Le virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) est un excellent modèle pour la réplication des virus à ARN simple brin de polarité positive. Ce petit virus de plante code l’ensemble desprotéines nécessaires à sa réplication sous forme d’un précurseur polyprotéine (206K). Du NauC-terminus, celui-ci porte une activité méthyltransférase, protéase à cystéine (PRO),hélicase et ARN-polymérase ARN dépendante (POL). Comme tous les virus à ARN(+)connus, son complexe de réplication est étroitement lié à des membranes cellulaires. Dans lecas du TYMV, c’est l’enveloppe des chloroplastes qui est impliquée. Un des acteurs clés de laréplication est la polymérase qui permet la synthèse de nouveaux génomes. La régulation de son activité implique dans un premier temps son clivage de la 206K par PRO. Ainsi libérée,elle est recrutée aux chloroplastes par une interaction directe avec le domaine PRO du produit de clivage 140K, afin de former le complexe de réplication. Un second clivage par PRO contenu dans 140K, à la jonction PRO-hélicase, permet de poursuivre le cycle de réplication.Récemment, il a également été montré que l’activité POL était régulée par la voie ubiquitine-protéasome durant le cycle viral. Ubiquitinilée par la cellule hôte, elle est adressée au protéasome où elle sera dégradée. Cependant, PRO, grâce à sa seconde fonction ubiquitine hydrolase, est capable de la protéger de cette dégradation. Afin de caractériser d’un point de vue structural ce mécanisme de régulation de la réplication, nous avons cristallisé, à l’aide d’un contaminant, PRO et avons résolu sa structure. L’empilement cristallin est tel que le Cterminus d’un domaine PRO est inséré dans la crevasse catalytique du domaine PRO suivant,nous fournissant ainsi des informations structurales sur son activité endopeptidase. Dans un second temps, afin d’avoir des informations sur sa seconde activité, nous avons réalisé un complexe stable entre PRO et une molécule d’ubiquitine afin de le cristalliser et résoudre sa structure. Enfin, nous avons initié l’étude cristallographique de la polymérase. / Turnip Yellow Mosaic Virus is an excellent model for positive-stranded RNA virus replication. It’s a small plant virus whose replication machinery is encoded in the viralgenome as a single polyprotein (206K). From N- to C-terminus, this 206K harbors amethyltransferase, a cysteine proteinase (PRO), a helicase and an RNA-dependent RNApolymerase (POL). As in all RNA(+) viruses known, the replication complex is bound to cellmembranes. For TYMV, it ,is the chloroplast envelope that is implicated. A key component inthe replication process is the polymerase, that allows the synthesis of new genomes. The regulation of its activity involves initially its cleavage by PRO from the 206K. Once liberated,the polymerase is recruited to the chloroplasts through a direct interaction with the PROdomain, contained in 140K, in order to form the replication complex. A second cleavage of140K by PRO at the PRO-helicase junction allows to continue the replication cycle. Recently,it has also been shown that the POL activity was regulated by the ubiquitin-proteasomesystem during the viral multiplication cycle. Ubiquitinilated by the host cell, POL is addressed to the proteasome where it is degraded. However, PRO, due to its second function as an ubiquitin hydrolase, is able to protect POL from its degradation. In order to characterizethis mechanism of replication regulation with a structural point of view, we crystallized,assisted by contaminant, PRO and resolved its structure. In the crystal packing, the C-terminalof a PRO domain is inserted into the catalytic cleft of the next PRO domain, thus providing us structural informations on its endopeptidase activity. In a second step, in order to obtain information about its second activity, we made a stable complex between PRO and amolecule of ubiquitin in order to cristallise it. Finally, we initiated the crystallographic studyof POL.Keywords:

by Lam Ying Hoo. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1994. / Includes bibliographical references (leaves 145-149). / Acknowledgements --- p.i / Abstract --- p.ii / Contents --- p.iv / Abbreviations --- p.x / Chapter Chapter 1 --- Introduction / Chapter 1.1. --- Trichosanthin --- p.1 / Chapter 1.2. --- Anti-plant viral and fungal properties of RIPs --- p.3 / Chapter 1.3. --- Agrobacterium-mediated transformation --- p.5 / Chapter 1.3.1. --- Ti (tumor inducing) plasmid --- p.6 / Chapter 1.3.2. --- Role of vir proteins in T-DNA transfer --- p.6 / Chapter 1.3.3. --- Integration of T-DNA into plant genome --- p.11 / Chapter 1.3.4. --- Use of Agrobacterium plasmid as transformation vectors --- p.13 / Chapter 1.4. --- Objective and strategy of producing transgenic plants that express TCS --- p.15 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods / Chapter 2.1. --- Bacterial Strains used --- p.19 / Chapter 2.2. --- General Techniques --- p.20 / Chapter 2.2.1. --- Growth of bacterial strains --- p.20 / Chapter 2.2.2. --- Restriction Enzyme Digestion of DNA --- p.21 / Chapter 2.2.3. --- Agarose Gel Electrophoresis of DNA --- p.21 / Chapter 2.2.4. --- Purification of DNA fragments from Agarose Gel using GeneClean II® ( BIO 101 Inc.) kit --- p.22 / Chapter 2.2.5. --- Purification of DNA fragments by Phenol/Chloroform Extraction --- p.23 / Chapter 2.2.6. --- Ligation of DNA fragments --- p.24 / Chapter 2.2.7. --- Preparation and Transformation of Escherichia coli Competent Cells --- p.24 / Chapter 2.2.8. --- Minipreparation of Plasmid DNA --- p.26 / Chapter 2.2.9. --- Preparation of Plasmid DNA using Magic´ёØ Minipreps DNA Purification kit from Promega --- p.27 / Chapter 2.2.10. --- Preparation of Plasmid DNA using Qiagen-pack 100 Cartridge --- p.29 / Chapter 2.2.11. --- SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) --- p.30 / Chapter 2.2.12. --- Western Blot detection of TCS --- p.33 / Chapter 2.2.13. --- Polymerase Chain Reaction (PCR) --- p.34 / Chapter 2.3. --- Construction of Plant Transformation Vectors --- p.36 / Chapter 2.3.1. --- Construction of pSLJ58210 --- p.36 / Chapter 2.3.2. --- Construction of pSLJ TCS1 and pSLJ TCS2 --- p.38 / Chapter 2.3.3. --- Conjugation of pSLJ TCS1 and pSLJ TCS2 into A. tumefaciens by Triparental Mating --- p.41 / Chapter 2.4. --- Transformation of Tobacco Leaf Explants by Agrobacterium tumefaciens --- p.43 / Chapter 2.4.1. --- Growth of A. tumefaciens LBA4404 (pSLJ TCS1) --- p.43 / Chapter 2.4.2. --- Surface Sterilization of tobacco leaves --- p.43 / Chapter 2.4.3. --- Inoculation of tobacco leaf explants with A. tumefaciens LBA4404 (pSLJ TCS1) --- p.44 / Chapter 2.4.4. --- Regeneration of shoots from Transformed explants --- p.45 / Chapter 2.4.5. --- Rooting of Transformed shoots --- p.45 / Chapter 2.4.6. --- Re-establishment of cultured Plantlets in soil --- p.45 / Chapter 2.5. --- Analysis of the Regenerated Transgenic Tobacco --- p.46 / Chapter 2.5.1. --- Isolation of plant leaf protein --- p.46 / Chapter 2.5.2. --- SDS-PAGE and Western blot detection of TCS --- p.48 / Chapter 2.5.3. --- Anti-viral assay of Transgenic tobacco against TuMV --- p.48 / Chapter 2.6. --- Bioassay of Inhibitory activity of TCS protein against TuMV --- p.49 / Chapter 2.6.1. --- Preparation of biologically active TCS protein --- p.49 / Chapter 2.6.2. --- Purification of TuMV from infected plant leaves --- p.51 / Chapter 2.6.3. --- Mechanical Inoculation of virus onto host plant --- p.53 / Chapter 2.6.4. --- Anti-viral assay on Local Lesion host --- p.54 / Chapter 2.6.5. --- Anti-viral assay on Systemic host --- p.55 / Chapter 2.7 --- Establishment of the plant culture medium for efficient Regeneration from tissue explants of Brassica parachinensis --- p.56 / Chapter 2.7.1. --- Preparation and Sterilization of culture medium --- p.57 / Chapter 2.7.2. --- Preparation of Sterile seedlings of B. parachinensis --- p.57 / Chapter 2.7.3. --- Regeneration from Cotyledon petiole and Hypocotyl segment explants --- p.58 / Chapter 2.7.4. --- Regeneration from Internode stem segment explants of shoot culture --- p.60 / Chapter 2.8. --- Reagents and Buffers --- p.61 / Chapter 2.8.1. --- Media for Bacterial culture --- p.61 / Chapter 2.8.2. --- Media for Plant tissue culture --- p.64 / Chapter 2.8.3. --- Restriction Enzymes --- p.66 / Chapter 2.8.4. --- Buffers for Agarose Gel Electrophoresis --- p.66 / Chapter 2.8.5. --- DNA ligation Buffer --- p.67 / Chapter 2.8.6. --- Reagents for preparation of E.coli competent cells --- p.67 / Chapter 2.8.7. --- Reagents for preparation of Plasmid DNA --- p.68 / Chapter 2.8.8. --- Reagents for Qiagen-pack 100 Cartridge --- p.69 / Chapter 2.8.9. --- Reagents for SDS-PAGE --- p.70 / Chapter 2.8.10. --- Reagents for Western Blotting --- p.71 / Chapter Chapter 3 --- Construction of Plant Transformation Vectors / Chapter 3.1. --- Introduction --- p.73 / Chapter 3.2. --- Results --- p.74 / Chapter 3.2.1. --- Construction of pSLJ58210 --- p.74 / Chapter 3.2.2. --- Construction of the recombinant binary vectors pSLJ TCSl and pSLJ TCS --- p.78 / Chapter 3.2.3. --- Conjugation ofpSLJ TCS 1 and pSLJ TCS 2 into Agrobacterium tumefaciens via Triparental Mating --- p.82 / Chapter 3.3. --- Discussion --- p.90 / Chapter Chapter 4 --- Transformation of Tobacco Leaf Explants by Agrobacterium tumefaciens / Chapter 4.1. --- Introduction --- p.94 / Chapter 4.2. --- Results --- p.95 / Chapter 4.2.1. --- Regeneration of leaf explants after transformation --- p.95 / Chapter 4.2.2. --- The level of expression of TCS in transgenic tobacco leaf --- p.100 / Chapter 4.3. --- Discussion --- p.104 / Chapter 4.3.1. --- Regeneration of transgenic tobacco plants --- p.104 / Chapter 4.3.2. --- Expression of TCS in transgenic tobacco plants --- p.108 / Chapter Chapter 5 --- Two approaches to study the Inhibitory effect of TCS on TuMV / Chapter 5.1. --- Introduction --- p.112 / Chapter 5.2. --- Results --- p.113 / Chapter 5.2.1. --- Expression and purification of recombinant TCS --- p.113 / Chapter 5.2.2. --- Purification of TuMV --- p.119 / Chapter 5.2.3. --- Anti-viral assay on local lesion host --- p.119 / Chapter 5.2.4. --- Anti-viral assay on Systemic host --- p.124 / Chapter 5.2.5. --- Anti-viral assay of Transgenic tobacco against TuMV --- p.126 / Chapter 5.3. --- Discussion --- p.129 / Chapter Chapter 6 --- Establishment of plant culture conditions for efficient shoot regeneration from tissue explants of B.parachinensis / Chapter 6.1. --- Introduction --- p.133 / Chapter 6.2. --- Results --- p.133 / Chapter 6.3. --- Discussion --- p.137 / Chapter Chapter 7 --- Conclusion / Appendix / Chapter A.1. --- Size of molecular weight markers --- p.143 / Chapter A.2. --- References --- p.145

Le virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) est un excellent modèle pour la réplication des virus à ARN simple brin de polarité positive. Ce petit virus de plante code l'ensemble desprotéines nécessaires à sa réplication sous forme d'un précurseur polyprotéine (206K). Du NauC-terminus, celui-ci porte une activité méthyltransférase, protéase à cystéine (PRO),hélicase et ARN-polymérase ARN dépendante (POL). Comme tous les virus à ARN(+)connus, son complexe de réplication est étroitement lié à des membranes cellulaires. Dans lecas du TYMV, c'est l'enveloppe des chloroplastes qui est impliquée. Un des acteurs clés de laréplication est la polymérase qui permet la synthèse de nouveaux génomes. La régulation de son activité implique dans un premier temps son clivage de la 206K par PRO. Ainsi libérée,elle est recrutée aux chloroplastes par une interaction directe avec le domaine PRO du produit de clivage 140K, afin de former le complexe de réplication. Un second clivage par PRO contenu dans 140K, à la jonction PRO-hélicase, permet de poursuivre le cycle de réplication.Récemment, il a également été montré que l'activité POL était régulée par la voie ubiquitine-protéasome durant le cycle viral. Ubiquitinilée par la cellule hôte, elle est adressée au protéasome où elle sera dégradée. Cependant, PRO, grâce à sa seconde fonction ubiquitine hydrolase, est capable de la protéger de cette dégradation. Afin de caractériser d'un point de vue structural ce mécanisme de régulation de la réplication, nous avons cristallisé, à l'aide d'un contaminant, PRO et avons résolu sa structure. L'empilement cristallin est tel que le Cterminus d'un domaine PRO est inséré dans la crevasse catalytique du domaine PRO suivant,nous fournissant ainsi des informations structurales sur son activité endopeptidase. Dans un second temps, afin d'avoir des informations sur sa seconde activité, nous avons réalisé un complexe stable entre PRO et une molécule d'ubiquitine afin de le cristalliser et résoudre sa structure. Enfin, nous avons initié l'étude cristallographique de la polymérase.

No description available.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Plant Science. Title from title page of PDF (viewed 2008/01/12). Includes bibliographical references.