No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

No / This chapter gives an introduction to protein simulation methodology aimed at experimentalists and graduate students new to in silico investigations. More emphasis is placed on the knowledge needed to select appropriate simulation protocols, leaving theoretical and mathematical depth for other texts to take care of. The chapter explains some of the more practical considerations of performing simulations of proteins, in particular, the additional considerations required when studying protein folding where nonnative environments are modeled. Forced unfolding simulations are highly relevant and invaluable in characterizing proteins naturally exposed to mechanical stress as a component of their biological function. The chapter illustrates this utility by discussing research that has been done primarily on the giant muscle protein titin. Using Molecular dynamics (MD) simulations to investigate protein folding faces two main challenges. The most obvious relates to the timescale of protein folding and the computational expense required for adequate sampling. / NIH

Ce travail de thèse repose sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse native et mobilité ionique pour la caractérisation structurale de protéines d’intérêt thérapeutique et de complexes multiprotéiques. L’optimisation fine et conséquente de la préparation d’échantillon et des conditions analytiques ont permis la caractérisation de protéines membranaires solubilisées en milieu détergent, protéines hydrophobes habituellement réfractaires à l’analyse par MS. D’autre part, une nouvelle approche de mobilité ionique appelée Collision Induced Unfolding a été évaluée et mise en place au laboratoire. Elle a permis une caractérisation conformationnelle approfondie et originale de plusieurs formats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques. Enfin, les techniques de MS native et de mobilité ionique ont été utilisées pour caractériser des complexes multiprotéiques d’hétérogénéité variable mettant ainsi en lumière leurs avantages et les progrès réalisés dans le domaine de la MS structurale. / This PhD work focuses on developments in native mass spectrometry and ion mobility methods for the structural characterization of therapeutic proteins and multiprotein complexes. First, careful optimizations of sample preparation and analytical conditions allowed the characterization of membrane proteins, which are hydrophobic proteins difficult to analyze by MS approaches in detergent environment. Then, a new ion mobility-based activation approach called Collision Induced Unfolding has been set up and evaluated. CIU allowed extensive and original conformational characterization of several therapeutic monoclonal antibody formats. Finally, native MS and ion mobility techniques were used for the characterization of heterogeneous multiprotein complexes depicting their benefit when combined to other biophysical techniques for the structural characterization of multiprotein complexes.

Diverse astrophysikalische Beobachtungen weisen auf bislang unerklärte Materie hin, die hauptsächlich gravitativ interagiert. Wenn diese Materie, bezeichnet als Dunkle Materie, ein Elementarteilchen ist, könnte sie in Teilchenkollisionen am Large Hadron Collider produziert werden. Aufgrund ihrer schwachen Wechselwirkung mit normaler Materie könnte sie jedoch nicht direkt mit den Vielzweckdetektoren am Large Hadron Collider beobachtet werden. Ihre Produktion würde sich stattdessen in Ereignissen zeigen, in denen ein Rückstoß von Detektor-sichtbaren Objekten gegen die Detektor-unsichtbare Dunkle Materie besteht, was fehlende transversale Energie verursacht. Diese Dissertation beschäftigt sich mit Endzuständen, in denen diese sichtbaren Objekte sogenannte Jets sind. In dieser Dissertation wird eine Messung des Endzustands aus großer fehlender transversaler Energie und mindestens einem Jet in 139/fb an Proton–Proton-Kollisionen bei 13 TeV, aufgezeichnet mit dem ATLAS-Detektor am Large Hadron Collider, durchgeführt. Zwischen den gemessenen Daten und der Standard-Modell-Vorhersage wird in einer statistischen Optimierung gute Übereinstimmung gefunden. Die Messung wird von Detektor-Effekten bereinigt, um spätere Reinterpretation zu vereinfachen. Messungen, die auf diese Art aufbereitet wurden, können beispielsweise von der Contur-Software benutzt werden, um Parametergrenzen für neue Theorien festzustellen. Sowohl die Ergebnisse der Messung, als auch die Contur-Software, welche auf existierende Messungen am Large Hadron Collider zurückgreift, werden verwendet, um Ausschlussgrenzen für ein Modell, das Dunkle Materie erklären kann, festzustellen. Betrachtet wird das Modell von zwei Higgs-Dubletts und einem pseudoskalaren Botenteilchen zu Dunkler Materie. / Various astrophysical observations point towards an as-of-yet unexplained, mainly gravitationally interacting type of matter. If this matter, called Dark Matter, is an elementary particle, it could be produced in particle collisions at the Large Hadron Collider. Given its weak interaction with ordinary matter, however, it would not be directly observable with the general-purpose detectors at the Large Hadron Collider. Its production would therefore manifest as events in which detector-visible objects recoil against the detector-invisible Dark Matter, giving rise to missing transverse energy. This thesis focuses on final states in which these visible objects are jets. A measurement of the final state of large missing transverse energy and at least one jet in 139/fb of proton–proton collisions at 13 TeV recorded with the ATLAS detector at the Large Hadron Collider is performed in this thesis. Good agreement between measured data and Standard-Model prediction is found in a statistical fit. The measurement is corrected for detector effects to facilitate later reinterpretation. Measurements prepared in such a way can, for example, be exploited by the Contur toolkit to set constraints on new theories. Both, the results of the measurement and the Contur toolkit making use of existing measurements at the Large Hadron Collider, are employed to set exclusion limits on a model able to explain Dark Matter, the two-Higgs-doublet model with a pseudoscalar mediator to Dark Matter.

No description available.

No description available.

Nous avons étudié le couplage dépliement-transport de la Maltose Binding Protein (MBP ou MalE), une protéine périplasmique d'E. Coli et d'un mutant instable, le MalE219, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant, le chlorure de guanidium (GdnHCl) à l'échelle de la molécule unique. La technique utilisée est basée sur la détection électrique du transport de macromolécules à travers un nanopore protéique (l'Aérolysine d'Aeromonas Hydrophila) inséré dans une bicouche lipidique plane. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une précédente étude réalisée à travers un autre nanopore protéique, l'alpha-hémolysine du Staphylocoque doré, de géométrie et de charge nette différente. Nous avons montré l'existence de temps courts et longs de blocage du courant associés à des protéines dépliées ou partiellement repliées. La fréquence des blocages du courant permet d'obtenir la fraction de protéine dépliée passant à travers le pore en fonction de la concentration en GdnHCl. Les courbes de dénaturation obtenues avec les deux pores montrent un comportement sigmoïdale très similaire. Le type de pore n'influence donc pas la dénaturation des protéines, mais uniquement leur dynamique de transport. En revanche, la courbe de dénaturation du mutant instable présente un déplacement vers les concentrations plus faibles en GdnHCl. Il a été montré également que la présence du maltose comme ligand sur le MalE219 stabilise nettement sa structure. Pour La MBP, les temps de blocages longs diminuent avec l'augmentation de la concentration de GdnHCl montrant une dynamique de transition vitreuse . Cette technique est appropriée à l'étude du dépliement et des changements de conformation de protéines, mais ne permet pas d'obtenir des informations structurales sur les états intermédiaires de repliement. Ainsi, la spectroscopie RMN a été utilisée pour tenter de caractériser ces états intermédiaires de repliement, notamment par la méthode d'échange proton-deutérium. Elle consiste à suivre les cinétiques d'échange des résidus de la protéine sur des spectres 2D 1H-15N HSQC à différentes concentrations de GdnHCl.Ainsi 180 résidus sur les 370 que compte la MBP ont été suivis lors de la dénaturation en présence de GdnHCl. Les deux hélices en C-terminal sont très accessibles au solvant et se dénaturent facilement. La MBP est composée de deux domaines globulaires, le domaine N-ter et le domaine C-ter. Les éléments de structures secondaires situés dans la zone intermédiaire entre les deux domaines (principalement des brins β) sont particulièrement affectés par l'agent dénaturant. D'autres structures secondaires dans les domaines globulaires sont très protégées et plutôt stables. Il est donc proposé que les protéines partiellement dépliées s'insèrent dans le pore par l'extrémité C-terminal et que des parties de structuration tertiaire restent stable entraînant le blocage du pore. / We study the unfolding-transport mechanism of the Maltose Binding Protein (MBP or MalE), a periplasm protein of E. Coli and a destabilised variant, the MalE219, as the function of the concentration of denaturing agent, Guanidine Hydrochloride(GdnHCl) at the single molecule level. The technique is based on the electrical detection of the macromolecule transport through a nanometer-scale channel, Aerolysin channel, inserted into a planar lipid bilayer. Results obtained were compared to previous data with another channel, the alpha-Hemolysin. Both channels have different geometry and net charge.We show that we can distinguish unfolded states from partially folded ones with aerolysin pore.Unfolded proteins induce short current blockades, their duration is constant as a function of the concentration of denaturing agent. Partially folded proteins exhibit long blockades whose life times decrease as the concentration of GdnHCl increase, this indicates a possible glassy dynamics.The frequency of the short current blockades increases as the concentration of denaturing agent increases, following a sigmoidal denaturation curve.The unfolding curve of native MBP with Aerolysin pore is similar to the one previously measured with Hemolysin channel. The denaturation curve of the destabilized variant obtained with Aerolysin is shifted towards lower value of GdnHCl concentration in agreement with bulk measurements. We show also that the addition of maltose stabilizes the structure of MalE219. This nanopore recording technique is also suitable for the study of unfolding and conformation changes of proteins.In order to obtain structural informations that nanopore recording cannot provides, the structure of MBP along its denaturation curve was studied by NMR spectroscopy. The Hydrogen-exchange method known to be sensitive to folding intermediates was specially used. It consists in tracking hydrogen-deuterium exchange rates for amino on the 2D 1H-15N HSQC spectra.Thus, 180 residus of 370 for MBP was followed during denaturation in the presence of GdnHCl. The two last helices in C-terminal of MBP are accessible to the solvent and are denaturated easily. MBP is a two domains protein, N-ter domain and C-ter domain. It was found out that the C- and D-domain of MBP (mainly alpha-helices) could be relatively stable in presence of denaturing agent and that beta strands which make the link between the two domains would be affected by the denaturing agent. It was proposed that partially unfolded proteins enter the pore by the C-terminal end and that stable tertiary structure still present block the pore.