Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431159-Texto+Completo-0.pdf: 8354772 bytes, checksum: 8abf5160038abef327a3d35aa522175e (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis is a chronic infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis that requires urgent new efforts towards its treatment and cure face the emergence of drug-resistant strains, its world spreading, the increasing number of infected patients among immune compromised populations, and the large number of latent infected individuals that are reservoir to the disease. Nucleotides metabolism pathways provide promising molecular targets for the development of novel drugs against active tuberculosis and might also target its latent forms. The orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) enzyme of the de novo pyrimidine synthesis pathway catalyzes the reversible phosphoribosyl transfer from 5'-phospho-α-D-ribose 1'-diphosphate (PRPP) to orotic acid (OA), forming orotidine 5’-monophosphate (OMP), precursor of remaining pyrimidine nucleotides. This work describes cloning, amplification and characterization of M. tuberculosis H37Rv pyrE gene as encoding a functional OPRT, its apparent and true kinetic constants for forward and reverse reactions, product inhibition profile, and kinetic mechanism assignment as Mono-Iso Ordered Bi Bi, not previously described for an enzyme member of type I phosphoribosyltransferase family. Thermodynamic constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates binding patterns identification. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial OPRT is essential to structure-based drug development, aiming to advance towards tuberculosis control. Resulting data from enzyme’s characterization were the starting point for OPRT specific inhibitors planning, selection and testing.A starting compound was identified as promising lead molecule, with values in nanomolar range, and was further submitted to several chemical replacement experiments, leading to a derived molecule with lower inhibitory constants and improved thermodynamic discrimination profile. Both compounds identified were characterized as competitive and uncompetitive inhibitors towards OPRT substrates OA and PRPP, respectively. Advantage of M. tuberculosis unique kinetic mechanism among homologues OPRTs was taken in order to plan a specific molecule that might trap the enzyme in a noncatalytic ternary complex E ∙ PRPP ∙ I, both inhibiting pyrimidine synthesis and sequestering PRPP from cellular pool, thereby affecting other metabolic pathways. M. tuberculosis OPRT characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for tuberculosis treatment and prophylaxis. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial nucleotide metabolism and provide pertinent data to advance towards specific molecular targets inhibitors development, aiming tuberculosis control. / A tuberculose é uma doença infecciosa crônica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorrência do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrangência global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; além do grande número de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservatório da doença. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleotídeos são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, catalisa a transferência reversível do grupamento fosforibosil da molécula de 5’-fosfo-α-Dribose 1’-difosfato (PRPP) para o ácido orótico (OA), formando orotidina 5’- monofosfato (OMP), molécula precursora dos demais nucleotídeo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplificação e caracterização do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determinação de suas constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para as reações direta e inversa; ensaio de inibição pelos produtos; e a determinação do mecanismo cinético da reação como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que até então não havia sido descrito para uma enzima pertencente à família das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos naturais da enzima com seu sítio de ligação.A caracterização da reação catalisada pela enzima OPRT micobacteriana é uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de ação específica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracterização da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, seleção e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentração de nanomolar, foi identificado como potencial composto líder, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatizaçao química, permitindo a obtenção de uma molécula derivada com valores de constantes inibitórias e perfil de discriminação termodinâmica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em relação aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cinético de reação da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de moléculas capazes de formar um complexo ternário não catalítico (E ∙ PRPP ∙ I), inibindo a síntese de nucleotídeos de pirimidina e sequestrando moléculas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metabólicos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreensão do metabolismo de nucleotídeos de micobactérias e fornecem informações relevantes para o avanço do desenvolvimento de inibidores de ação seletiva sobre alvos moleculares específicos para o tratamento e profilaxia da tuberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431160-Texto+Completo-0.pdf: 3328131 bytes, checksum: 1424b077ac248005607b13af54a688e0 (MD5) Previous issue date: 2011 / The increasing incidence of resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, combined with co-infection of the human immunodeficiency virus and the absence of new anti-tuberculosis therapy in recent years highlight the need for discovery of new therapeutic agents for the treatment of tuberculosis. Seeing from previous studies that shikimate pathway of Mycobacterium tuberculosis is essential for survival of the organism, the prediction of inhibitors for chorismate synthase, the seventh enzyme of this route, open up the possibility of development of new anti-mycobacterial chemotherapy. In this work, using computational techniques of molecular modeling, virtual screening, and molecular dynamics, was possible to elucidate the molecular interaction of chorismate synthase with its substrate and cofactor, and propose three potential inhibitors for this enzyme, contributing to early research on compounds with potential anti-tuberculosis. / O aumento da incidência de cepas resistentes de Mycobacterium tuberculosis, aliados a co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana e a ausência de novas terapias anti-tuberculose nos últimos anos, evidenciam a necessidade da descoberta de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. Considerando, a partir estudos anteriores, que a via metabólica do ácido chiquímico do Mycobacterium tuberculosis é essencial para sobrevivência do organismo, a predição de inibidores para corismato sintase, sétima enzima desta rota, abre a possibilidade de desenvolvimento de novas quimioterapias anti-micobacterianas. Neste trabalho, através de técnicas computacionais de modelagem molecular, virtual screening e dinâmica molecular, foi possível elucidar aspectos moleculares importantes da interação da corismato sintase com seu substrato e cofator, bem como, propor três potenciais inibidores para esta enzima, contribuíndo como início de uma pesquisa sobre compostos com potencial farmacológico anti-tuberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000424566-Texto+Completo-0.pdf: 2168714 bytes, checksum: 2f865a2656e725b28201a2b328378a5c (MD5) Previous issue date: 2010 / Molecular docking is one of the main stages of Rational Drug Design (RDD). This is a method that provides a better orientation and conformation in which a molecule will bind to another to form a stable complex. Most docking algorithms consider flexible ligands, due to their usually small size. On the other hand, because the receptor is generally a molecule consisting of a larger number of atoms, it is treated as rigid. However, protein molecules are naturally flexible, and to consider such flexibility throughout the docking process is still not an easy task. The motivation for developing this work came from the need to perform molecular docking simulations in a more realistic manner, considering the dynamics and plasticity of a receptor molecule. Among the various ways to consider the receptor flexibility, our approach was to use a molecular dynamics simulation (MD) to generate the different conformations of the receptor. In this study we have investigated the effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis by performing molecular docking simulations in each of the different conformations of the enzyme (wild-type, and I16T and I21V mutants), produced by MD, with the inhibitors ethionamide (ETH), triclosan (TCL) and isoniazid-pentacyanoferrate II (PIF).With the flexible model of the receptor, the experiments produced a series of snapshots of InhA inhibitors used in this study, showing different modes of ligand binding, which could not be evaluated using a single conformation of the crystal structure (PDB ID: 1ENY). Our analysis showed that for the InhA-ETH complex, only 5 residues interacted with the ligand in the crystal structure, whereas 80 residues along the trajectory made contacts with the ETH in the flexible model. Similarly, for the InhA-TCL complex only 2 residues of the crystal structure interacted with the ligand, while in the flexible receptor model, we found 46 residues interacting with the TCL. Finally, for the complex InhA-PIF, we found that 2 residues of the receptor interacted with the ligand in the crystal structure, and on the other hand, 35 residues interacted with PIF in the flexible model. This suggests that the flexible receptor model can accommodate a more diverse set of conformations of the ligand. When considering the plasticity of the receptor to perform a docking simulation, it means that the amino acid residues, loops and turns of the receptor can move slightly in different directions, allowing the ligand to explore spaces in the binding site that would have not been possible before. We believe that this work is helping to build knowlege of the importance of receptor flexibility in molecular docking process, and paves the way for further investigation. / A docagem molecular é uma das principais etapas do processo de Rational Drug Design (RDD). Este é um método que prevê a melhor orientação e conformação na qual uma molécula se ligará à outra, de modo a formar um complexo estável. Os algoritmos de docagem atuais consideram o ligante flexível, devido ao seu tamanho geralmente pequeno. Já o receptor, por ser uma molécula composta por um número maior de átomos, é tratado como rígido. Porém, proteínas são moléculas naturalmente flexíveis, e considerar esta flexibilidade durante um processo de docagem ainda não é uma tarefa fácil. A motivação para desenvolver este trabalho surgiu da necessidade de realizar simulações de docagem molecular mais realísticas, que considerem a dinâmica e a plasticidade de uma molécula receptora. Dentre as diversas formas de considerar a flexibilidade do receptor, usamos uma simulação de dinâmica molecular (DM) para gerar as diferentes conformações do receptor. Investigamos o efeito da flexibilidade explícita da enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis através da realização de simulações de docagem molecular em cada uma das diferentes conformações da mesma (tipo selvagem e mutantes I16T e I21V) obtidas por DM, com os inibidores etionamida (ETH), triclosan (TCL) e isoniazidapentacianoferrato II (PIF). Com o modelo flexível do receptor, os experimentos produziram um conjunto de snapshots dos inibidores da InhA utilizados neste estudo, mostrando diferentes modos de ligação do ligante, que não poderiam ser avaliados com base em uma única conformação da estrutura cristalina (PDB ID: 1ENY). Nossa análise revelou que para o complexo InhA-ETH, apenas 5 resíduos interagiram com o ligante, na estrutura cristalina, enquanto que 80 resíduos ao longo da trajetória fizeram contatos com a ETH no modelo flexível. Para o complexo InhATCL apenas 2 resíduos da estrutura cristalina interagem com o ligante, e no modelo de receptor flexível, encontramos 46 resíduos interagindo com o TCL. Finalmente, para o complexo InhAPIF, verificamos que 2 resíduos do receptor interagiram com o ligante na estrutura cristalina, enquanto que para o modelo flexível encontramos 35 resíduos interagindo com PIF. Isto sugere que o modelo de receptor flexível pode acomodar um conjunto mais diversificado de conformações do ligante. Considerar a plasticidade do receptor ao realizarmos uma simulação de docagem significa que os resíduos de aminoácidos, alças e voltas do receptor, podem mover-se ligeiramente em diferentes direções permitindo que o ligante possa então explorar espaços no sítio de ligação que antes não seria possível. Acreditamos que este trabalho está ajudando a construir o conhecimento sobre a importância da flexibilidade do receptor no processo de docagem molecular, e possibilita uma investigação mais aprofundada no futuro.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 3 000399964-Texto+Completo+Parte+A-0.pdf: 18391919 bytes, checksum: af1c2f20c95ef9a171c3d3fc299fe1e4 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+B-1.pdf: 11500816 bytes, checksum: 2d0b16c2a821b4adbb77c7b4d4f28602 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+C-2.pdf: 17810555 bytes, checksum: f216fc25091f70f4980a1f7a25ffde6b (MD5) Previous issue date: 2007 / Tuberculosis (TB) remains the leading cause of mortality due to a single bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The reemergence of tuberculosis as a potential public health threat, the high susceptibility of human immunodeficiency virus-infected persons to the disease, the proliferation of multi-drug-resistant strains (MDR-TB) and, more recently, of extensively drug resistant isolates (XDR-TB) have created a need for the development of new antimycobacterial agents. There is an ongoing need for innovation in proposing new structural scaffolds for chemotherapeutic agent development to control TB. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hidroxy fatty acids, which appear mostly as bound esters in the mycobacterial envelope. Isoniazid (INH) is the most prescribed chemotherapeutic agent for active TB and prophylaxis and requires activation by the catalase-peroxidase activity of KatG. The product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) has been shown to be the primary target for INH. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP reductase specific for long chain enoyl thioesters. InhA is a member of the mycobacterial Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. The main focus of our contribution is on data describing the mode of action of an inorganic complex, pentacyano (isoniazid) ferrateII that requires no KatG-activation and is an in vitro slow-onset inhibitor of WT and INH-resistant M. tuberculosis enoyl reductases. This inorganic complex represents a new class of lead compounds to the development of anti-tubercular agents aiming the inhibition of a validated target. We also describe the recent developments in the search for inorganic complexes with anti-tubercular activity. / A tuberculose (TB) continua sendo a principal causa de mortalidade devido a um único patógeno bacteriano, Mycobacterium tuberculosis. A reemergência da tuberculose como uma ameaça potencial à saúde pública, a alta suscetibilidade de pessoas infectadas com o vírus da imunodeficiência humana à doença, a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB) e, mais recentemente, de cepas extensivamente resistentes às drogas (XDR-TB) criaram a necessidade do desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. Existe uma necessidade contínua de inovação em propor novas estruturas para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos para o controle da TB. Os ácidos micólicos, característicos de micobactérias, são ácidos graxos α-alquil, β-hidróxi de alto peso molecular que aparecem, principalmente, como ésteres ligados ao envelope micobacteriano. A isoniazida (INH) é o agente quimioterápico mais prescrito para a TB ativa e para a profilaxia e necessita de ativação pela atividade de catalase-peroxidase da KatG. O produto do gene estrutural M. tuberculosis inhA (InhA) demonstrou ser o alvo primário da INH. A InhA foi identificada como uma enoil-ACP redutase dependente de NADH, possuindo especificidade por enoil tioésteres de cadeia longa. InhA é um membro do sistema de biossíntese de ácidos graxos micobacterianos do tipo II que elonga ácidos graxos acilados, precursores dos ácidos micólicos. O foco principal de nossa contribuição são dados descrevendo o modo de ação de um complexo inorgânico, pentaciano (isoniazida) ferrato II que não necessita de ativação pela KatG. Ademais é um inibidor do tipo ligação lenta da enoil redutase WT e resistente à INH de M. tuberculosis. Este complexo inorgânico representa uma nova classe de compostos líderes para o desenvolvimento de agentes antituberculose objetivando a inibição de um alvo validado.Nós também descrevemos os avanços recentes na busca por complexos inorgânicos com atividade antituberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407067-Texto+Completo-0.pdf: 3459051 bytes, checksum: d1b647d03a940c703ad0b5b801bad1d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains the leading cause of mortality due to a bacterial pathogen. The proliferation rate of multidrugand extensively drug-resistant strains of M. tuberculosis is increasing worldwide. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism to identify promising targets for the development of new anti-TB agents. In bacteria, pyrimidine nucleotide interconversion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. The gene (cmk, Rv1712) encoding cytidine monophosphate kinase (CMK) enzyme has been proposed by sequence homology to be present in the genome of M. tuberculosis. Here we describe PCR amplification and cloning of cmk gene, expression and purification of its product to homogeneity, and N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses of the recombinant protein. Results of steady-state kinetics showed that M. tuberculosis cmk gene encodes a monomeric CMK that phosphorylates preferentially CMP and dCMP, and that UMP is a poor substrate. These results reinforce the presence of a nucleoside monosphosphate kinase specific for UMP in M. tuberculosis. Double-reciprocal plots of steady-state kinetic results were consistent with ternary complex formation and sequential mechanism for M. tuberculosis CMK reaction. A plausible role for CMK in M. tuberculosis is discussed. / A tuberculose (TB), doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é a maior causa de morte por agente infeccioso do mundo. O aumento da incidência de cepas multi-resistentes (MDR-TB) e extensivamente resistentes (XDR-TB) tem contribuído para o aumento do número de mortes. Por este motivo, há a necessidade de estudos para identificarmos, no metabolismo da micobactéria, possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas capazes de combater estas novas cepas. Em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biosíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. O gene (cmk, Rv1712) que codifica a enzima citidina monofosfato quinase (CMK) foi descrito, por homologia de seqüência, no genoma de M. tuberculosis. Neste trabalho o gene cmk foi amplificado por PCR e clonado em vetor de expressão. A proteína CMK foi expressa em grande escala e purificada. O produto homogêneo desta purificação sofreu seqüenciamento N-terminal e espectrometria de massa. Os resultados da cinética em estado estacionário mostraram que o gene cmk de M. tuberculosis codifica a proteína monomérica CMK, que fosforila preferencialmente CMP e dCMP, e que UMP é um substrato pobre. Estes resultados reforçam a presença de uma nucleotídeo monofosfato quinase específica para UMP em M. tuberculosis. Os parâmetros cinéticos fornecidos pelo ensaio e análise dos gráficos de duplo-recíproco mostraram que a enzima forma um complexo ternário e que seu mecanismo é seqüencial. Um possível papel para a enzima CMK é discutido.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431138-Texto+Completo-0.pdf: 1089028 bytes, checksum: b3d0bb2ab98885aab405ecc4329e3335 (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis (TB) is the major cause of human mortality from a curable infectious disease, attacking mainly in developing countries. Among targets identified in Mycobacterium tuberculosis genome, enzymes of the shikimate pathway deserve special attention, since they are essential to the survival of the microorganism and absent in mammals. The object of our study is shikimate kinase (SK), the fifth enzyme of this pathway. We applied virtual screening methods in order to identify new potential inhibitors for this enzyme. In this work we employed MOLDOCK program in all molecular docking simulations. Accuracy of enzyme-ligand docking was validated on a set of 12 SK-ligand complexes for which crystallographic structures were available, generating root-mean square deviations below 2. 0 Å. Application of this protocol against a commercially available database allowed identification of new molecules with potential to become drugs against TB. Besides, we have identified the binding cavity residues that are essential to intermolecular interactions of this enzyme. / Entre as doenças infecciosas, a tuberculose se destaca, como sendo a principal causa de morte humana, principalmente em países em desenvolvimento. Entre os alvos identificados no genoma de Mycobacterium tuberculosis, as enzimas da via do chiquimato merecem atenção especial, pois são essenciais para a sobrevivência dos microorganismos e ausente em mamíferos. O objeto do nosso estudo é a quinta enzima desta via, a Chiquimato Quinase (SK). Foram aplicados métodos de virtual screening, a fim de identificar novos potenciais inibidores para esta enzima. Neste trabalho nós empregamos o programa MOLDOCK em todas as simulações de docking molecular. A precisão do docking enzima-ligante foi validada em um conjunto de 12 complexos de SK- ligante, para aquelas estruturas cristalográficas que estavam disponíveis, gerando um RMSD abaixo de 2,0 Å. A aplicação deste protocolo em um banco de dados comercialmente disponível permitiu a identificação de novas moléculas com potencial para se tornar drogas contra tuberculose. Além disso, foram identificados os resíduos da cavidade de ligação que são essenciais para as interações intermoleculares desta enzima.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439217-Texto+Completo-0.pdf: 703680 bytes, checksum: 20bc10f7a801c99b27dde05bf2a6dc66 (MD5) Previous issue date: 2012 / Tuberculosis (TB) remains a leading cause of death worldwide, due to the great adaptability of the bacillus, which can survive in various conditions inside and outside the human host. Previous studies showed evidence that polymorphisms in P2X7 receptor are e associated with increased risk of TB. The present study aimed to analyze the role of purinergic P2X7 receptor in M. tuberculosis infection and host interaction mechanisms in vitro and in vivo. The macrophage murine cell line RAW 264. 7 was used for in vitro experiments. Our results demonstrated that treatment of RAW 264. 7 cells with ATP (3 and 5 mM) resulted in a statistically significant reduction of counting colony forming units (CFUs). Male wild-type C57BL/6 (wild-type) and P2X7 receptor KO (P2X7R-/-) mice (25–30 g) were used throughout this study for in vivo. Immunohistochemistry showed that the purinergic P2X7 receptor expression was found significantly augmented in the lungs of mice infected with M. tuberculosis. Furthermore, M. tuberculosis-infected P2X7R-/- mice showed an increase of M. tuberculosis burden in lung tissue, when compared to infected wild type mice. Infected mice showed a marked increase in the spleen weight, in comparison to non-infected animals, indicating the occurrence of splenomegaly. In P2X7R-/- spleens, we observed a significant decrease in the populations of Treg (CD4+Foxp3+), T cells (CD4+, CD8+CD25+ and CD4+CD25+), dendritic cells (CD11c+) and B220+ cells. However, a significant increase in CD11b+ cells was observed in P2X7R-/- mice, when compared to wild-type animals. In the lungs, P2X7R-/- M. tuberculosis-infected mice exhibited pulmonary infiltrates containing an increase of Treg cells (CD4+Foxp3+), T cells (CD4+ and CD8+) and a decrease in the B220+ cells, when compared with wild-type M. tuberculosis-infected mice. The findings observed in the present study provide novel evidence on the role of P2X7 receptors in the pathogenesis and control of tuberculosis. Whether selective agonists or antagonists of this receptor might be useful for improving TB complications remains a matter to be investigated. / A tuberculose (TB) continua sendo uma das principais causas de morte no mundo, devido à grande capacidade de adaptação do bacilo que pode sobreviver em diferentes condições dentro e fora do hospedeiro humano. Estudos prévios mostraram evidências de que polimorfismos no receptor purinérgico P2X7 estão associados ao aumento da suscetibilidade à TB. O presente estudo objetivou analisar o papel do receptor purinérgico P2X7, na infecção por M. tuberculosis em camundongos, e os possíveis mecanismos de interação do receptor P2X7 com o hospedeiro, em modelos in vivo e in vitro. Nos experimentos para avaliação da viabilidade da micobacteria intracelular in vitro foi utilizada a linhagem de macrófagos murinos, RAW 264. 7. Nossos resultados demonstraram que o tratamento das células RAW 264. 7 com ATP (3 e 5 mM) resultou em uma redução estatisticamente significativa da contagem de unidades formadoras de colônias (CFUs). Nos experimentos in vivo foram utilizados camundongos machos C57BL/6 (tipo selvagem) e camundongos knockout para o receptor P2X7 (P2X7R-/-) (25-30 g). Os resultados com imuno-histoquímica mostraram que a expressão do receptor purinérgico P2X7 foi encontrada significativamente aumentada nos pulmões de camundongos infectados com M. tuberculosis. Além disso, camundongos P2X7R-/- infectados com M. tuberculosis mostraram um aumento da carga da micobacteria no tecido pulmonar, quando comparado com camundongos do tipo selvagem infectados. Camundongos infectados mostraram um aumento marcante no peso do baço quando comparado com animais não infectados, indicando a ocorrência de esplenomegalia. Em baços de camundongos P2X7R-/-, observou-se uma diminuição significativa nas populações de Treg (CD4 + Foxp3 +), células T (CD4 +, CD8 + CD25 + e CD4 + CD25 +), células dendríticas (CD11c +) e células + B220. No entanto, houve um aumento significativo de células CD11b + em camundongos P2X7R-/-, quando comparados aos animais do tipo selvagem. Nos pulmões, camundongos P2X7R-/- infectados com M. tuberculosis apresentaram infiltrado pulmonar contendo um aumento de células Treg (CD4 + Foxp3 +), células T (CD4 + e CD8 +) e uma diminuição nas células + B220, quando comparado com camundongos do tipo selvagem infectados com M. tuberculosis. Portanto, os resultados observados no presente estudo fornecem novas evidências sobre o papel dos receptores P2X7 na patogênese e controle da tuberculose. O uso de agonistas ou antagonistas seletivos deste receptor como uma ferramenta terapêutica continua sendo uma questão a ser investigada.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412457-Texto+Completo-0.pdf: 570496 bytes, checksum: cf4c4f06ed8ca9eb35fd95c4cacc5cb0 (MD5) Previous issue date: 2009 / Human tuberculosis (TB), caused by an infectious agent, Mycobacterium tuberculosis, represents a global threat leading the causes of death in adults, responsible for killing approximately 2 million of people a year throughout the world. It is estimated that one third of the population is latently infected with the bacillus. India, China, Indonesia, South African, and Nigeria are the first five countries in the raking of the greatest absolute numbers of cases and Brazil is in the 15th position. The M. tuberculosis can remain viable in the infected host cell for a long time. This condition is called latent TB, which is the non-contagious form of the disease when the bacteria persists inactive. More efficient and less toxic chemotherapy agents are needed to reduce the duration of current treatments, as well as to improve the possibilities of treatment for MDR-TB and XDR-TB strains. Moreover, two major approaches in combating this disease are a more effective treatment to latent TB, urgent to prevent the disease developing to the active form, and drugs that do not interfere with the anti-retroviral therapy used for AIDS. Enzymes involved in purine salvage pathway are of special interest to this effort. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT; EC 2. 4. 2. 8) is a purine salvage enzyme that catalyzes the Mg+2-dependent reversible transfer of the 5’-phosphoribosyl group from α-D-ribofuranose 1’- pyrophosphate 5’-phosphate (also known as 5’-phosphorybosil-α-1’-pyrophosphate; PRPP) to a purine basis (guanine, hypoxanthine) to form the corresponding ribonucleotides IMP (inosine 5`-monophosphate), and GMP (guanosine 5`- monophosphate) with the release of PPi (inorganic pyrophosphate).In this work, we have reported the cloning, expression in E. coli BL21(DE3) cells, purification for the homogeneity, N-terminal sequencing, mass espectrometry analysis, and determination of apparent steady-state kinetic parameters of HGPRT enzyme. / A tuberculose humana (TB), causada por um único agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis, representa uma ameaça global liderando a morte em adultos, responsável por cerca de dois milhões de óbitos por ano no mundo. Estima-se que aproximadamente um terço da população está latentemente infectada com o bacilo. A Índia, China, Indonésia, África do Sul e Nigéria são os primeiros cinco países do ranking com maiores números absolutos de casos e o Brasil encontra-se na 15ª posição. O M. tuberculosis pode permanecer viável dentro da célula do hospedeiro infectado por longo tempo. Esta condição é chamada de TB latente, que é a forma não contagiosa da doença, onde a bactéria permanece inativa. Agentes quimioterápicos mais eficazes e menos tóxicos são necessários para reduzir a duração do tratamento atual, assim como melhorar as possibilidades de tratamento para as cepas MDR-TB e XDR-TB. Além disso, há necessidade de um tratamento eficaz para a TB latente, impedindo que a doença se desenvolva para a forma ativa e, também, drogas que não interfiram com os anti-retrovirais, utilizados para o tratamento da AIDS. Neste contexto, enzimas envolvidas no salvamento de purinas são de interesse particular. A hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT – EC 2. 4. 2. 8) é uma enzima chave da via de salvamento de purinas que catalisa a transferência reversível, dependente de magnésio, de um grupo fosforibosil do 5- fosfo-α-D-ribosil-pirofosfato (PRPP) para uma base purina (hipoxantina ou guanina) para formar o ribonucleotídeo purina, inosina monofosfato ou guanosina monofosfato, liberando pirofosfato (PPi). Neste trabalho, relatamos a clonagem, a expressão em células E. coli BL21(DE3), a purificação para homogeneidade, o sequenciamento N-terminal, a análise da espectrometria de massas e a determinação dos parâmetros cinéticos aparentes da enzima HGPRT.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000432437-Texto+Completo-0.pdf: 10723389 bytes, checksum: d0fa4e1abb05919515c5199dcf4ecc73 (MD5) Previous issue date: 2011 / The inhA gene from Mycobacterium tuberculosis (Mtb), encodes for an enoyl acyl carrier protein reductase, InhA, a key enzyme of the mycobacterial type II fatty acid elongation cycle and has been validated as an effective target for the development of anti-microbial agents. InhA catalyzes the NADH-dependent reduction of trans double bond between positions C2 and C3 of fatty acyl substrates. It is the target of isoniazid, a first line drug in the tuberculosis treatment. Mutations in InhA structural gene are associated with isoniazid resistance in vivo. Even though mutations within the inhA gene are known to facilitate isoniazid resistance, InhA remains a good candidate for drug design because: (i) the vast majority of the mutations found in isoniazid-resistant clinical isolates are associated with the isoniazid activator (KatG catalase-peroxidase); (ii) only one enoyl-ACP reductase is found in Mtb, unlike some of the other enzymes of bacterial FAS-II systems; (iii) the longer substrate chain length specificity of InhA distinguishes it from the enoyl-ACP reductases from other sources. Our goal with this work was to analyze in detail the structural and physicochemical available information about Mtb InhA using bioinformatics tools. As a result, we developed a pharmacophoric model based on the InhA substrate binding cavity that allowed the application of a virtual screening methodology focused in selecting ligands that satisfied these features, allowing so, a best complementarity with the target protein. Besides we tested the hability of four docking algorithms to find similar conformation to a molecule, providing clues that this would be the conformation closest that adopted in vivo. Finally, molecular dynamics simulations were employed to achieve a better comprehension of the interaction between InhA and a known inhibitor. / O gene inhA de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) codifica a enzima enoil redutase, InhA, uma enzima chave no ciclo de alongamento de ácidos graxos tipo II e têm sido validada como um alvo efetivo para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. A InhA catalisa a redução NADH-dependente da ligação dupla trans entre as posições C2 e C3 de substratos de ácidos graxos. Ela é o alvo da isoniazida, uma droga de primeira linha no tratamento da tuberculose. Mutações no gene estrutural da InhA estão associadas com a resistência à isoniazida in vivo. Mesmo que mutações no gene inhA sejam conhecidas por facilitar a resistência à isoniazida, InhA ainda é uma excelente candidata a alvo para o planeamento de fármacos porque: (i) a grande maioria das mutações encontradas em isolados clínicos de cepas resistentes à isoniazida estão associadas com o ativador da isoniazida (KatG catalase-peroxidase); (ii) apenas uma enoil-ACP redutase é encontrada em M. tuberculosis, ao contrário de outras enzimas dos sistemas FAS-II de bactérias; (iii) a especificidade da InhA por substratos de cadeia mais longa a distingue das enoil-ACP redutases de outros tipos. Nosso objetivo com este trabalho foi de analisar em detalhe as informações estruturais e físico-químicas disponíveis sobre a InhA de Mtb utilizando ferramentas de bioinformática. Como resultado, foi desenvolvido um modelo farmacofórico baseado na estrutura do sítio de ligação ao substrato da InhA, permitindo a aplicação de uma metodologia de triagem virtual focada em selecionar ligantes que satisfizessem essas características, permitindo assim, a melhor complementariedade com a proteína alvo. Além disso testamos a habilidade de quatro algoritmos de docagem molecular em encontrar conformações semelhantes para uma mesma molécula, fornecendo indícios de que esta seja a conformação mais próxima àquela adotada in vivo. Por fim, simulações de dinâmica molecular foram empregadas para melhor compreensão da interação da enzima InhA com um inibidor já conhecido desta enzima.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-11Bitstream added on 2014-06-13T19:22:41Z : No. of bitstreams: 1 pavan_fr_dr_arafcf.pdf: 966119 bytes, checksum: c9d048c219b0b202a52cb7f70f5d5846 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa e curável transmitida pelo ar. A taxa de mortalidade reduziu globalmente em 2007, entretanto, TB-MDR, XDR e a coinfecção TB/HIV têm sufocado as tentativas de controle da TB, causando sofrimento e morte em todo o mundo. Adicionalmente, um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis (MTB) em estado de latência, o qual serve como reservatório para TB ativa. A rifampicina (RMP), descoberta há mais de 40 anos, representa a última classe de antibióticos introduzida como fármaco de primeira-linha no tratamento da TB. No esforço de sanar esta falha, é crescente a importância da Química Medicinal Inorgânica como um aliado na pesquisa de novos fármacos contra TB. É bem conhecido que alguns elementos metálicos desempenham papel fundamental nos seres vivos. Tem sido relatado desde 1970 que compostos de rutênio (Ru) exibem atividade anti-tumoral. Inclusive, alguns destes compostos se encontram na fase clínica de avaliação. Compostos de Ru foram avaliados também em nosso laboratório demonstrando atividade contra MTB. Os complexos com Ru(II) demonstraram ser mais ativos contra o MTB em relação a forma do ligante livre, em até 150 vezes, com baixa citotoxicidade e alta seletividade. Os resultados promissores inspiraram a procura de uma melhor abordagem para explorar o perfil pré-clínico in vitro e in vivo desses compostos. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma linha de pesquisa (pipeline) com ensaios fenotípicos rápidos, sensíveis, específicos e de baixo custo na pesquisa de um novo fármaco contra TB. Paralelamente, avaliou-se os melhores complexos heterolépticos de Ru(II) com fosfinas, diiminas e picolinato como ligantes, pré-selecionados, frente a esse pipeline. Os resultados obtidos com os complexos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo / Tuberculosis (TB) is a preventable and curable infectious disease transmitted through the air. The mortality rates decreased globally in 2007, however, MDR and XDR TB, and co-infection TB/HIV have stifled attempts to control TB causing suffering and death worldwide. Additionally, a third of the world population is infected with Mycobacterium tuberculosis (MTB) in state of latency, which serves as a reservoir for active TB. Rifampicin (RMP), discovered more than 40 years ago, represents the last class of antibiotics introduced as first-line drug to treat TB. In an effort to correct this failure is an increasingly importance of Inorganic Medicinal Chemistry as an ally in the search for new drugs against TB. It is well known that some metallic elements play a fundamental role in living organisms. It has been reported since 1970 that compounds of ruthenium (Ru) exhibit anti-tumor activity. Even some of these compounds are in clinical phase of evaluation. Ru compounds were evaluated in our laboratory showing activity against MTB. Complexes with Ru(II) showed activity against MTB in relation to the free ligand up to 150 higher, with low cytotoxicity and high selectivity. The promising results inspired the search for a better approach to explore the pre-clinical in vitro and in vivo profile of these compounds. So, the objective of this study was to develop a research line (pipeline) fast, sensitive, specific and low-cost phenotypic testing in the search for a new drug against TB. At the same time the best complexes of heteroleptic Ru(II) phosphine/diimines/picolinate, pre-selected, against several biological in vitro and in vivo assays. Those evaluated assays were inserted into the pipeline developed at our laboratory. The in vitro results obtained with the Ru(II) (compounds SCAR) complexes are comparable and/or better than the first choice... (Complete abstract click electronic access below)