Orientador: Prof. Dr. Geraldo Picheth / Co-orientador: Prof. Dr. Roberto Tadeu Raittz / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Educação Profissional e Tecnológica, Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Defesa: Curitiba, 03/02/2011 / Inclui referências / Área de concentração : Bioinformática / Resumo: A urinálise contempla uma avaliação semi-quantitativa de analitos e contagem diferencial de células presentes na urina. A análise fornece informações diagnósticas relevantes principalmente sobre o sistema urinário e renal. Neste trabalho, foi estudada a aplicação de redes neuronais aplicadas a tomada de decisão sobre a liberação do ensaio de urinálise, comparada ao processo de decisão realizados por profissionais do laboratório clínico. Registros de resultados de urinálise (n=140.482), anô imos, foram obtidos no Laboratório Municipal de Curitiba, após a aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da UFPR (CAE: 0106.0.091.000-09). Os pacientes em estudo apresentaram idade média de 38 anos, com amplitude de variação de 0 a 101 anos. A predominância do sexo feminino foi superior a 65% na amostra. Quando os elementos do ensaio foram analisados individualmente, alterações nas concentrações de esterase leucocitária e hemoglobina, bem como as contagens de leucócitos e eritrócitos estão presentes em cerca de 95% de todos os pacientes com alterações na urinálise. Aplicando-se classificação da amostra baseada em valores de referência, cerca de 65% dos registros mostraram no mínimo um parâmetro urinário fora dos valores de referência. Quando a mesma amostra foi classificada por profissionais, que consideram além dos valores de referência, a consistência entre ensaios relacionados (esterase leucocitária-contagem de leucócitos; hemoglobina-contagem de eritrócitos) para a liberação dos ensaios, cerca de 30% dos resultados ficaram "retidos" para análises posteriores de verificação devido a inconsistência nos resultados. Duas redes neuronais (MLP, multilayer perceptron e FAN, free associative neurons) foram treinadas, testadas e validadas, utilizando como critérios de grupos os resultados dos profissionais designados "liberados" e "retidos". O treinamento das redes mostrou que para a rede MLP o banco de dados deve ser "balanceado", números equilibrados de registros "liberados" e "retidos" para a obtenção do melhor desempenho. Para permitir o acesso ao banco de dados e facilitar a obtenção de resultados um software de apoio foi desenvolvido e utilizado em todo o trabalho. As redes neuronais em estudo foram avaliadas com uma amostra de 484 pacientes da rotina, avaliado por dois profissionais. A rede MLP apresentou uma divergência de cerca de 9 a 12% (sensibilidade 100%; especificidade 90,1%) e om os profissionais, significativamente menor que a rede FAN, 17 a 19% (sensibilidade 39,0% e especificidade 86,9%), respectivamente. A comparação entre o desempenho das redes neuronais com o banco de dados, superior a 100.000 registros, mostrou que a rede MLP apresentou desempenho compatível ao dos profissionais (29,5% vs 21,6%, respectivamente) na classificação dos ensaios retidos. A rede FAN reteve menos amostras (18,2%) sugerindo a maior divergência com a resposta dos profissionais. Em síntese, é possível afirmar que a rede neuronal MLP (Multilayer Percetrons) validada com uma base de dados "balanceada" permite identificar padrões liberação e retenção de resultados de forma a mimetizar os critérios de profissionais para o ensaio de urinálise. Também o programa computacional em linguagem Python, tilizando a rede MLP, desenvolvido para acessar o banco de dados e classificar a amostra apresentou bom desempenho e segurança, sendo recomendado para uso no laboratório clínico. / Abstract: The urinalysis assay represents a combination of semi-quantitative analysis of the differential cells counts in urine. This analysis provides relevant information mainly on the renal and urinary systems. The aim of the work was to compare the study of neural networks associated with laboratory decision support systems, against the process of clinical laboratory professionals’ decisions. A de-identified clinical database (140.482 records) was obtained from Laboratório Municipal de Curitiba. The research was approved by UFPR Ethical Committee for Research with Humans (CAE: 0106.0.091.000-09). The sample population showed mean age of 38 years with an age range of 0-101 years. Females predominated at more than 65%. When individual urinalysis components were quantified the concentration of leucocytes esterase and haemoglobin, as well as the count of leucocytes and erythrocytes occurred in about 95% of all pathologic cases. When reference value was appliedto the sample classification, about 65% of all cases were outside the reference values by at least one parameter. Laboratory clinical professionals often consider beyond the reference values: the consistency of the associated parameters (leucocytes esterase concentration vs. leucocytes count; haemoglobin concentration vs. erythrocyte count) on the criteria for the "release" or "hold" of the result. When the sample was analyzed by professionals about 30% was "held" for additional nvestigation due to inconsistency in results. Two neural networks Multi Layer Perceptron (MLP) and Free Associative Neurons (FAN) were trained, tested and validated, applying the laboratory professional’s criteria for result "release" or "hold". The MLP network showed that the training with a "balanced" data set (characterized by the some number of groups "release" and "hold") improved performance . To access the atabase and facilitate the work software was developed and utilized throughout the entire project. The two studied networks were evaluated with a sample of 484 routine patients, previously screened by the professionals. The MLP network showed a discrepancy of about 9- 12% (sensitivity 100%; specificity 91.1%) when compared to professionals. These results were significantly lower that those obtained using the network FAN (17-19%) which showed a sensitivity of 39% and a specificity of 89.9%. The comparison of the performance of the studied neural networks with a large data set (n>100.000 registers) revealed that the MLP network produced a performance closer to those of professionals (21.6% vs. 29.5%, respectively) for the detection of "hold" samples. In summary we can highlight that MLP neural network, validated with a "balanced" data set, was able to identify the pattern of urinalysis results released, comparably with the laboratory professionals .Also, the software developed (written in Python) for the MLP network showed a good performance and safety and thus we recommended it’s application. in the clinical laboratory.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6024.pdf: 16349859 bytes, checksum: 7382f8d4bf5a05fb4df9d51d782682b1 (MD5) Previous issue date: 2013-12-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work describes the results obtained from studies carried out to quantify phenyl-β-D-glucuronide (FG) and nitrophenyl-β-D-glucuronide (NFG) in human urine by direct injection sample using LC-MS/MS system. The columns RAM-BSA SAX and RAM-BSA C8 were prepared and evaluated in relation to their exclusion capability of urine macromolecules and retention capability of FG by direct injection samples. Both columns presented good retention capability for glucuronide, however, the RAM-BSA SAX column was more efficient in exclusion since this column did not have any interferences eluting after the exclusion time. However, the RAM-BSA SAX column can not be used for FG quantification by LC-MS/MS because the chromatographic condition of this column presented high buffer concentration (40 mM ammonium formate), which resulted in total suppression of the FG signal. Therefore, the column RAM-BSA C8 was selected for the development of the methods. In this study we evaluated triple quadrupole (QqQ) and ion trap (IT) mass spectrometry for both selected glucuronides. It was not possible to obtain selectivity in the analytical conditions developed using UHPLC-QqQ. When we used the IT analyzer, we obtained selectivity in a multidimensional mode for the FG using the column RAM-BSA C8 in the first dimension and the column Ascentis Express F5 in the second dimension. For the NFG we achieved selectivity in a unidimensional mode. The figures of merit obtained with external standarization calibration curve with spiked pooled urines were accurate and precise. For FG, the LQ and LD were 1.0 μg/mL and 0.5 μg/mL, respectively, and to NFG, the LQ and LD were 4.0 μg/mL and 3.0 μg/mL. For the method application we adopted calibration by standard addition to minimize the individual differences between urine donors. To all six toxicological samples analyzed, just one exceeded the regulatory limits for urinary phenol. For NFG, there were no toxicological samples available, thus the method was applied in spiked samples in the laboratory. / Este trabalho descreve os resultados obtidos nos estudos feitos para quantificar fenil-β-D-glucuronídeo (FG) e nitrofenil-β-D-glucuronídeo (NFG), em urina humana por injeção direta de amostra, utilizando-se sistemas LC-MS/MS. Para injeção direta de amostras, as colunas RAM-BSA SAX e RAM-BSA C8 foram preparadas e avaliadas em relação à capacidade de exclusão das macromoléculas da urina e à capacidade de retenção do FG. Ambas as colunas apresentaram boa capacidade de retenção para o glucuronídeo, no entanto, quanto à exclusão, a coluna RAM-BSA SAX mostrou-se mais eficiente, visto que nesta coluna não houve eluição de interferentes, após o tempo de exclusão. Porém, a coluna RAM-BSA SAX não pode ser utilizada para a quantificação de FG por LCMS/ MS, pois as condições cromatográficas estabelecidas para esta coluna envolveram alta concentração de tampão (formiato de amônio 40 mM), o que acarretou na supressão total do sinal referente ao FG. Portanto, a coluna RAMBSA C8 foi selecionada para o desenvolvimento dos métodos. Neste trabalho avaliaram-se os analisadores do tipo triplo quadrupolo (QqQ) e ion trap (IT) para ambos os glucuronídeos estudados. Nas condições analíticas desenvolvidas utilizando-se UHPLC-QqQ, não foi possível se obter seletividade. Quando o IT foi utilizado como analisador, a seletividade foi obtida no modo multidimensional para o FG, utilizando-se a coluna RAM-BSA C8 na primeira dimensão e a coluna Ascentis Express F5 na segunda dimensão, e no modo simples para o NFG. As figuras de méritos obtidas por padronização externa, a partir de uma curva construída fortificando-se um pool de urinas, foram exatas e precisas, com LQ de 1,0 μg/mL e LD de 0,5 μg/mL, para FG, e LQ de 4,0 μg/mL e LD de 3,0 μg/mL, para o NFG. Para aplicação dos métodos, a calibração por adição de padrão foi adotada para contornar as diferenças individuais entre as urinas dos doadores. Das seis amostras toxicológicas analisadas, uma amostra ultrapassou o valor de referência da normalidade para fenol urinário. Para o NFG, na ausência de amostras toxicológicas, o método foi aplicado em amostras-padrão preparadas no laboratório.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A disfunção neurológica é um sintoma comum em pacientes com Doença do Xarope do Bordo. Entretanto, os mecanismos que levam à neuropatologia dessa doença são pouco conhecidos. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos do ácido α-cetoisocapróico (CIC) na incorporação in vitro de proteínas do tipo filamento intermediário de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de tecido de ratos de 09, 12, 15, 17, 21 e 60 dias foram incubadas com 32P-ortofosfato na presença ou na ausência de CIC. A fração citoesquelética foi isolada e a radioatividade incorporada nas proteínas de filamento intermediário foi medida. Nós observamos que o CIC diminui a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas até 12 dias, entretanto, a fosforilação aumentou nas fatias de tecido de ratos de 17, 21 e 60 dias e nenhuma alteração ocorreu nas fatias cerebrais dos animais de 15 dias. Nós também testamos a influência do sistema glutamatérgico na incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas, incubando fatias de córtex cerebral na presença de glutamato, agonistas e antagonistas glutamatérgicos. O glutamato apresentou um efeito similar ao observado para o CIC na fosforilação das proteínas de filamento intermediário durante o desenvolvimento, mas não afetou a incorporação in vitro de 32P nas proteínas estudadas nos ratos de 60 dias, sugerindo que nos animais adultos o CIC aumenta a incorporação in vitro nas proteínas estudadas por outros mecanismos. Além disso, nós observamos que os agonistas glutamatérgicos ionotrópicos NMDA, AMPA e cainato mimetizam o efeito inibitório do CIC, enquanto os agonistas metabotrópicos 1S, 3R ACPD e L-AP4 não induziram alterações na incorporação in vitro de 32P nas proteínas de filamento intermediário estudadas nos animais de 09 dias. Nos ratos de 21 dias, somente os agonistas ionotrópicos NMDA e AMPA mimetizaram o efeito estimulatório do CIC. Também observamos que quando fatias de córtex cerebral de ratos de 09 e 21 dias foram incubadas com 1mM CIC seguidas de incubação com o DL-AP5, um antagonista específico para receptores NMDA, ou com CNQX, antagonista de receptores ionotrópicos AMPA e cainato, o efeito inibitório ou estimulatório do ácido na fosforilação in vitro de ratos de 09 e 21 dias foi revertido. Estes resultados demonstram que o CIC, nas mesmas concentrações encontradas no sangue de crianças afetadas por DXB, altera o sistema de fosforilação associado com as proteínas do citoesqueleto, via sistema glutamatérgico, de maneira regulada pelo desenvolvimento. Portanto, é provável que a alteração de fosforilação das proteínas de citoesqueleto cerebral seja importante para o entendimento da patofisiologia da disfunção neuronal e das alterações estruturais observadas do SNC dos pacientes com DXB.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A doença da urina do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio metabólico hereditário em que ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina, e de seus α-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR) α-cetoisocaproico, α-cetometilvalérico e α-cetoisovalérico. Pacientes com DXB podem apresentar, entre outros sintomas, prejuízo neurológico. No entanto, a fisiopatologia subjacente a este dano cerebral permanece pouco esclarecida. Muitas estratégias terapêuticas, incluindo antioxidantes, são estudadas na tentativa de contribuir para o tratamento destes pacientes. Neste contexto, os ácidos graxos (AG) da família ômega-3, conhecidos por atuarem na estrutura e manutenção do sistema nervoso central, estão sendo amplamente estudados e recomendados para gestantes. Adicionalmente ao seu papel estrutural, estes AG são utilizados por atuarem como anti-inflamatórios e antioxidantes. O objetivo do presente estudo foi investigar, mediante dois protocolos de administração, os efeitos do ômega-3 sobre o dano ao DNA, através do ensaio cometa, em hipocampo, estriado e córtex cerebral da prole de ratos com DXB. No primeiro protocolo, investigou-se a suplementação materna com ômega-3 (0,8 g/kg peso corporal) durante o período pré-natal e seus efeitos sobre a prole. No segundo protocolo, investigou-se o tratamento de ratos infantes com ômega-3 (0,1 g/kg peso corporal) no período pós-natal. O modelo crônico de DXB aplicado à prole foi induzido quimicamente pelo pool de AACR (15,8 μL/g peso corporal). Os resultados mostraram que a suplementação materna com ômega-3 durante o período pré-natal não preveniu os danos causados ao DNA no cérebro da prole com DXB. Por outro lado, quando o ômega-3 foi utilizado como tratamento pós-natal, esse reverteu os danos ao DNA nas estruturas cerebrais hipocampo, estriado e córtex dos ratos com DXB. De acordo com estes resultados, pode-se concluir que os metabólitos acumulados na DXB causam dano ao DNA e que o ômega-3 apresentou efeito protetor quando administrado no período pós-natal. Assim, sugere-se que o ômega-3 possa ser utilizado como um possível adjuvante ao tratamento da DXB.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / A doença da urina do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico de herança autossômica recessiva, causado por uma deficiência da atividade do complexo desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Esta deficiência leva ao acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina, bem como de seus α-cetoácidos correspondentes em tecidos e líquidos corporais de pacientes. O acúmulo destes interfere no metabolismo astrocítico e neuronal, sendo que concentrações elevadas de leucina e do ácido α-cetoisocaproico (CIC) são consideradas particularmente tóxicas ao cérebro. Acredita-se que o CIC seja o mais tóxico dos cetoácidos, visto que esse inibiu o consumo de oxigênio cerebral, induziu estresse oxidativo, provocou deficiência na formação de mielina em cerebelo de ratos e está associado ao aparecimento de sintomas neurológicos. No entanto, até o momento, os mecanismos fisiopatológicos não estão completamente estabelecidos. Considerando que a viabilidade neuronal pode ser afetada pela redução dos fatores neurotróficos e pelo estresse oxidativo, o propósito deste estudo foi avaliar os efeitos neuroquímicos da administração intracerebroventricular (ICV) de CIC sobre estruturas cerebrais de ratos com 30 dias de vida. Analisaram-se os níveis proteicos do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), do pró-BDNF e do fator de crescimento neural (NGF). Também foram avaliados os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), proteínas carboniladas, atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como o dano ao DNA em hipocampo, estriado e córtex cerebral uma hora após a administração ICV de CIC. Os resultados demonstraram que a administração de CIC reduziu os níveis proteicos do BDNF em hipocampo, estriado e córtex cerebral, sem alterar os níveis proteicos de pró-BDNF. Adicionalmente os níveis proteicos de NGF mostraram-se reduzidos em hipocampo, observou-se aumento significativo da concentração do marcador de peroxidação lipídica TBA-RS, bem como da quantidade de proteínas carboniladas em todas as estruturas cerebrais estudadas. A enzima CAT teve sua atividade reduzida no estriado, enquanto que a atividade da SOD se mostrou aumentada em hipocampo e estriado dos animais que receberam CIC. Por fim, a administração ICV de CIC ocasionou aumento significativo do índice e da frequência de danos ao DNA em todas as estruturas estudadas. Em conclusão, esses resultados sugerem que o CIC causa um desequilíbrio nos níveis de neurotrofinas, bem como induz estresse oxidativo. Baseando-se em dados da literatura que demonstram que os metabólitos acumulados na DXB causam desmielinização e prejuízos na memória, especula-se que os efeitos do CIC encontrados neste trabalho possam colaborar para tais achados por causar redução do suporte trófico de BDNF e NGF, pelo estresse oxidativo e dano ao DNA. Além disso, os baixos níveis de BDNF e NGF são consistentes com a hipótese que um déficit nestes fatores neurotróficos pode contribuir para alterações estruturais e funcionais do cérebro subjacentes à fisiopatologia da DXB, apoiando a hipótese do processo neurodegenerativo na DXB.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A doença do xarope do bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α cetoácidos de cadeia ramificada. Como consequência desse bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina, bem como seus αcetoácidos e α hidroxiácidos correspondentes. As principais características clínicas apresentadas pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose convulsões, apnéia, hipoglicemia, coma, ataxia, retardo psicomotor e retardo mental, bem como edema generalizado e hipomielinização/desmielinização, como evidenciado por estudos de ressonância magnética do sistema nervoso central (SNC). No entanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. No presente estudo investigou-se os efeitos da administração aguda de um pool de AACR sobre o imunoconteúdo de alguns marcadores envolvidos na morte celular por apoptose (Bax, Bcl-2, Bcl-xL, caspase 3 e caspase 8), para melhor compreender a fisiopatologia da disfunção neurológica presente nos pacientes com DXB. Ratos Wistar de 10 e 30 dias de vida receberam três administrações de um pool de AACR (15,8 µL/g de peso corporal), com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea (grupo teste). Os animais do grupo controle receberam três administrações de salina, com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea. Uma hora após a última administração, os ratos foram mortos por decapitação, o cérebro foi removido e o hipocampo e córtex cerebral foram isolados. A quantificação das proteínas Bax, Bcl-2, Bcl-xL e as caspases 3 e 8 foram mensuradas por Western blotting. Em ratos de 30 dias foi observado um aumento no imunoconteúdo do fator pró-apoptótico Bax e das caspases 3 e 8 no córtex cerebral, por outro lado, houve diminuição das caspases 3 e 8 concomitantemente com aumento dos fatores anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL no hipocampo. Estes resultados sugerem que os AACR induzem apoptose, ativada pela via extrínseca, seguida da ativação da via intrínseca, no córtex cerebral, porém no hipocampo os parâmetros analisados não demonstram alterações. Os presentes resultados contribuem para explicar, pelo menos em parte, as sequelas neurológicas associadas às altas concentrações plasmáticas dos metabólitos acumulados na doença do xarope do bordo. / A doença do xarope do bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α cetoácidos de cadeia ramificada. Como consequência desse bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina, bem como seus αcetoácidos e α hidroxiácidos correspondentes. As principais características clínicas apresentadas pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose convulsões, apnéia, hipoglicemia, coma, ataxia, retardo psicomotor e retardo mental, bem como edema generalizado e hipomielinização/desmielinização, como evidenciado por estudos de ressonância magnética do sistema nervoso central (SNC). No entanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. No presente estudo investigou-se os efeitos da administração aguda de um pool de AACR sobre o imunoconteúdo de alguns marcadores envolvidos na morte celular por apoptose (Bax, Bcl-2, Bcl-xL, caspase 3 e caspase 8), para melhor compreender a fisiopatologia da disfunção neurológica presente nos pacientes com DXB. Ratos Wistar de 10 e 30 dias de vida receberam três administrações de um pool de AACR (15,8 µL/g de peso corporal), com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea (grupo teste). Os animais do grupo controle receberam três administrações de salina, com intervalo de 1 hora entre as administrações, por via subcutânea. Uma hora após a última administração, os ratos foram mortos por decapitação, o cérebro foi removido e o hipocampo e córtex cerebral foram isolados. A quantificação das proteínas Bax, Bcl-2, Bcl-xL e as caspases 3 e 8 foram mensuradas por Western blotting. Em ratos de 30 dias foi observado um aumento no imunoconteúdo do fator pró-apoptótico Bax e das caspases 3 e 8 no córtex cerebral, por outro lado, houve diminuição das caspases 3 e 8 concomitantemente com aumento dos fatores anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-xL no hipocampo. Estes resultados sugerem que os AACR induzem apoptose, ativada pela via extrínseca, seguida da ativação da via intrínseca, no córtex cerebral, porém no hipocampo os parâmetros analisados não demonstram alterações. Os presentes resultados contribuem para explicar, pelo menos em parte, as sequelas neurológicas associadas às altas concentrações plasmáticas dos metabólitos acumulados na doença do xarope do bordo.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / The urine disease maple syrup (MSUD) is a metabolic disorder of autosomal recessive pattern and, if untreated, causes severe neurological impairments. The pathophysiology of neurological deterioration in DXB is poorly understood; however radiological changes are well characterized. The aim of this study was to investigate whether the branched chain amino acids (BCAA) interfere in the regulation of immune and inflammatory processes in the central nervous system and cause brain swelling and effects of responsible mechanisms, and to evaluate the effects of dexamethasone administration on changes caused by the BCAA. The results demonstrate that acute administration of BCAA in infants rats decreased IL-10 levels and increased IL-6 levels in the hippocampus, cerebral cortex, while there was increase in IL-1β levels of IL-6 and TNF-α. The BCAA administration in young rats did not alter cytokine levels in analyzed brain structures. On the other hand, after chronic administration there was decrease in IL-1β and IL-6 in the cerebral cortex, the hippocampus while there was a decrease in the levels of IL-6, IL-10 and IFN-γ. Therefore, we evaluated the effect of acute administration of BCAA on the water content, the activity of the Na +, K + -ATPase and the permeability of the blood-brain barrier (BBB) in the hippocampus and cerebral cortex of rats infants, and the influence of dexamethasone administration. The results demonstrate that acute administration of cerebral edema caused BCAA, with the increase of water content in the brain. It was also observed a decrease in activity of the Na +, K + -ATPase and an increase in the content of sodium fluorescein, suggesting increased BBB permeability to small molecules, in the hippocampus and cerebral cortex. The dexamethasone administration is capable of preventing cerebral edema, inhibition activity of the Na +, K + -ATPase and was able to maintain the sodium fluorescein content similar to the control group in these structures. Finally, we evaluated the effects of treatment with dexamethasone on the levels of pro inflammatory cytokines and anti-rat infants undergoing acute administration of BCAA. The results demonstrated that treatment with dexamethasone was able to prevent the increase in IL-1β and TNF-α levels in the cerebral cortex and increased IL-6 levels in the hippocampus and cerebral cortex. However, treatment with dexamethasone was unable to prevent a decrease in IL-10 levels caused by administration of BCAA. In conclusion, the results showed that the BCAA induce changes in the immune system in the brain of rats subjected to the experimental model. Coupled with inflammation installed on animals it has been demonstrated that the BCAA cause cerebral edema in rats infants, and these effects may be directly related to inhibition of Na+, K+-ATPase and with increasing BBB permeability, furthermore, it was observed that administration of dexamethasone reversed these effects. / A doença da urina do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio metabólico de caráter autossômico recessivo e, quando não tratada, ocasiona graves sequelas neurológicas. A fisiopatologia da deterioração neurológica na DXB é pouco compreendida; porem as alterações radiológicas estão bem caracterizadas. O objetivo deste trabalho foi investigar se os aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) interferem na regulação de processos imunológicos e inflamatórios no sistema nervoso central e causam edema cerebral bem como avaliar os mecanismos responsáveis por esse efeito e efeitos da administração de dexametasona sobre as alterações provocadas pelos AACR. Os resultados demonstraram que a administração aguda de AACR em ratos infantes diminuiu os níveis de IL-10 e aumentou os níveis de IL-6 no hipocampo, enquanto que no córtex cerebral houve aumento nos níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α. A administração de AACR em ratos jovens não alterou os níveis de citocinas nas estruturas cerebrais analisadas. Por outro lado, após a administração crônica houve diminuição nos níveis de IL-1β e IL-6 no córtex cerebral, enquanto que no hipocampo observou-se diminuição nos níveis de IL-6, IL-10 e IFN-γ. Logo, foi avaliado o efeito da administração aguda de AACR sobre o conteúdo de água, atividade da Na+,K+-ATPase e a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) no hipocampo e córtex cerebral de ratos infantes, e a influência da administração de dexametasona. Os resultados demonstraram que a administração aguda de AACR causou edema cerebral observado pelo aumento do teor de água no cérebro. Observou-se também uma diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase e um aumento no conteúdo de fluoresceína de sódio, sugerindo aumento da permeabilidade da BHE a moléculas pequenas, no hipocampo e córtex cerebral. A administração de dexametrasona foi capaz de prevenir o edema cerebral, a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e foi capaz de manter o conteúdo de fluoresceína de sódio similar ao grupo controle nessas estruturas. Por fim, avaliou-se os efeitos do tratamento com dexametasona sobre os níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias em ratos infantes submetidos à administração aguda de AACR. Os resultados demonstraram que o tratamento com dexametasona foi capaz de impedir o aumento nos níveis de IL-1β e TNF-α no córtex cerebral e aumentar os níveis de IL-6 no hipocampo e córtex cerebral. Entretanto, o tratamento com dexametasona não foi capaz de impedir a diminuição nos níveis de IL-10 causada pela administração de AACR. Em conclusão, os resultados demonstraram que os AACR induzem alterações no sistema imune no cérebro de ratos submetidos ao modelo experimental. Aliado ao processo inflamatório instalado nos animais demonstrou-se que os AACR causam edema cerebral em ratos infantes, e esses efeitos podem estar diretamente relacionados com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase e com o aumento da permeabilidade da BHE, além disso, foi observado que a administração de dexametasona reverteu estes efeitos.

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O catabolismo dessas substâncias forma compostos nitrogenados conhecidos como não–proteicos. Dentre os vários compostos nitrogenados não-proteicos conhecidos, o ácido úrico e a creatinina podem ser utilizados como biomarcadores da função renal em humanos. A creatinina é proveniente da reação não enzimática de desidratação da creatina ou da desfosforilação da fosfocreatina durante o processo de contração muscular; sua concentração é utilizada como marcador clínico para avaliar a função renal. O ácido úrico é formado a partir do metabolismo das bases purínicas, por ser um composto pouco solúvel, sua deposição nas juntas das extremidades ou em outros tecidos moles gera o caso clínico conhecido como gota. Dessa forma, a creatinina e o ácido úrico são constantemente dosados em exames laboratoriais de urina. As metodologias utilizadas para a dosagem desses dois compostos vão desde os métodos clássicos, até a utilização de HPLC, eletroforese e análise em fluxo, ou seja, técnicas pouco portáteis e algumas de alto custo. Assim, a proposta do trabalho é o desenvolvimento de dispositivos analíticos microfluídicos em papel (μPAD) para a determinação de creatinina e ácido úrico. Foram selecionados os reagentes cromogênicos para os dois analitos em estudo. Sendo o ácido pícrico em meio alcalino o reagente cromogênico para a creatinina e o Fe3+ e 1,10-Fenantrolina para o ácido úrico. As condições experimentais das duas reações foram otimizadas utilizando o planejamento fatorial do tipo 2³ e o planejamento composto central. Foram otimizados os fatores concentrações dos reagentes e tempo de aquecimento. A curva de calibração para o ácido úrico foi repetitiva, com equação de reta igual a A = 0,01651 + 0,0003864 CAU, com coeficiente de determinação (R²) igual a 0,997, com limite de detecção igual a 16,5 mg L-1 e de quantificação igual a 54,9 mg L-1. Dos interferentes testados, apenas o ácido ascórbico demonstrou ser interferente da reação e pode ser eliminado borbulhando-se O2 na amostra. A curva de calibração para a creatinina apresenta repetibilidade, com equação de reta igual a A = -0,02229 + 0,0004010 CCRN, com coeficiente de determinação (R²) igual a 0,998, com limite de detecção igual a 15,7 mg L-1 e de quantificação igual a 52,4 mg L-1, não apresentando interferentes para a reação entre os interferentes testados. A metodologia proposta foi aplicada em três urinas sintética e quatro urinas naturais. Os resultados obtidos foram confrontados com uma metodologia cromatográfica descrita na literatura. O teste estatístico de t de Student demonstrou que não houve diferença significativa entre os resultados obtidos do método proposto e o comparativo. / Nitrogen is present in human organism mainly as a nucleic acid and proteins constituent. The catabolism of these substances forms nitrogen compounds known as nonproteinaceous. Among the many nonproteinaceous nitrogen compounds, uric acid and creatinine can be used as biomarkers of renal function in humans. Creatinine is derived from a non-enzymatic reaction of creatine dehydretion or dephosphorylation of phosphocreatine in the muscle contraction process; creatinine concentration is used as clinic marker to evaluate the renal function. Uric acid is formed from metabolism of purine bases and, by being a slightly soluble compound, its deposition in the joints of the extremities or other soft tissues creates a case known as gout. In this way, creatinine and uric acid are constantly dosed in urine laboratory exams. The methodologies used to determine these two compounds range from classic methods, to the used of HPLC, electrophoresis and in flow analysis, in other words, slightly portable techniques and, some of them, very expensive. Thus, this work proposes the development of microfluidic paper-based analytical devices (μPAD) to determinate creatinine and uric acid. Chromogenic reagents were selected for both analytes in study. Picric acid in alkaline medium was chose for creatinine determination and Fe3+ and 1,10-phenantroline were chose for uric acid. Experimental conditions were optimized for both reactions using 23 factorial design and a central composite design. The factores optimized were reagents concentration and time of heating. The analytical curve to uric acid were repetitive, with a line equation equal to A = 0,01651 + 0,00038764 CAU, with determination coefficient (R²) equal to 0,997, and limit of detection equal to 16,5 mg L-1 and limit of quantification equal to 54,9 mg L-1. Of the interferents tested, only ascorbic acid was shown to be interfering the reaction and may be removed by bubbling O2 in the sample. Calibration curve of creatinine shows itself repetitive with a linear equation equal to A = -0,02229 + 0,0004010 CCRN, with linear coefficient (R²) of 0,998; limits of detection and quantification were, respectively, 15,7 mg L-1 and 52,4 mg L-1; and none of the interferentes tested present interference during the determination. The proposed method was applied to three artificial urine samples and four natural urine samples. The obtained results were compared with a chromatographic methodology already described in literature. Statistic Student t-test shows that there is no significant difference between the results obtained by the proposed method and the comparative method. / FAPESP: 2014/17749-7 / CNPq: 132646/2014-5