Le mélanome uvéal, qui origine de la transformation anormale des mélanocytes de l’uvée, et représente la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Plus de 40% des patients ne ressentent ni douleur, ni troubles visuels lors du développement de la tumeur oculaire, ce qui explique le dépistage tardif de ce cancer et la présence de métastases au foie lors du diagnostic initial dans près de la moitié des cas. Une méta-analyse a souligné l’inefficacité des thérapies disponibles étant donné le peu d’études cliniques de phase III complétées dans les 30 dernières années pour traiter le mélanome uvéal métastatique. L’objectif général de mon projet de doctorat consistait à caractériser des mécanismes moléculaires à potentiel thérapeutique dans la progression des métastases du mélanome uvéal qui pourraient être ciblés pour traiter les patients ayant reçu un mauvais pronostic. Mon premier objectif consistait à caractériser les effets de la répression pharmacologique du récepteur 2B de la sérotonine (HTR2B) dans les cellules cancéreuses métastatiques du mélanome uvéal. Nous avons démontré que l’antagoniste sélectif PRX-08066 réduit la viabilité des cellules du mélanome uvéal et la population en mitose et altère leur potentiel d’auto-renouvellement et de migration avec une sensibilité variable d’une lignée à l’autre. De plus, nous avons observé une diminution de la phosphorylation de kinases des voies de signalisation classiquement activées par HTR2B, ainsi que des kinases β-caténine, PYK2 et STAT5 dans les cellules traitées. Mon second objectif consistait à caractériser le profil d’hydroxyméthylation (5-hmC) de l’ADN durant la progression du mélanome uvéal. Nous avons montré une réduction du niveau global de 5-hmC dans les lignées cancéreuses du mélanome uvéal comparativement à la choroïde et aux mélanocytes. De plus, nos analyses ont révélé une diminution de l’expression de l’enzyme IDH1 dans les cellules cancéreuses et une seule lignée comportait une mutation dans ce gène. Mon troisième objectif consistait à tester différents taux d’oxygène (3% vs 21%O2) pour la culture in vitro des lignées mélanocytaires. Nous avons démontré que la morphologie des mélanocytes et leur pigmentation sont légèrement changées lorsqu’exposés à 3% O2 comparativement aux cellules cancéreuses. De plus, leur temps de doublage était significativement plus rapide dans ces conditions. Le profilage génique des mélanocytes choroïdiens n’a pas révélé une longue liste de transcrits considérablement dérégulés entre les deux concentrations d’oxygène : seul le transporteur de lactate MCT4 était dérégulé de manière significative à 3% O2 chez tous les donneurs. Mes travaux de doctorat ont donc permis l’avancement des connaissances sur le promoteur de métastases HTR2B de la signature moléculaire pronostique, l’hydroxyméthylation de l’ADN et l’hypoxie dans le mélanome uvéal, ce qui contribuera au développement d’une thérapie adjuvante ou épigénétique pour améliorer la survie des patients. / Uveal melanoma (UM) originates from the abnormal transformation of uveal melanocytes and is the most common intraocular tumor in adults. More than 40% of patients do not experience pain or visual disturbances during the development of their ocular tumor, which explains the late detection of this cancer in nearly half of the cases, and the presence of liver metastases at the initial diagnosis. A meta-analysis highlighted the ineffectiveness of available therapies given the limited number of phase III clinical studies completed in the past 30 years to treat metastatic UM. The general objective of my PhD project was to characterize molecular mechanisms with therapeutic potential in the metastatic progression of UM that could be targeted to treat patients with poor prognosis. My first objective was to characterize the effects of the pharmacological repression of the serotonin 2B receptor (HTR2B) in metastatic UM cells. We demonstrated that the selective antagonist PRX-08066 reduces both the viability of UM cells and the population in mitosis, and alters their potential for self-renewal and migration, with an interindividual variability in sensitivity. In addition, we observed a decrease in the phosphorylation of kinases of the signaling pathways classically activated by HTR2B, as well as new targets such as β-catenin, PYK2 and STAT5 in the treated cells. My second objective was to characterize the DNA hydroxymethylation profile (5-hmC) during UM progression. We have shown a reduction in the overall level of 5-hmC in UM cell lines compared to choroid and uveal melanocytes. Furthermore, our analyzes revealed a decrease in the expression of the IDH1 enzyme in UM cells and only one UM cell line showed a mutation in this gene. My third objective was to test different levels of oxygen (3% vs 21% O2) for the in vitroculture of melanocytic lines. We showed that the morphology of melanocytes and their pigmentation are slightly changed when exposed to 3% O2compared to UM cells. Moreover, their doubling time was significantly faster under these conditions. The gene profiling of choroidal melanocytes did not reveal a long list of significantly deregulated transcripts between both oxygen concentrations : only the lactate transporter MCT4 was significantly deregulated in all donors at 3% O2. My doctoral work enabled the advancement of knowledge on the HTR2B metastasis promoter from the prognostic molecular signature, DNA hydroxymethylation and hypoxia in UM, which will contribute to the development of an adjuvant or epigenetic therapy to improve patient survival.

Le mélanome uvéal (MU) est le cancer intraoculaire primaire le plus fréquent chez l'adulte et représente 5% des mélanomes. La moitié des patients développent des métastases et 90% de celles-ci sont localisées dans le foie. Le MU métastatique est résistant aux traitements anticancéreux incluant l'immunothérapie. Le foie est un organe où l'immunité est finement régulée grâce à l'activité immunosuppressive de cellules immunitaires et des cellules stellaires hépatiques (CSH). Ces cellules peuvent favoriser une immunosuppression locale par le biais de l'expression de protéines immuno-régulatrices. Mon projet visait à mieux comprendre les mécanismes cellulaires/moléculaires qui mènent à une immunosuppression dans le MU métastatique et comportait deux objectifs spécifiques : 1) l'analyse du microenvironnement tumoral dans des métastases hépatiques de patients à l'aide de marquages immunohistochimiques et 2) l'optimisation d'un modèle in vitro de cocultures avec des cellules cancéreuses du MU (CCMU), des CSH et des cellules immunitaires pour étudier les mécanismes immunosuppressifs dans la niche hépatique. D'abord, des coupes histologiques de métastases hépatiques prélevées sur 11 patients ont été analysées par des méthodes bio-informatiques à la suite de marquages immunohistochimiques pour quantifier les lymphocytes, macrophages, cellules endothéliales et CSH activées. Deux sous-groupes de métastases ont pu être identifiés selon que l'infiltrat immunitaire intra-tumoral était fort ou faible. Les métastases présentant un faible infiltrat immunitaire étaient caractérisées par une forte densité de cellules immunitaires dans la marge. Une haute densité en CSH activées était retrouvée dans la métastase et dans la marge, suggérant une implication des CSH dans l'exclusion des cellules immunitaires de la métastase. Ensuite, un modèle in vitro impliquant la stimulation de cellules immunitaires par des CSH préalablement activées par le milieu conditionné de CCMU a été optimisé. Des analyses de cytométrie en flux du phénotype immunosuppressif des CSH ont révélé une expression élevée de PD-L1 sur ces cellules. Ces expériences ont permis le développement de méthodes d'analyses bioinformatiques de marquages immunohistochimiques de métastases de patients, ainsi que l'optimisation de méthodes de cocultures et d'analyses par cytométrie en flux de différents types cellulaires impliqués dans la formation de métastases hépatiques du MU. / Uveal melanoma (UM) is the most frequent primary intraocular cancer in adults and represents 5% of all melanomas. Half of patients develop metastatic disease, and 90% of them are in the liver. Metastatic UM is remarkably resistant to any treatment currently available, including immunotherapy. The liver is an organ in which immunity is finely regulated thanks to the immunosuppressive activity of immune cells and hepatic stellate cells (HSteCs). These cells could induce immunosuppression through the production of immunoregulatory proteins. My project aimed to get a better understanding of the cell/molecular mechanisms leading to immunosuppression in metastatic UM, and included two specific objectives: 1) the analysis of the tumoral microenvironment in hepatic metastases from patients using immunohistochemical staining and 2) the optimization of an in vitro model of cocultures with UM cells, HSteCs and immune cells to study the immunosuppressive mechanisms in the hepatic niche. First, histological sections of hepatic metastases from 11 UM patients were analyzed using computational methods following immunohistochemical staining to quantify lymphocytes, macrophages, endothelial cells and activated HSteCs. Two subsets of metastases were identified based on whether the intra-tumoral immune infiltrate was strong or weak. Metastases with weak immune infiltrate had a high density of immune cells in the margin. A high density of activated HSteCs was found within the metastasis and the margin, suggesting the involvement of activated HSteCs in the exclusion of immune cells from the metastasis. Next, an in vitro model involving the stimulation of immune cells by HSteCs activated beforehand by the conditioned medium of UM cells was optimized. Flow cytometry analyses characterizing the immunosuppressive phenotype of activated HSteCs revealed a high expression of PD-L1 on these cells. These experiments enabled the development of bioinformatics analysis methods for immunohistochemical stainings of patients' metastases, as well as the optimization of coculture methods and flow cytometry analyses of different cell types involved in UM metastasis formation.