisingly, it was observed that this worm tolerated RHA exposure both dried (i.e., during anhydrobiosis) and hydrated. In order to verify if this phenomenon was specific for this species or something observable in other organisms, the same experimental procedures were performed in the model organism Caenorhabditis elegans. Intriguingly, C. elegans also showed the same survival profile. In addition, the development, behavior, morphology and population growth of this nematode were also analyzed after the exposure to RHA and no changes were observed in these parameters due to the hypergravity exposure. Thereafter, searches (tBLASTn) were performed on C. elegans genome by homologs of gravitropism related genes that are naturally found in plants. These searches resulted in the genes dnj-16 (homologous to ARG1), ipla-1 (homologous to SGR2) and an uncharacterized sequence (homologous to TWD1). Special attention was given to dnj-16 gene, since it is the most conserved among them. RT-qPCR analyzes revealed that dnj-16 is slightly down regulated during RHA, which was not expected if it had similar function to its homologue in plants. Analysis of the metabolic status of this nematode during RHA shed light on the RT-qPCR data, showing that the decrease in dnj-16 expression was probably due to centrifugation. Subsequently, several in silico analyzes were performed in order to characterize the dnj-16 gene and its respective protein. Initially, the comparative analyzis of the DnaJ, transmembrane and coiled coil domains of dnj-16, ARG1, ARL1 and ARL2 proteins pointed to a great similarity not only in the sequence as well as in the structure of these proteins. This great similarity motivated analyzes in order to uncover the real nature of the dnj-16 gene. Three hypotheses ((i) homology, (ii) convergence and (iii) horizontal gene transfer (HGT)) were considered in the investigation of this intriguing gene. The results obtained in the in silico analyzes indicated an RNA mediated TGH, potentially occurred 1325 my (millions of years), as the most plausible hypothesis to explain the origin of dnj-16 and some parasitic species of the Phytophthora genus as probable mediators of this transference. Therefore, data presented in this thesis show for the first time that C. elegans tolerates RHA of magnitude orders higher than it was thought to be compatible with multicellular life. In addition, the data suggest that dnj-16 was transferred horizontally from plants to nematodes and that ultracentrifugation leads to a reduction in C. elegans metabolism, which would help explain its survival under such extreme condition. Finally, the data set of this work represent original contributions to the understanding of the C. elegans\' biology, genetics and evolution.

A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 &mu;g DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 &mu;L de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 &mu;L. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo. / Growth hormone deficiency (GHD) is conventionally treated with repeated injections of the recombinant hormone. This work aimed at establishing an alternative treatment based on the transfer of the human (hGH) or mouse growth hormone (mGH) genes into lit/lit or lit/scid dwarf mice, using plasmid DNA administration associated with electrotransfer, in order to achieve the maximum growth recovery compared to normal mice (catch-up growth). Administration of the plasmid containing the mGH gene was first carried out in the exposed quadriceps or non-exposed anterior tibialis (TA) muscle. Using different electrotransfer conditions, based on alternate pulses of high (1000 V/cm) and low (100 V/cm) voltage (HV/LV, HV/8LV) or consecutive pulses of low voltage (8 pulses of 150 V/cm), the TA muscle in the HV/LV condition showed the highest levels of mGH expression: 6.7 ± 2.5 ng/mL. Exposure time and amount of the enzyme hyaluronidase (HI) required for electrotransfer were also analyzed. The time of 30 minutes and the dose of 20 U HI provided the best results of expression. Different amounts of DNA were also tested, but the administration of 50 &mu;g DNA/animal was confirmed as the best. In the optimization of the volume of plasmid solution administered to TA, it was observed that injection of 20 &mu;L of DNA showed a significantly higher expression of the protein compared with 10 &mu;L. Aiming at a higher GH expression, an experiment was carried out by adding poly-L-glutamate to the DNA diluent, comparing also different electrotransfer conditions (HV/LV and 375 V/cm). The condition of 375 V/cm, without the polymer addition, provided the higher concentrations of both hGH and mGH in the serum of lit/scid or lit/lit mice, respectively. Using 3 pulses of 375 V/cm and administration of mGH-DNA in two locations on each TA muscle, the highest expression levels of up to 14.7 ± 3.7 ng mGH/mL were obtained. These were the parameters utilized in a bioassay, which was also carried out by measurement of the initial and final femur length by radiography. In this 36-day bioassay, the growth curve of treated lit/lit mice was similar to that of heterozygous untreated mice and the mGH levels of DNA group were significantly higher (P<0.0002) than the control group. Treated mice also showed a higher mIGF-I concentration in the serum compared to the control group. Concerning growth parameters, DNA-treated group showed percentages of increase highly significant compared to the control group, with P<0.001 for body weight and P<0.002 for body, tail and both femurs lengths, with catch-up values of the order of 79% for femur lengths. We can conclude that an efficient non-viral gene transfer methodology has been established, which lead to a complete growth normalization of the dwarf mice through the use of younger animals, as reported in the literature and in a recent paper of our group.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.

A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é tratada convencionalmente com repetidas injeções do hormônio recombinante. Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma alternativa de tratamento baseada na transferência dos genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH), em camundongos anões lit/lit ou lit/scid, mediante administração de DNA plasmidial associada à eletrotransferência, com a finalidade de atingir a máxima recuperação de crescimento em comparação ao camundongo normal (catch-up growth). Inicialmente foi realizada a administração do plasmídeo contendo o gene do mGH no músculo quadríceps exposto ou tibial anterior (TA) não exposto. Utilizando diferentes condições de eletrotransferência, baseadas em pulsos alternados de baixa (100 V/cm) e alta (1000 V/cm) voltagem (HV/LV, HV/8LV) ou em pulsos seguidos de baixa voltagem (8 pulsos de 150 V/cm), o músculo TA na condição HV/LV apresentou os maiores níveis de expressão de mGH: 6,7 ± 2,5 ng/mL. O tempo de exposição e a quantidade da enzima hialuronidase (HI) necessária para a eletrotransferência foram também analisados. O tempo de 30 minutos e a dose de 20 U de HI proporcionaram os melhores resultados de expressão. Diferentes quantidades de DNA foram também testadas, mas a administração de 50 &mu;g DNA/animal foi confirmada como a melhor. Na padronização do volume de solução do plasmídeo administrado no TA, foi observado que a injeção de 20 &mu;L de DNA apresentou expressão significativamente maior da proteína em comparação a de 10 &mu;L. Buscando uma maior expressão de GH, foi realizado experimento adicionando poli-L-glutamato ao diluente do DNA, comparando também diferentes condições de eletrotransferência (HV/LV e 375 V/cm). A condição de 375 V/cm, sem a adição do polímero, proporcionou as maiores concentrações, tanto de hGH como de mGH, no soro de camundongos lit/scid e lit/lit, respectivamente. Quando utilizados 3 pulsos de 375 V/cm e a administração do plasmídeo com o gene do mGH em dois locais de cada músculo TA, foram obtidos os mais altos níveis de expressão atingindo 14,7 ± 3,7 ng mGH/mL. Estes foram os parâmetros utilizados em um bioensaio, no qual foi também determinada a medida do comprimento inicial e final do fêmur por radiografia. Neste bioensaio de 36 dias, a curva de crescimento dos camundongos lit/lit tratados foi similar a de camundongos heterozigotos não tratados e os níveis de mGH do grupo DNA foram significativamente maiores (P<0,0002) em relação ao grupo controle. Os camundongos tratados também apresentarem concentração de mIGF-I no soro superior a do grupo controle. Considerando os parâmetros de crescimento avaliados, o grupo tratado com DNA apresentou percentuais de incremento altamente significativos em relação ao grupo controle, com P<0,001 para o peso corpóreo e P<0,002 para o comprimento do corpo, da cauda e para ambos os fêmures, com valores de catch-up da ordem de 79% para o comprimento dos fêmures. Podemos concluir que foi estabelecida uma metodologia eficiente de transferência gênica não viral, que poderá levar a uma completa normalização de crescimento de camundongos anões mediante utilização de animais mais jovens, como mencionado na literatura e em trabalho recente do nosso grupo. / Growth hormone deficiency (GHD) is conventionally treated with repeated injections of the recombinant hormone. This work aimed at establishing an alternative treatment based on the transfer of the human (hGH) or mouse growth hormone (mGH) genes into lit/lit or lit/scid dwarf mice, using plasmid DNA administration associated with electrotransfer, in order to achieve the maximum growth recovery compared to normal mice (catch-up growth). Administration of the plasmid containing the mGH gene was first carried out in the exposed quadriceps or non-exposed anterior tibialis (TA) muscle. Using different electrotransfer conditions, based on alternate pulses of high (1000 V/cm) and low (100 V/cm) voltage (HV/LV, HV/8LV) or consecutive pulses of low voltage (8 pulses of 150 V/cm), the TA muscle in the HV/LV condition showed the highest levels of mGH expression: 6.7 ± 2.5 ng/mL. Exposure time and amount of the enzyme hyaluronidase (HI) required for electrotransfer were also analyzed. The time of 30 minutes and the dose of 20 U HI provided the best results of expression. Different amounts of DNA were also tested, but the administration of 50 &mu;g DNA/animal was confirmed as the best. In the optimization of the volume of plasmid solution administered to TA, it was observed that injection of 20 &mu;L of DNA showed a significantly higher expression of the protein compared with 10 &mu;L. Aiming at a higher GH expression, an experiment was carried out by adding poly-L-glutamate to the DNA diluent, comparing also different electrotransfer conditions (HV/LV and 375 V/cm). The condition of 375 V/cm, without the polymer addition, provided the higher concentrations of both hGH and mGH in the serum of lit/scid or lit/lit mice, respectively. Using 3 pulses of 375 V/cm and administration of mGH-DNA in two locations on each TA muscle, the highest expression levels of up to 14.7 ± 3.7 ng mGH/mL were obtained. These were the parameters utilized in a bioassay, which was also carried out by measurement of the initial and final femur length by radiography. In this 36-day bioassay, the growth curve of treated lit/lit mice was similar to that of heterozygous untreated mice and the mGH levels of DNA group were significantly higher (P<0.0002) than the control group. Treated mice also showed a higher mIGF-I concentration in the serum compared to the control group. Concerning growth parameters, DNA-treated group showed percentages of increase highly significant compared to the control group, with P<0.001 for body weight and P<0.002 for body, tail and both femurs lengths, with catch-up values of the order of 79% for femur lengths. We can conclude that an efficient non-viral gene transfer methodology has been established, which lead to a complete growth normalization of the dwarf mice through the use of younger animals, as reported in the literature and in a recent paper of our group.

Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática. / Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.

A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é a deficiência mais comum entre os hormônios pituitários. A terapia utilizada atualmente consiste de injeções diárias de hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH), entretanto esta terapia apresenta alguns inconvenientes, como a necessidade de frequentes injeções de r-hGH durante um longo período de vida, dependendo da severidade da deficiência, e o alto custo do hormônio, em razão dos dispendiosos processos de purificação. Uma alternativa ao tratamento padrão seria aquele no qual fossem evitados estes tipos de inconvenientes e o processo de liberação da proteína fosse sustentável, por um longo período e promovesse níveis normais e sustentáveis do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), o principal mediador dos efeitos do GH. Uma alternativa é a terapia gênica in vivo, baseada na administração de DNA plasmidial em diversos órgãos/tecidos, seguida de eletroporação. É considerada uma metodologia bastante promissora e que tem sido alvo de vários estudos para diversos tipos de deficiências sistêmicas. Neste trabalho foram realizadas diversas administrações de um plasmídeo contendo o gene do hormônio de crescimento humano, nos músculos quadríceps exposto ou tibial anterior sem exposição, seguidas de eletroporação, em camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid) com 40-80 dias de idade, na tentativa de obter uma correção fenotípica do nanismo, mediante a avaliação de parâmetros de crescimento. A administração deste plasmídeo no músculo tibial anterior, em camundongos com a idade inicial de 40 dias, foi capaz de proporcionar uma normalização dos níveis de mIGF-I, quando comparados aos dos camundongos não-deficientes de GH. Além disso, foram obtidos valores de catch-up dos parâmetros de crescimento longitudinal de 36-77%. Visando uma maior eficiência na expressão de GH, foram construídos plasmídeos parentais, e a partir destes, foram produzidos minicírculos de DNA com os promotores do CMV e Ubiquitina C e com os cDNAs de hGH e mGH. Estes minicírculos de DNA foram transfectados em células HEK 293 e foram até 2 vezes mais eficientes em relação aos plasmídeos convencionais com o promotor do CMV. Estes dados são bastantes promissores e abrem caminho para ensaios mais eficientes, utilizando este tipo de protocolo de terapia gênica para a DGH, visando uma normalização de todos os parâmetros de crescimento. / The human growth hormone deficiency (GHD) is the most common deficiency related to pituitary hormones. The current therapy is based on daily injections of recombinant human growth hormone (r-hGH). This therapy, however, presents some disadvantages, as the need for frequent injections of r-hGH during a long life time, depending on the deficiency severity and the high cost of this hormone, due to the expensive purification processes. An alternative to the standard treatment should be to avoid these inconveniences via a sustainable hormone release, acting for a long time and providing normal and sustainable levels of insulin-like growth factor-I (IGF-I). A possible alternative is in vivo gene therapy, based on the administration of plasmid DNA in several organs/tissues, followed by electroporation. This methodology is considered very promising and has been the target of many different studies for several types of systemic deficiencies. In the present work several administrations of a plasmid containing the human growth hormone gene were carried out, in the exposed quadriceps or non-exposed tibialis cranialis muscle, followed by electroporation, using immunodeficient dwarf mice 40-80 days old. The goal was to obtain a phenotypic correction of dwarfism, through the evaluation of different growth parameters. The administration of this plasmid, in the tibialis cranialis muscle of 40 day old mice, was able to provide a normalization of mIGF-I levels, when compared to non GHD mice. Furthermore, catch-up increases of longitudinal growth parameters of 36-77% were obtained. Aiming a high efficiency on GH expression, parental plasmids were constructed and from these DNA minicircles were generated with CMV and Ubiquitin C promoter and hGH or mGH cDNA sequences. These DNA minicircles were transfected into HEK 293 cells and were even 2 times moren efficient than conventional plasmids with CMV promoter. This data are very promising and pave the way for more efficient assays utilizing this type of gene therapy protocol for GHD, aiming at a normalization of all growth parameters.

A deficiência de hormônio de crescimento (DGH) é a deficiência mais comum entre os hormônios pituitários. A terapia utilizada atualmente consiste de injeções diárias de hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH), entretanto esta terapia apresenta alguns inconvenientes, como a necessidade de frequentes injeções de r-hGH durante um longo período de vida, dependendo da severidade da deficiência, e o alto custo do hormônio, em razão dos dispendiosos processos de purificação. Uma alternativa ao tratamento padrão seria aquele no qual fossem evitados estes tipos de inconvenientes e o processo de liberação da proteína fosse sustentável, por um longo período e promovesse níveis normais e sustentáveis do fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), o principal mediador dos efeitos do GH. Uma alternativa é a terapia gênica in vivo, baseada na administração de DNA plasmidial em diversos órgãos/tecidos, seguida de eletroporação. É considerada uma metodologia bastante promissora e que tem sido alvo de vários estudos para diversos tipos de deficiências sistêmicas. Neste trabalho foram realizadas diversas administrações de um plasmídeo contendo o gene do hormônio de crescimento humano, nos músculos quadríceps exposto ou tibial anterior sem exposição, seguidas de eletroporação, em camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid) com 40-80 dias de idade, na tentativa de obter uma correção fenotípica do nanismo, mediante a avaliação de parâmetros de crescimento. A administração deste plasmídeo no músculo tibial anterior, em camundongos com a idade inicial de 40 dias, foi capaz de proporcionar uma normalização dos níveis de mIGF-I, quando comparados aos dos camundongos não-deficientes de GH. Além disso, foram obtidos valores de catch-up dos parâmetros de crescimento longitudinal de 36-77%. Visando uma maior eficiência na expressão de GH, foram construídos plasmídeos parentais, e a partir destes, foram produzidos minicírculos de DNA com os promotores do CMV e Ubiquitina C e com os cDNAs de hGH e mGH. Estes minicírculos de DNA foram transfectados em células HEK 293 e foram até 2 vezes mais eficientes em relação aos plasmídeos convencionais com o promotor do CMV. Estes dados são bastantes promissores e abrem caminho para ensaios mais eficientes, utilizando este tipo de protocolo de terapia gênica para a DGH, visando uma normalização de todos os parâmetros de crescimento. / The human growth hormone deficiency (GHD) is the most common deficiency related to pituitary hormones. The current therapy is based on daily injections of recombinant human growth hormone (r-hGH). This therapy, however, presents some disadvantages, as the need for frequent injections of r-hGH during a long life time, depending on the deficiency severity and the high cost of this hormone, due to the expensive purification processes. An alternative to the standard treatment should be to avoid these inconveniences via a sustainable hormone release, acting for a long time and providing normal and sustainable levels of insulin-like growth factor-I (IGF-I). A possible alternative is in vivo gene therapy, based on the administration of plasmid DNA in several organs/tissues, followed by electroporation. This methodology is considered very promising and has been the target of many different studies for several types of systemic deficiencies. In the present work several administrations of a plasmid containing the human growth hormone gene were carried out, in the exposed quadriceps or non-exposed tibialis cranialis muscle, followed by electroporation, using immunodeficient dwarf mice 40-80 days old. The goal was to obtain a phenotypic correction of dwarfism, through the evaluation of different growth parameters. The administration of this plasmid, in the tibialis cranialis muscle of 40 day old mice, was able to provide a normalization of mIGF-I levels, when compared to non GHD mice. Furthermore, catch-up increases of longitudinal growth parameters of 36-77% were obtained. Aiming a high efficiency on GH expression, parental plasmids were constructed and from these DNA minicircles were generated with CMV and Ubiquitin C promoter and hGH or mGH cDNA sequences. These DNA minicircles were transfected into HEK 293 cells and were even 2 times moren efficient than conventional plasmids with CMV promoter. This data are very promising and pave the way for more efficient assays utilizing this type of gene therapy protocol for GHD, aiming at a normalization of all growth parameters.