The parasite Rangelia vitalii is the etiologic agent of rangeliosis, a disease that leads to a wide variety of clinical signs, including hemostatic disorders characterized by bleeding. However, the causes of this process have not been established. The aim of this study was to evaluate the production of megakaryocytes, platelet count, clotting time, platelet activity and to determine the activity of enzymes that hydrolyze nucleotides and adenine nucleosides in platelets of dogs experimentally infected with R. vitalii. For this study, 12 dogs were separated in two groups: Group A was composed by five healthy dogs, and group B composed by seven dogs experimentally infected with R. vitalii. After inoculation, the animals were monitored by blood smears. The parasite was found within erythrocytes, neutrophils and monocytes five days post-inoculation (PI). Blood collection to perform platelet count, coagulation tests and measurement of platelet aggregation was performed on days 0, 10 and 20 PI. On days 10 and 20 PI, after this procedure, the dogs were anesthetized for collecting bone marrow samples to evaluate the production of megakaryocytes. To measure the activity of ectonucleotidases and adenosine deaminase, blood samples were collected on days 12 and 21 PI. Blood samples were stored in tubes containing EDTA to quantification of platelets, evaluation of platelet aggregation and measurement of enzymatic activity. The blood was stored in tubes containing citrate for realization of the clotting time. This study revealed a reduction (P<0.01) of platelet numbers in the infected group when compared to control group. Prothrombin time and active partial thromboplastin time showed no significant difference between infected and control animals. There was an increase (P<0.01) in the number of megakaryocytes in infected group when compared with control group. A reduction (P<0.01) of platelet aggregation was observed in dogs infected with R. vitalii. The hydrolysis of ATP, ADP, AMP and deamination of adenosine decreased (P<0.01) on day 12 PI. On day 21 PI, the activity of adenosine deaminase remained reduced (P<0.01), whereas it was observed an increase (P<0.05) in NTPDase levels. From these results, we can conclude that rangeliosis is responsible for severe thrombocytopenia during the acute phase of infection, and this can be due to splenic sequestration and/or immune-mediated thrombocytopenia. Also, alterations in purinergic system contribute to the occurrence of hemostatic disorders observed in this disease. / O parasito Rangelia vitalii é o agente etiológico da rangeliose, uma enfermidade que cursa com uma grande variedade de sinais clínicos, incluindo desordens hemostáticas caracterizadas por sangramentos. Entretanto, as causas das alterações no processo hemostático nessa doença ainda não foram esclarecidas. O objetivo deste estudo foi avaliar os distúrbios hemostáticos através da produção de megacariócitos e contagem de plaquetas, a coagulação sanguínea, a atividade plaquetária e determinar a atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeo de adenina em plaquetas de cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Para este estudo, 12 cães foram separados em dois grupos: Grupo A foi composto por cinco cães saudáveis, e grupo B com sete cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Após inoculação, os animais foram monitorados quanto à parasitemia por esfregaço sanguíneo. O parasito foi encontrado no interior de hemácias, neutrófilos e monócitos cinco dias pós-inoculação (PI). As coletas de sangue para a realização da contagem plaquetária, testes de coagulação e mensuração da agregação plaquetária foram realizadas nos dias 0, 10 e 20 PI. Nos dias 10 e 20 PI, após esse procedimento, os cães foram anestesiados para coleta do aspirado de medula óssea com a finalidade de avaliar a produção de megacariócitos. Para avaliar a atividade das ectonucleotidases e adenosina desaminase, as coletas de sangue foram realizadas nos dias 12 e 21 PI. Este estudo demonstrou redução (P<0,01) no número de plaquetas entre o grupo infectado em relação ao controle. Os tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativado não apresentaram diferença significativa entre animais infectados e controles. Ocorreu aumento (P<0,01) do número de megacariócitos no grupo infectado quando comparado com o controle. Foi observado uma diminuição (P<0,01) na agregação plaquetária em cães infectados por R. vitalii. A hidrólise de ATP, ADP, AMP e desaminação da adenosina foram reduzidas (P<0,01) no dia 12 PI quando comparadas com o grupo controle. No dia 21 PI, a atividade da adenosina desaminase manteve-se reduzida (P<0,01), enquanto que ocorreu aumento (P<0,05) na atividade da ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase). A partir dos resultados, pode-se concluir que a rangeliose é responsável por grave trombocitopenia na fase aguda da infecção, a qual pode estar associada ao sequestro e/ou destruição imunomediada e, que alterações no sistema purinérgico contribuem para a ocorrência das desordens hemostáticas observadas na infecção pelo parasito R. vitalii.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:53:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mara Rubia Rocha Pereira Sales.pdf: 980226 bytes, checksum: 42a133fd63917e32301d6df4c9b4fca5 (MD5) Previous issue date: 2012-06-26 / The aim of this study was determined by nested-PCR the presence of Ehrlichia canis in dogs located in the municipality of Alegre-ES and evaluate its correlation with morulae and thrombocytopenia. For this purpose blood samples were collected from 85 dogs, regardless of race, age, sex or health status. With these, slides were obtained for the detection of morulae, thrombocytopenia, and execution of nested-PCR technique. We verified a prevalence of 1.17% to investigated the presence of morulae, 5.6% when using the technique of nested-PCR, and was verified that 17.64% of the CBCs were thrombocytopenia. However, only 40% of positive samples by nested-PCR showed thrombocytopenia. The results presented in this study demonstrate that the introduction of molecular diagnostic techniques such as nested-PCR is an important method to aid in the early diagnosis of diseases / Objetivou-se com este estudo determinar por meio da nested-PCR a prevalência da Ehrlichia canis em cães da região de Alegre-ES, e avaliar sua correlação com a presença de mórulas e trombocitopenia. Para isso, foram colhidas amostras sanguíneas de 85 cães, independente de raça, sexo, idade e estado de saúde. Com estas, foram confeccionadas lâminas para a pesquisa de mórulas, trombocitopenia, e execução da técnica de nested-PCR. Foi verificada uma prevalência de 1,17% ao pesquisar a presença de mórulas, 5,6% ao utilizar a técnica da nested-PCR, e foi verificada que 17,64% dos hemogramas apresentavam trombocitopenia. No entanto, somente 40% das amostras positivas pela nested-PCR, apresentaram trombocitopenia. Os resultados apresentados neste estudo demonstram que a introdução de técnicas de diagnóstico molecular como a nested-PCR é um método importante para o auxílio no diagnóstico precoce de patologias

INTRODUÇÃO: A HPN é uma patologia na qual a atividade do sistema complemento, sem oposição, leva a complicações sistêmicas. Ela é caracterizada por anemia hemolítica adquirida com hemoglobinúria intermitente, falência medular e fenômenos tromboembólicos (TE). A trombose venosa é a sua principal causa de mortalidade, entretanto o seu mecanismo fisiopatológico é apenas parcialmente elucidado. O grande número de pacientes com trombocitopenia dificulta o manejo da profilaxia antitrombótica secundária e primária. Optou-se por evidenciar o desequilíbrio hemostático associado ao clone HPN através de um teste de avaliação global da coagulação. MÉTODOS: Para a detecção do potencial hemostático de cada indivíduo foi utilizado um ensaio fluorogênico de geração de trombina, em amostra de plasma pobre em plaquetas na presença e na ausência de trombomodulina (TM). A eficiência na redução do potencial de trombina endógeno (ETP) e da concentração máxima de trombina (pico) pela TM foi utilizada para a identificação do estado de hipercoagulabilidade. O tempo para o início da geração de trombina (tempo de latência) e para a concentração máxima de trombina foram utilizados para a detecção do fenótipo hemorrágico. Os indivíduos foram categorizados em três grupos: HPN, se clone HPN >= 10%; anemia aplástica idiopática adquirida ou associada a clone < 10%, e normais. Os pacientes e controles foram submetidos a avaliação laboratorial que incluiu pesquisa de trombofilia (TB) e do clone HPN, hemograma, testes habituais de avaliação da hemostasia, e no grupo de pacientes análise bioquímica. Os participantes foram avaliados para a identificação da presença de fatores de risco para TE através de questionário. A análise dos resultados foi realizada em duas fases: a primeira incluiu apenas indivíduos com pesquisa de TB negativa e sem fatores de risco para TE; a segunda, realizada apenas no grupo de pacientes, também incluiu indivíduos em uso de contraceptivo hormonal, diagnóstico de infecção assintomática, evento de TE associado a fator de risco temporário, em período superior a 1 ano da inclusão no estudo, e com pesquisa de TB positiva. Esta última fase da análise teve como objetivo incluir um maior número de pacientes com o diagnóstico destas patologias, de baixa prevalência populacional. RESULTADOS: A presença do clone >= 10% foi associada à ineficiência da ação da TM em reduzir o ETP e o pico. O primeiro, de maior relevância científica e clínica, apresentou correlação positiva e negativa, respectivamente, com a atividade do fator von Willebrand (FvW:RCo) e com níveis plasmáticos de proteína C (PC). O grupo HPN apresentou menor tempo para atingir o pico. Na segunda fase, o tempo de latência apresentou correlação negativa com o número de plaquetas no grupo HPN, e houve correlação positiva do clone com a ineficiência da ação da TM na redução do ETP. CONCLUSÕES: o teste de geração de trombina é eficaz na detecção do fenótipo protrombótico associado ao clone HPN. As correlações encontradas com o FvW:RCo e a PC sugerem que a ativação endotelial e o sistema da PC, respectivamente, podem estar comprometidos. A inflamação secundária à ativação do sistema complemento pode levar à redução de expressão endotelial da TM e do receptor da PC. Entretanto os nossos achados, associados à descrição recente da redução de expressão e de atividade da TM, secundária à depleção de óxido nítrico (em estudos com estatinas), podem justificar a característica agressiva da trombofilia na HPN, e o desenvolvimento de TE mesmo nos pacientes em anticoagulação oral. Os parâmetros que avaliam o \'tempo\' no trombograma (tempo de latência e tempo para o pico) podem auxiliar na identificação do risco hemorrágico eventualmente associado à HPN / INTRODUCTION: PNH is a pathology in which the uncontrolled activity of the complement system leads to systemic complications. The pathology is characterized by an acquired hemolytic anemia with intermittent hemoglobinuria, bone marrow failure and thromboembolic event (TE). Venous thrombosis is the main cause of death, however, its physiopathological mechanism is only partially understood. The large number of patients with thrombocytopenia affects the management of primary and secondary antithrombotic prophylaxis. We chose to demonstrate the hemostatic unbalance associated with PNH clone through a global evaluation of the coagulation test. METHODS: To detect the hemostatic potential, we used a fluorogenic thrombin-generation assay, in platelet-poor plasma, with and without throbomodulin (TM). Analysis of the efficiency of TM in reducing the endogenous thrombin potential (ETP) and of the upper limit of thrombin concentration (peak) was done to identify the hypercoagulable state. Times to initiate thrombin generation (latency time-LT) and for reaching the peak were used to identify hemorrhagic phenotypes. Subjects were divided in three groups: PNH patients (if PNH clone >= 10%), patients with acquired idiopathic aplastic anemia or clone-associated (clone < 10%), and controls. Patients and controls were investigated for thrombophilia (TB) and PNH clone, underwent blood test, and regular exams to evaluate hemostasis. Patients were evaluated for the presence of risk factors for TE through questionnaires. Results were analyzed in two steps: the first included only patients negative for TB and with no risk factors for TE; the second step, done only in patients, included individuals using hormonal contraceptive, diagnosis of any asymptomatic infection, TE associated to temporary risk factors, and which have occurred in a period longer than one year since inclusion in the study, and positive TB. The aim of the second step was to gather the largest possible number of patients in these low prevalence pathologies. RESULTS: The presence of the clone >= 10% was associated with TM inefficiency in reducing the ETP (ETP+TM) and peak. In the first analysis, which had greater clinical relevance, we observed a positive correlation between ETP+TM and the activity of the von Willebrand factor (FvW:RCo), whereas a negative correlation was observed with the levels of protein C (PC). The PNH group presented the shortest time to reach the peak. In the second step of the analysis, the LT showed negative correlation with platelet counts in the PNH group, whereas a positive correlation between the clone and ETP+TM was observed. CONCLUSION: The thrombin-generation assay effectively detects the prothrombotic phenotype associated to PNH. The correlation found with both FvW:RCo and PC suggests that endothelial activation, and the PC system as well, may be deficient in these patients. Secondary inflammation to activation of the complement system may lead to lower endothelial expression of TM and of the PC receptor. However, our findings, together with recent descriptions of a reduced expression of the TM activity secondary to nitric oxide depletion (observed in studies on statin) may explain the aggressive nature of thrombophilia in PNH and the development of TE in these patients, even in those taking oral anticoagulants. The parameters that measure the time of thrombin generation may help identify the hemorrhagic risk that might be associated with PNH

A trombocitopenia induzida por heparina (TIH) é uma síndrome imunohematológica mediada por um anticorpo que causa ativação plaquetária na presença de heparina, induz à agregação plaquetária e pode estar associada a graves e paradoxais complicações trombóticas e morte. A freqüência de TIH nos pacientes que recebem heparina por mais de cinco dias é de 1% a 5%, e está relacionada a vários fatores. Este é um estudo pioneiro no Brasil, que objetivou avaliar aqui a freqüência de TIH nos pacientes em uso de heparina, a relação ao gênero, ao tipo de heparina e a associação do genótipo da FcRIIa de receptores plaquetários. Foram selecionados 278 pacientes das Unidades de Terapia Intensiva e Unidades Coronariana do InCor-HCFMUSP, que receberam anticoagulação por heparina não fracionada (HNF) e/ou heparina de baixo peso molecular (HBPM), por pelo menos 5 dias, e excluídas as possíveis causas conhecidas de trombocitopenia. Foi realizada a contagem plaquetária pré e pós terapia com heparina, e o teste de detecção do anticorpo anti-fator 4 plaquetário/heparina (ID-PaGIA, DiaMed; e Asserachrom®-HPIA, Stago). O estudo da genotipagem da FcRIIa de receptores plaquetários foi realizado pelo método de digestão com enzima de restrição alelo específica. A freqüência de TIH encontrada foi de 6 (2,2%), e a freqüência de trombocitopenia com a presença do anticorpo anti-fator 4 plaquetário foi de 24,3%. A análise do gênero do paciente não demonstrou correlação com a TIH, nem com a trombocitopenia e nem com o anticorpo anti-fator 4 plaquetário. As mulheres apresentaram mais trombose do que os homens. A trombocitopenia ocorreu com maior freqüência nos pacientes que utilizaram os dois tipos de heparina (HNF-HBPM) e, com menor freqüência, nos que utilizaram apenas HBPM. O genótipo da FcRIIa de receptores plaquetários não apresentou relação com o gênero, nem com a TIH. Este estudo determinou a freqüência de TIH em uma população brasileira com uso de heparina e auxiliou no diagnostico. O melhor teste para detectar o anticorpo anti-fator 4 plaquetário/heparina, na presença de trombocitopenia e trombose, foi o teste de imunoaglutinação ID-PaGIA (DiaMed). A utilização dos dois tipos de heparina promoveu uma maior freqüência de trombocitopenia. Porém, novos estudos precisam confirmar as relações entre o tipo de heparina, com a trombocitopenia e com a TIH / Heparin induced thrombocytopenia (HIT) is an immune-hematologic syndrome mediated by a heparin dependent antibody that causes platelet activation, platelet aggregation, and can be associated with thrombosis and death. HIT occurs in about 1-5% of patients receiving heparin therapy up to 5 days or more. Many factors influence on the frequency of HIT. This is a pioneer Brazilian study to determine the frequency of HIT on patients under heparin therapy, and the relationship of HIT with gender, heparin type and the FcRIIa platelet receptor genotype. 278 patients from the Intensive Care Unit and Cardiac Care Unit at InCor-HCFMUSP treated with Unfractionated Heparin (UFH) and/or Low Molecular Weight Heparin (LMWH) for 5 or more days were studied. Known causes of thrombocytopenia were excluded. Platelet count was monitored pre and post heparin therapy. All selected patients were tested for detection of anti-heparin/PF4 antibody (ID-PaGIA, DiaMed; and Asserachrom®-HPIA, Stago). HIT frequency found was 6 (2,2%) and the frequency of thrombocytopenia (determined by a decrease in the platelet count below 50%, after the introduction of heparin therapy) and positive anti-heparin/PF4 antibody test was 24,3%. Patients gender was not related to TIH, neither to thrombocytopenia nor to the presence of antiheparin/ PF4 antibody. Thrombosis events were more frequent in women than in men. Thrombocytopenia, related to the type of heparin, was more frequent in patients that had used both types of heparin and less frequent in those that used only LMWH. FcRIIa platelet receptor genotype was associated with neither HIT nor with gender. This study has provided the frequency of HIT in a Brazilian patient population under heparin therapy and auxiliary in the HIT diagnosis. The ID-PaGIA (DiaMed) was shown to be the best test to correlate the presence of anti-heparin/PF4 antibody to thrombocytopenia and thrombosis event. The use of both heparin types promotes more thrombocytopenia. New studies are needed to confirm the relationship between heparin type and thrombocytopenia with HIT

INTRODUÇÃO: A HPN é uma patologia na qual a atividade do sistema complemento, sem oposição, leva a complicações sistêmicas. Ela é caracterizada por anemia hemolítica adquirida com hemoglobinúria intermitente, falência medular e fenômenos tromboembólicos (TE). A trombose venosa é a sua principal causa de mortalidade, entretanto o seu mecanismo fisiopatológico é apenas parcialmente elucidado. O grande número de pacientes com trombocitopenia dificulta o manejo da profilaxia antitrombótica secundária e primária. Optou-se por evidenciar o desequilíbrio hemostático associado ao clone HPN através de um teste de avaliação global da coagulação. MÉTODOS: Para a detecção do potencial hemostático de cada indivíduo foi utilizado um ensaio fluorogênico de geração de trombina, em amostra de plasma pobre em plaquetas na presença e na ausência de trombomodulina (TM). A eficiência na redução do potencial de trombina endógeno (ETP) e da concentração máxima de trombina (pico) pela TM foi utilizada para a identificação do estado de hipercoagulabilidade. O tempo para o início da geração de trombina (tempo de latência) e para a concentração máxima de trombina foram utilizados para a detecção do fenótipo hemorrágico. Os indivíduos foram categorizados em três grupos: HPN, se clone HPN >= 10%; anemia aplástica idiopática adquirida ou associada a clone < 10%, e normais. Os pacientes e controles foram submetidos a avaliação laboratorial que incluiu pesquisa de trombofilia (TB) e do clone HPN, hemograma, testes habituais de avaliação da hemostasia, e no grupo de pacientes análise bioquímica. Os participantes foram avaliados para a identificação da presença de fatores de risco para TE através de questionário. A análise dos resultados foi realizada em duas fases: a primeira incluiu apenas indivíduos com pesquisa de TB negativa e sem fatores de risco para TE; a segunda, realizada apenas no grupo de pacientes, também incluiu indivíduos em uso de contraceptivo hormonal, diagnóstico de infecção assintomática, evento de TE associado a fator de risco temporário, em período superior a 1 ano da inclusão no estudo, e com pesquisa de TB positiva. Esta última fase da análise teve como objetivo incluir um maior número de pacientes com o diagnóstico destas patologias, de baixa prevalência populacional. RESULTADOS: A presença do clone >= 10% foi associada à ineficiência da ação da TM em reduzir o ETP e o pico. O primeiro, de maior relevância científica e clínica, apresentou correlação positiva e negativa, respectivamente, com a atividade do fator von Willebrand (FvW:RCo) e com níveis plasmáticos de proteína C (PC). O grupo HPN apresentou menor tempo para atingir o pico. Na segunda fase, o tempo de latência apresentou correlação negativa com o número de plaquetas no grupo HPN, e houve correlação positiva do clone com a ineficiência da ação da TM na redução do ETP. CONCLUSÕES: o teste de geração de trombina é eficaz na detecção do fenótipo protrombótico associado ao clone HPN. As correlações encontradas com o FvW:RCo e a PC sugerem que a ativação endotelial e o sistema da PC, respectivamente, podem estar comprometidos. A inflamação secundária à ativação do sistema complemento pode levar à redução de expressão endotelial da TM e do receptor da PC. Entretanto os nossos achados, associados à descrição recente da redução de expressão e de atividade da TM, secundária à depleção de óxido nítrico (em estudos com estatinas), podem justificar a característica agressiva da trombofilia na HPN, e o desenvolvimento de TE mesmo nos pacientes em anticoagulação oral. Os parâmetros que avaliam o \'tempo\' no trombograma (tempo de latência e tempo para o pico) podem auxiliar na identificação do risco hemorrágico eventualmente associado à HPN / INTRODUCTION: PNH is a pathology in which the uncontrolled activity of the complement system leads to systemic complications. The pathology is characterized by an acquired hemolytic anemia with intermittent hemoglobinuria, bone marrow failure and thromboembolic event (TE). Venous thrombosis is the main cause of death, however, its physiopathological mechanism is only partially understood. The large number of patients with thrombocytopenia affects the management of primary and secondary antithrombotic prophylaxis. We chose to demonstrate the hemostatic unbalance associated with PNH clone through a global evaluation of the coagulation test. METHODS: To detect the hemostatic potential, we used a fluorogenic thrombin-generation assay, in platelet-poor plasma, with and without throbomodulin (TM). Analysis of the efficiency of TM in reducing the endogenous thrombin potential (ETP) and of the upper limit of thrombin concentration (peak) was done to identify the hypercoagulable state. Times to initiate thrombin generation (latency time-LT) and for reaching the peak were used to identify hemorrhagic phenotypes. Subjects were divided in three groups: PNH patients (if PNH clone >= 10%), patients with acquired idiopathic aplastic anemia or clone-associated (clone < 10%), and controls. Patients and controls were investigated for thrombophilia (TB) and PNH clone, underwent blood test, and regular exams to evaluate hemostasis. Patients were evaluated for the presence of risk factors for TE through questionnaires. Results were analyzed in two steps: the first included only patients negative for TB and with no risk factors for TE; the second step, done only in patients, included individuals using hormonal contraceptive, diagnosis of any asymptomatic infection, TE associated to temporary risk factors, and which have occurred in a period longer than one year since inclusion in the study, and positive TB. The aim of the second step was to gather the largest possible number of patients in these low prevalence pathologies. RESULTS: The presence of the clone >= 10% was associated with TM inefficiency in reducing the ETP (ETP+TM) and peak. In the first analysis, which had greater clinical relevance, we observed a positive correlation between ETP+TM and the activity of the von Willebrand factor (FvW:RCo), whereas a negative correlation was observed with the levels of protein C (PC). The PNH group presented the shortest time to reach the peak. In the second step of the analysis, the LT showed negative correlation with platelet counts in the PNH group, whereas a positive correlation between the clone and ETP+TM was observed. CONCLUSION: The thrombin-generation assay effectively detects the prothrombotic phenotype associated to PNH. The correlation found with both FvW:RCo and PC suggests that endothelial activation, and the PC system as well, may be deficient in these patients. Secondary inflammation to activation of the complement system may lead to lower endothelial expression of TM and of the PC receptor. However, our findings, together with recent descriptions of a reduced expression of the TM activity secondary to nitric oxide depletion (observed in studies on statin) may explain the aggressive nature of thrombophilia in PNH and the development of TE in these patients, even in those taking oral anticoagulants. The parameters that measure the time of thrombin generation may help identify the hemorrhagic risk that might be associated with PNH

A trombocitopenia induzida por heparina (TIH) é uma síndrome imunohematológica mediada por um anticorpo que causa ativação plaquetária na presença de heparina, induz à agregação plaquetária e pode estar associada a graves e paradoxais complicações trombóticas e morte. A freqüência de TIH nos pacientes que recebem heparina por mais de cinco dias é de 1% a 5%, e está relacionada a vários fatores. Este é um estudo pioneiro no Brasil, que objetivou avaliar aqui a freqüência de TIH nos pacientes em uso de heparina, a relação ao gênero, ao tipo de heparina e a associação do genótipo da FcRIIa de receptores plaquetários. Foram selecionados 278 pacientes das Unidades de Terapia Intensiva e Unidades Coronariana do InCor-HCFMUSP, que receberam anticoagulação por heparina não fracionada (HNF) e/ou heparina de baixo peso molecular (HBPM), por pelo menos 5 dias, e excluídas as possíveis causas conhecidas de trombocitopenia. Foi realizada a contagem plaquetária pré e pós terapia com heparina, e o teste de detecção do anticorpo anti-fator 4 plaquetário/heparina (ID-PaGIA, DiaMed; e Asserachrom®-HPIA, Stago). O estudo da genotipagem da FcRIIa de receptores plaquetários foi realizado pelo método de digestão com enzima de restrição alelo específica. A freqüência de TIH encontrada foi de 6 (2,2%), e a freqüência de trombocitopenia com a presença do anticorpo anti-fator 4 plaquetário foi de 24,3%. A análise do gênero do paciente não demonstrou correlação com a TIH, nem com a trombocitopenia e nem com o anticorpo anti-fator 4 plaquetário. As mulheres apresentaram mais trombose do que os homens. A trombocitopenia ocorreu com maior freqüência nos pacientes que utilizaram os dois tipos de heparina (HNF-HBPM) e, com menor freqüência, nos que utilizaram apenas HBPM. O genótipo da FcRIIa de receptores plaquetários não apresentou relação com o gênero, nem com a TIH. Este estudo determinou a freqüência de TIH em uma população brasileira com uso de heparina e auxiliou no diagnostico. O melhor teste para detectar o anticorpo anti-fator 4 plaquetário/heparina, na presença de trombocitopenia e trombose, foi o teste de imunoaglutinação ID-PaGIA (DiaMed). A utilização dos dois tipos de heparina promoveu uma maior freqüência de trombocitopenia. Porém, novos estudos precisam confirmar as relações entre o tipo de heparina, com a trombocitopenia e com a TIH / Heparin induced thrombocytopenia (HIT) is an immune-hematologic syndrome mediated by a heparin dependent antibody that causes platelet activation, platelet aggregation, and can be associated with thrombosis and death. HIT occurs in about 1-5% of patients receiving heparin therapy up to 5 days or more. Many factors influence on the frequency of HIT. This is a pioneer Brazilian study to determine the frequency of HIT on patients under heparin therapy, and the relationship of HIT with gender, heparin type and the FcRIIa platelet receptor genotype. 278 patients from the Intensive Care Unit and Cardiac Care Unit at InCor-HCFMUSP treated with Unfractionated Heparin (UFH) and/or Low Molecular Weight Heparin (LMWH) for 5 or more days were studied. Known causes of thrombocytopenia were excluded. Platelet count was monitored pre and post heparin therapy. All selected patients were tested for detection of anti-heparin/PF4 antibody (ID-PaGIA, DiaMed; and Asserachrom®-HPIA, Stago). HIT frequency found was 6 (2,2%) and the frequency of thrombocytopenia (determined by a decrease in the platelet count below 50%, after the introduction of heparin therapy) and positive anti-heparin/PF4 antibody test was 24,3%. Patients gender was not related to TIH, neither to thrombocytopenia nor to the presence of antiheparin/ PF4 antibody. Thrombosis events were more frequent in women than in men. Thrombocytopenia, related to the type of heparin, was more frequent in patients that had used both types of heparin and less frequent in those that used only LMWH. FcRIIa platelet receptor genotype was associated with neither HIT nor with gender. This study has provided the frequency of HIT in a Brazilian patient population under heparin therapy and auxiliary in the HIT diagnosis. The ID-PaGIA (DiaMed) was shown to be the best test to correlate the presence of anti-heparin/PF4 antibody to thrombocytopenia and thrombosis event. The use of both heparin types promotes more thrombocytopenia. New studies are needed to confirm the relationship between heparin type and thrombocytopenia with HIT

Introdução: Trombocitopenia é a redução dos níveis plaquetários ocasionada por diversas condições, como hepatopatias e a Trombocitopenia Imune (TI), por exemplo. A redução de plaquetas na hepatopatia pode ocorrer devido à deficiência medular por hipovitaminose, aumento do consumo celular e hiperesplenismo e/ou devido à coagulação intravascular disseminada. Na Trombocitopenia Imune, a redução plaquetária ocorre tanto por maior destruição destas células quanto por diminuição medular de sua produção. Portadores de trombocitopenia podem apresentar achados orais como petéquias e/ou equimoses e sangramento gengival, espontâneo ou provocado. Procedimentos cirúrgico-odontológicos nestes pacientes devem ser realizados com cautela, após avaliação do seu quadro clínico e, preferencialmente, por profissional especializado. Muita controvérsia ainda existe em relação à abordagem cirúrgico-odontológica destes pacientes tanto em relação aos níveis plaquetários, quanto em relação à reposição plaquetária prévia, não havendo ainda, um protocolo internacionalmente estabelecido. Diversos métodos hemostáticos locais auxiliam durante este tipo de abordagem, sendo o agente a base de quitosana um dos métodos que têm se mostrado efetivo em diversos estudos e apresenta-se, ainda, menos oneroso que o selante de fibrina, por exemplo, um dos métodos mais utilizados. Objetivo: Desta forma, o objetivo desta pesquisa foi observar e descrever o desempenho clínico do agente a base de quitosana em pacientes com contagem plaquetária <= a 30.000/mm3 (Grupo Quitosana) submetidos a exodontias unitárias, utilizando como padrão de comparação o grupo de pacientes trombocitopênicos com contagem plaquetária entre 31.000 e 50.000/mm3 (Grupo Controle), submetidos a exodontias unitárias, sem o uso do curativo hemostático a base de quitosana e ainda, descrever o atendimento odontológico a pacientes com contagem plaquetária inferior a 50.000/mm3 . Casuística e métodos: Pacientes trombocitopênicos com contagem abaixo de 50.000/mm3 foram submetidos a exodontias unitárias, estando divididos em Grupo Quitosana(GQ):pacientes com plaquetas abaixo de 30.000/mm3, que receberam o agente a base de quitosana após a extração e, Grupo Controle(GC): pacientes com plaquetas entre 31.000/mm3 e 50.000/mm3 e que não receberam o agente a base de quitosana. O sangramento foi observado 7 dias após a exodontia através do Índice de Sangramento Alveolar Pós- Exodontia (ISAPE) e para análise estatística foi utilizado o programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 20.0; nível de significância de 5% (p=0,05), e realizado o teste de Mann-Whitney, análise de Correlação de Spearman e, teste do Chi-Quadrado e Fator de risco com intervalo de confiança (IC) de 95%. Resultados: Foram realizadas 41 exodontias unitárias entre 03/2011 e 09/2012. A média de idade dos pacientes estudados foi de 46,58 ±10,87anos, com mediana de 48,50 (variando de 20 a 64). Dentre eles, 51,20% (n=21) eram do gênero feminino e 48,79% (n=20) do masculino. 21 procedimentos foram incluídos no GQ e, 20 procedimentos, no GC. O GQ apresentou contagem plaquetária entre 5.000 e 30.000/mm3 e ISAPE médio de 0,10; sendo que 2 (9,52%) pacientes tiveram ISAPE acima de zero. Já o GC apresentou plaquetas entre 31.000 e 50.000/mm3, ISAPE médio de 0,40 e 6 (30%) pacientes com ISAPE acima de zero. Não houve significância estatística em relação ao ISAPE. Discussão: Até o presente momento não foram encontrados outros trabalhos nos moldes da presente pesquisa nas bases de dados pesquisadas (Lilacs, Medline, Bireme). Inúmeros trabalhos buscam estabelecer a contagem plaquetária mínima necessária para um paciente ser submetido à cirurgia odontológica e ainda, quando será indicada reposição plaquetária prévia. Em ambos os aspectos a literatura se mostra controvérsia, havendo autores que indicam reposição plaquetária prévia a pacientes com plaquetas em torno de 100.000/mm3, e autores que relatam que cirurgias orais simples, como as exodontias unitárias, podem ser realizadas de forma segura sem reposição plaquetária em pacientes com plaquetas em torno de 30.000/mm3. Não existe atualmente um protocolo de atendimento estabelecido internacionalmente. O ISAPE não apresentou significância estatística entre os grupos estudados, aspecto possivelmente influenciado pela heterogeneidade dos grupos e/ou ainda, pelo número reduzido da amostra. Porém, a porcentagem dos pacientes que apresentaram ISAPE maior que 0 mostra efetividade do agente hemostático em 90,48% do GQ, concordando com Belman et al.(2006), Brown et al.(2007) e Wedmore et al.(2006) que mostram 80,0%, 79,0% e 97,0%, respectivamente. Conclusão: Não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao desempenho clínico hemostático do curativo a base de quitosana. Foi possível descrever o protocolo de atendimento a pacientes trombocitopênicos efetivo e resolutivo, já utilizado rotineiramente na Divisão de Odontologia HC-FMUSP / Introduction: Thrombocytopenia is an abnormally low amount of platelets caused by many conditions as liver disorders and immune thrombocytopenia for example. The reduction of platele count in liver disorders may be caused by bone marrow deficiency due to hypovitaminosis, hypersplenism and disseminated intravascular coagulation while in immune thrombocytopenia may be caused by greater desctruction of these cells or its diminished production by the bone marrow. Patients with thrombocytopenia may present oral manifestations as petechiae and/or ecchymosis and provoked/spontaneous gingival bleeding. In these patients, surgical dental procedures should be performed with caution and only after a detailed medical assessment, preferably performed by a specialist. The dental management of patients with thrombocytopenia is still controversial regarding the amount of platelets and the need of platelet infusion prior to these procedures. To this date, no clinical guidelines has been developed regarding the dental management of patients with thrombocytopenia. Many hemostatic agents has been used to control post surgical bleeding. Many studies had shown thay chitosan is effective and cheaper than fibrin sealant, one of the most popular hemostatic agents. Objetive: This study was design to assess the effect of chitosan as a local haemostatic agent in patients with platelet count <= 30.000/mm3 compared to patients with thrombocytopenia and platelet count of 31.000/mm3 to 50.000/mm3 submitted to single dental extraction and to describe the protocol for dental treatment of patients with platelet count lower than 50.000/mm3 in a tertiary health science center. Methods: Patients with thrombocytopenia with platelet count lower than 50.000/mm3 were assessed. Patients with platelet count lower than 30.000/mm3 (study group) and patients with platelet count of 31.000/mm3 to 50.000/mm3 (control group) were submitted to single dental extraction. Chitosan was used only in the study group and no other type of hemostatic agent was used in the control group. Bleeding was measured according to the post dental extraction index (ISAPE) seven days after dental extraction. The results were statistically analyzed using the Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 20.0 program. For statistical analysis, the Mann-Whitney test, Chi-square test, Spearman\'s rank correlation coeficient and confidence interval for relative risk (95%) were used. P< 0.05 was considered statistically significant. Results: Forty-one single dental extractions were performed between March/2011 and September/2012. The mean age of patients was 46,58 ±10,87 years of age. Median was 48,50 ranging from 20 to 64 years of age. Fifty-one percent (n=21) were females and 48,79% (n=20) males. Twenty-one extarctions were performe in the Chitosan group and 20 in the control group. Chitosan group presented platelet count of 5.000 to 30.000/mm3 and mean ISAPE médio of 0,10; where two patients (9.52%) had ISAPE greater than zero Control group presented with platelet count of 31.000 to 50.000/mm3, mean ISAPE of 0,40 and six patients (30%) with ISAPE greater than zero. No statistical significance was related to the ISAPE between groups. Discussion: The dental management of patients with thrombocytopenia is still controversial regarding the amount of platelets and the need of platelet infusion prior to these procedures. To this date, no clinical guidelines has been developed regarding the dental management of patients with thrombocytopenia. Many studies have tried to establish the minimal platelet count and the need of platelet infusion prior to oral surgery. Unfortunately, the scientific literature is controversial. Some authors recommend platelet infusion prior to oral surgery in patients with platelel count of 100.000/mm3 while others report that single extractions can be performed safely in patients with platelet count 30.000/mm3. In our study, the ISAPE was not stastistically diferent between groups, what may be explained by the heterogenicity of patients in both groups and by the small sample. However, the greater amount of patients (90%) who presented ISAPE greater 0 showed the effectiveness of chitosan as a hemostatic agent in agreement with previous authors as Belman et al.(2006), Brown et al.(2007) e Wedmore et al.(2006) that presented 80,0%, 79,0% e 97,0%, respectively. Conclusion: No difference was found regarding the effectiveness of chitosan as hemostatic agent between groups. A clinical guideline was developed on dental management of patients with thrombocytopenia and since then it has been used daily at the Department of Dentistry HC-FMUSP

Pacientes envenenados pela serpente Bothrops jararaca manifestam uma tendência hemorrágica em que a plaquetopenia é um achado consistente. Manifestações clínicas sistêmicas, como sangramento de mucosas e microangiopatia trombótica em alguns pacientes, apresentam similaridades com sinais clínicos de doença de von Willebrand e púrpura trombocitopênica trombótica. Algumas proteínas do veneno - como a botrocetina (uma proteína relacionada às lectinas do tipo C) e as metaloproteinases do veneno (SVMP) - interferem direta ou indiretamente na interação entre plaquetas e o fator de von Willebrand (vWF) in vitro e in vivo. E dessa forma, podem contribuir para os sangramentos induzidos pelo envenenamento devido à importância que o vWF tem para a hemostasia primária. Pensando em compreender a participação do vWF do organismo e a botrocetina e as SVMP do veneno bruto de B. jararaca (BjV) na plaquetopenia induzida pelo envenenamento, utilizamos dois modelos experimentais: ratos Wistar heterogênicos e camundongos nocautes do gene Vwf (Vwf-/-). No modelo em ratos, o BjV foi pré-incubado com salina (controle positivo), um inibidor de metaloproteinases (Na2-EDTA), anticorpos policlonais anti-botrocetina, glicerol (veículo dos anticorpos), ou a combinação do Na2-EDTA e anticorpos anti-botrocetina; o grupo controle negativo foi injetado somente com salina. Após a administração subcutânea (s.c.) dos venenos tratados (1,6 mg/kg), amostras de sangue foram coletadas após 3, 6 ou 24 h, e analisaram-se a contagem de plaquetas, quantificação antigênica (vWF:Ag) e da atividade de ligação do vWF ao colágeno (vWF:CB), a atividade de ADAMTS13, a distribuição multimérica de vWF, e a atividade coagulante de fator VIII (FVIII). Para explorar a participação do vWF na plaquetopenia, camundongos nocautes de vWF (Vwf-/-) e camundongos controles (C57BL/6) foram injetados s.c. com BjV incubado com salina (grupo positivo do envenenamento) ou apenas salina (grupo controle negativo). As injeções dos tratamentos, bem como os períodos analisados foram idênticos aos dos ratos. Em nossos resultados, todos os ratos injetados com algum tratamento de BjV, inclusive nos animais que receberam veneno pré-tratado com anticorpo anti-botrocetina e/ou Na2-EDTA, apresentaram plaquetopenia, com maior intensidade em 6 h. Na avaliação do vWF foi encontrada uma grande variação individual nos grupos de tratamentos, porém ainda assim houve uma tendência a redução nos níveis de vWF:Ag em 3 e 6 h nos ratos que receberam BjV sem inibidores. A administração de BjV tratado somente com anticorpo anti-botrocetina promoveu uma maior redução nos níveis de vWF:Ag em 3 h, com retorno aos níveis semelhantes aos de controle negativo em 6 h e 24 h. A inibição sozinha das metaloproteinases não promoveu efeito importante, porém em 6 h, potencializou a ação do anticorpo anti-botrocetina na inibição conjunta do decréscimo de vWF:Ag e vWF:CB. A análise dos multímeros do vWF mostrou perfis bastante variáveis individualmente, porém os multímeros de alto peso molecular e intermediário tenderam a diminuir e os de baixo peso a aumentar nos animais que receberam algum tratamento com BjV, especialmente em 24 h. Na dosagem de FVIII, houve redução em 3 e 6 h em todos os ratos que receberam qualquer tratamento de BjV, sem grandes variações entre esses grupos. A atividade de ADAMTS13 apresentou uma redução dos valores em 3 e 6 h, que foi revertida pela inibição das metaloproteinases do veneno. Já nos camundongos, a plaquetopenia esteve presente em todos os animais nocautes e controles que receberam BjV, mostrando ser independente da presença de vWF. Nos camundongos controles (C57BL/6), não houve alterações evidentes em vWF:Ag durante o envenenamento, porém em 3 h houve uma tendência a sua diminuição. Em conjunto, nossos resultados mostram que a presença da botrocetina no veneno bruto não afeta a plaquetopenia desencadeada pelo envenenamento, porém influencia o vWF plasmático quantitativa e funcionalmente. As metaloproteinases do veneno têm forte efeito sobre a enzima fisiológica reguladora da atividade biológica do vWF, a ADAMTS13, que indiretamente pode afetar os níveis de vWF. Ademais, a intensidade da plaquetopenia durante o envenenamento de B. jararaca não depende da presença de vWF, e tendo em conta o caráter multifatorial do consumo plaquetário durante o envenenamento, sugerimos que outros mecanismos possam ser responsáveis pela plaquetopenia induzida pelo BjV. Com isso, concluímos que o consumo de vWF no envenenamento por B. jararaca é um fator contribuinte, porém não determinante, para as alterações da contagem plaquetária / Patients bitten by Bothrops snakes manifest a bleeding tendency in which thrombocytopenia is consistently observed. Systemic clinical manifestations, such as mucous bleeding and thrombotic microangiopathy in some patients, share similarities with symptoms of von Willebrand disease and thrombotic thrombocytopenic purpura. Some venom proteins - e.g. botrocetin (a C-type lectin-related protein) and snake venom metalloproteinases (SVMP) - disturbs, direct or indirectly, the interaction between platelets and von Willebrand factor (vWF) in vitro and in vivo, and may contribute thereby to snakebite-induced bleedings, once vWF is required for primary hemostasis. To better understand the relation between plasma vWF, and botrocetin and SVMPs from B. jararaca crude venom (BjV) in the thrombocytopenia induced by envenomation, we used two experimental models: Wistar heterogenic rats and vWF knockout mice (Vwf-/-). In the rat model, BjV was pre-incubated with saline (positive control), metalloproteinase inhibitor (Na2-EDTA), polyclonal anti-botrocetin antibodies, glycerol (antibody vehicle), or the combination of Na2-EDTA and anti-botrocetin antibodies; the negative control group was injected with saline only. After subcutaneous injection (s.c.) of treated venom (1.6 mg/kg), blood samples were collected after 3, 6 or 24 h, and platelet count, vWF antigen (vWF:Ag) and collagenbinding activity (vWF:CB), ADAMTS13 activity, vWF multimer distribution, and factor VIII (FVIII) coagulant activity were analyzed. To investigate the participation of vWF in thrombocytopenia, vWF knockout mice (Vwf-/-) and control mice (C57BL/6) were injected s.c. with saline only (negative control group) or BjV pre-incubated with saline (positive control group). The same protocols used for rats were accomplished in mice. Our results showed that all rats injected with any BjV treatment, including animals which received anti-botrocetin antibodies and/or Na2-EDTA-treated BjV, showed thrombocytopenia, with the nadir at 6h. vWF analysis exhibited a large individual variation among treatment groups, but there was a tendency to reduce vWF:Ag levels at 3 and 6 h in rats that received BjV pre-incubated with saline (without any inhibitor). Administration of BjV pre-incubated only with anti-botrocetin antibodies evoked a large reduction in vWF:Ag levels at 3 h, which returned to levels similar to those of the negative control group at 6 and 24 h. SVMP inhibition alone did not induce an important effect, but potentialized the activity of anti-botrocetin antibodies to inhibit the fall in both vWF:Ag and vWF:CB levels at 6 h. VWF multimer analysis had a large individual profile variation, although animals that received any BjV treatment tended to decrease the high and intermediate molecular weight multimers and to increase the low ones, especially at 24 h. FVIII showed diminished levels in all rats that received any BjV treatment at 3 and 6 h, without important variations among groups. Decreased levels of ADAMTS13 activity were noticed at 3 and 6 h, which were reverted by SVMP inhibition. In mice, thrombocytopenia was present in all control and knockout mice that received BjV, demonstrating independence of vWF presence. In control mice (C57BL/6), there were no relevant alterations in vWF:Ag during envenomation, although at 3 h there was a tendency to decrease it. Al together, our results showed that botrocetin present in crude venom does not affect thrombocytopenia induced by envenomation, but it changes the levels and function of plasma vWF. SVMP had a marked effect in ADAMTS13, the physiological enzyme that regulates vWF biological activity, which may affect vWF levels indirectly. In addition, thrombocytopenia during B. jararaca envenomation is independent of vWF, and considering the multifactorial features of platelet consumption during envenomation, we suggest that other mechanisms might account for BjV-induced thrombocytopenia. Therefore, we conclude that vWF consumption during B. jararaca envenomation is an ancillary mechanism, but not the main one to decrease platelet counts

INTRODUÇÃO: Dengue é uma doença viral prevalente e potencialmente fatal associada à alteração da permeabilidade capilar e coagulopatia. Entretanto, não há estudos concernentes aos achados tromboelastométricos nesta doença. Realizamos o presente estudo para analisar pacientes com dengue e plaquetopenia por meio de um exame rápido, efetivo e a beira leito comparando com os exames convencionais de coagulação. MÉTODOS: Trata-se de um estudo observacional e transversal conduzido entre os dias 6 de abril a 5 de maio de 2015, em São Paulo, Brasil, durante epidemia de dengue. Foi realizado tromboelastometria ROTEM® em 53 pacientes com dengue e trombocitopenia em associação com exames convencionais de coagulação: tempo de protrombina (TP), international normalized ratio (INR), tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa), tempo de trombina (TT), contagem de plaquetas, fibrinogênio e d-dímero. Um grupo controle de pacientes foi estabelecido para comparação do status tromboelastométrico. RESULTADOS: Um total de 38 pacientes de 53 (71,7%) apresentaram anormalidades no INTEM e 29/53 (57,4%) no EXTEM. Em contrapartida, alterações no FIBTEM foram encontradas apenas em 3/53 (5,7%). Houve significância estatística em pacientes correlacionando alterações tromboelastométricas no EXTEM e INTEM e contagem de plaquetas (p=0,052) e (p=0,005), respectivamente; assim como os valores de fibrinogênio (p=0,006) e (p=0,021), respectivamente. O grupo controle (GC) apresentou status tromboelastométrico normal em 10/10 (100%) na análise do INTEM, EXTEM, FIBTEM. Avaliação do EXTEM demonstrou significância estatística entre o GC e o grupo Dengue: CT (p=0,044); CFT (p<0,001); MCF (p < 0,001) e Alpha (p < 0,001). Foram observados níveis normais de fibrinogênio (mediana: 290) e altos níveis de d-dímero (mediana: 1330) com IQR (800-1840). Todos os pacientes (53/53) apresentavam trombocitopenia abaixo de 100 x 109/L (mediana 77 x 109/L) IQR (63-88). Exames convencionais de coagulação revelaram-se completamente normais: TP (mediana: 100%) IQR (90-100); INR (mediana: 1,0) IQR (1,0-1,1); TTPa (mediana: 28,9 segundos) IQR (26,0-32,5) e TT (mediana: 18,2 segundos) IQR (17,0-19,5). Apenas (7/49) 14,3% pacientes apresentaram sangramento e (3/52) 5,8% necessitou de hospitalização. Não houve associação entre alterações tromboelastométricas com sangramento ou hospitalização. CONCLUSÕES: Dengue representa um processo inflamatório intenso, mantendo níveis normais de fibrinogênio. Portanto, FIBTEM mantém-se normal promovendo boa formação do coágulo sem risco imediato de sangramento. Não houve correlação entre os achados tromboelastométricos com os exames convencionais de coagulação, sugerindo que testes viscoelásticos são exames mais sensíveis para análise de coagulopatia precoce nessa população / INTRODUCTION: Dengue is a prevalent and potentially fatal viral disease associated with plasma leakage and coagulopathy, though no information is available on thromboelastometric profile. We performed this study to analyze dengue fever patients with thrombocytopenia clot changes through point-ofcare thromboelastometry tests and standard coagulation tests. METHODS: This was an observational, transversal and cross sectional study conducted between April 6th and May 5th 2015 in São Paulo, Brazil, during a dengue outbreak. Thromboelastometry ROTEM® was performed in 53 patients with dengue and thrombocytopenia, in association with conventional coagulation tests: prothrombin time (PT), international normalized ratio (INR), activated partial thromboplastin time (aPTT), thrombin time (TT); platelet count, fibrinogen level, and d-dimer. A control group of 10 patients was established to compare thromboelastometry profiles. RESULTS: A total of 38 patients in 53 (71,7%) had abnormalities in INTEM, 29 in 53 (57,4%) in EXTEM. Conversely, FIBTEM was abnormal in 3/53 (5,7%). Statistical analysis revealed significant relation in those patients with impairment EXTEM and INTEM with lowered platelet (p=0,052) and (p=0,005) respectively and lowered fibrinogen levels (p=0,006) and (p=0,021) respectively. Control group (CG) had normal status in 10/10 (100%) of INTEM, EXTEM, FIBTEM analysis. EXTEM analysis demonstrated statistical differences between CG and dengue group: CT (p=0,044); CFT (p < 0,001); MCF (p < 0,001) and Alpha (p < 0,001). Normal levels of fibrinogen (median: 290) and high levels of ddimer (median: 1330) IQR (800-1840) were found. All patients (53/53) had platelet under 100 x 109/L (median 77 x 109/L) IQR (63-88). Standard coagulation tests were completely normal: PT (median: 100%) IQR (90-100); INR (median: 1,0) IQR (1,0-1,1); aPTT (median: 28,9 seconds) IQR (26.0- 32,5) and TT (median: 18,2 seconds) IQR (17,0-19.5). Only (7/49) 14,3% patients had bleeding manifestations and (3/52) 5,8% needed hospitalization. There was no association between altered thromboelastometry with bleeding manifestations or hospitalization. CONCLUSIONS: Dengue represents an intense inflammatory process, maintaining normal levels of fibrinogen. FIBTEM remains normal providing good clot strength without immediate bleeding risk. There were no correlation between thromboelastometry findings and standard coagulation exams, suggesting that viscoelastic tests are more sensible method to analyze early coagulation impairments in this population

Trombocitopenia e diminuição da função plaquetária são achados comuns em pacientes picados por serpentes do gênero Bothrops. Sabe-se que o veneno de Bothrops jararaca (VBj) apresenta compostos com características pró e anti-agregantes plaquetárias, porém existem poucos estudos sobre a influência do veneno total assim como das principais famílias de proteínas que o compõem sobre as funções plaquetárias. A utilização de modelos experimentais é essencial para entender as desordens plaquetárias em humanos que culminam em sangramentos diversos. Portanto, o objetivo deste estudo foi (i) comparar as respostas ex vivo de plaquetas lavadas de humanos e de camundongos frente ao VBj, assim como entender a participação de serinaproteinases (SVSP) e metaloproteinases (SVMP) presentes no veneno sobre a agregação dessas plaquetas; e (ii) delimitar dentro do complexo proteico do veneno os compostos que induzem a trombocitopenia em camundongos após 3 horas do início do envenenamento botrópico. As plaquetas lavadas de humanos e camundongos BALB/c, C57BL/6 e do mutante natural pérola (Ap3b1-/-) apresentaram respostas de agregação máxima ao VBj na concentração de 24,4 ?g/mL, porém esta concentração provocou uma agregação menos intensa em plaquetas humanas quando comparada àquela observada nas linhagens BALB/c e C57BL/6. Mesmo em plaquetas de camundongos pérolas, deficientes em corpos densos plaquetários, o VBj se mostrou um potente agonista, promovendo a agregação plaquetária sem a necessidade da secreção do conteúdo granular. A ação agonista do veneno promoveu a secreção de ATP presente nos corpos densos plaquetários de humanos e das linhagens BALB/c e C57BL/6 de forma tão intensa quanto à provocada pela trombina, assim como a secreção de PF4 presente nos grânulos ? de plaquetas humanas e de camundongos BALB/c. Já em relação à secreção lisossomal, observou-se que as plaquetas humanas secretam níveis mais baixos de ?-hexosaminidase quando estimuladas com VBj do que pela trombina, enquanto que em plaquetas de camundongos BALB/c a secreção lisossomal ao VBj foi superior à constatada com a trombina. Os baixos níveis de lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante das plaquetas estudadas mostraram ausência de atividade direta citotóxica pelo VBj. Para verificar se as principais classes de famílias de enzimas do VBj, SVMP e SVSP, estavam envolvidas na ativação plaquetária ex vivo, elas foram inibidas com Na2EDTA (13 mM) e AEBSF (8 mM), respectivamente. Observou-se que em plaquetas humanas as serinaproteases são importantes para a agregação ex vivo, enquanto a agregação das plaquetas de camundongos BALB/c foi independente dessa classe de toxinas. Os resultados dos ensaios in vivo demonstraram que as proteínas do VBj com peso molecular inferior a 50 kDa (UF < 50 kDa) são importantes para o estabelecimento da trombocitopenia em camundongos BALB/c que receberam essa fração por via subcutânea e que esse quadro é independente de manifestações hemorrágicas e do desenvolvimento de coagulopatia durante o envenenamento botrópico. A caracterização dos compostos presentes no UF < 50 kDa foi realizada por espectrometria de massas e foi observada a presença predominante de metaloproteinases (37%) e proteínas similares às lectinas do tipo-C (33%), enquanto serinaproteases (17%), fosfolipases A2 (10%) e outros compostos (3%) somaram 30% da fração UF < 50 kDa. Em conclusão, o veneno é um potente agonista plaquetário que promove agregação, aglutinação e secreção de plaquetas humanas e de camundongos, independente da secreção de corpos densos plaquetários, e a fração do veneno responsável pela trombocitopenia em camundongos BALB/c tem peso molecular menor que 50 kDa / Thrombocytopenia and platelet dysfunction are common findings in patients bitten by Bothrops jararaca snakes. Pro- and anti-aggregating toxins have been isolated from Bothrops jararaca venom (BjV), but only few studies have been carried out about the effects of crude BjV and its main families of enzymes on platelet function ex vivo, as well as to understand their relevance to the pathophysiological events that occur during B. jararaca envenomation. Animal models have been used to understand platelet disorders in humans that culminate in bleeding manifestations. Thus, the aim of this study was to investigate (i) the effects of BjV, and snake venom serine proteinases (SVSP) and snake venom metalloproteinases (SVMP) contained therein, on aggregation and secretion in suspensions of washed human and mouse platelets, and (ii) to determine the BjV fractions, obtained by ultrafiltration, that induce thrombocytopenia in BALB/c mice after 3 h of administration of Bothrops envenomation. Washed platelets from humans and BALB/c, C57BL/6 and pearl (Ap3b1-/-) mice showed maximal aggregation responses to BjV at the concentration of 24.4 ?g/mL. However, this concentration aggregated less intensely platelets from humans than BALB/c or C57BL/6 mice. Even in pearl mouse platelets, which are deficient in dense bodies, BjV proved to be a potent agonist, promoting platelet aggregation without the requirement of granule content secretion. Nonetheless, BjV induced secretion of ATP, present in dense bodies, and PF4, present in ? granules, in the same extent as thrombin, from platelets of humans and mice. In regard to lysosomal secretion, it was observed that human platelets secreted low ?-hexosaminidase levels when stimulated by BjV than thrombin, whereas in BALB/c platelets higher secretion was induced by BjV than by thrombin. Release of lactate dehydrogenase (LDH) was similar between BjV and thrombin, evidencing the absence of cytotoxic activity by BjV on platelets. Inhibition of SVMP and SVSP, using Na2EDTA (13 mM) and AEBSF (8 mM), respectively, demonstrated that SVSP are important for ex vivo aggregation only in human platelets, whilst BALB/c platelet aggregation was independent of both of them. In in vivo studies, only BjV toxins with molecular weight less than 50 kDa (UF50) caused thrombocytopenia when administered s.c. to BALB/c mice, and it was independent of hemorrhagic manifestations and consumptive coagulopathy. Characterization by mass spectrometry of these toxins present in UF50 showed the predominant presence of SVMP (37%) and type-C lectin proteins (33%) were observed, while SVSP (17%), phospholipases A2 (10%) and other proteins (3%) accounted for the remaining toxins in UF50. In conclusion, BjV is a potent platelet activating agent that promotes aggregation, agglutination and secretion of human and mouse platelets, independent of secretion of dense platelet bodies, and the fraction of venom responsible for thrombocytopenia in BALB / c mice has a molecular weight less than 50 kDa