Le transport intracellulaire met en jeu des vésicules et nécessite ainsi des modifications de la membrane plasmique. En particulier, des nanotubes de membrane de quelques dizaines de nanomètres peuvent se former. Nous avons mis en place un système biomimétique à base de liposomes pour décrypter les mécanismes de changement de forme membranaire, en particulier sous l’action du cytosquelette d’actine. La physique des tubes de membrane est bien connue, notamment la force nécessaire au maintien de ce type de tube, qui dépend de l’élasticité de courbure du liposome et de sa tension de membrane imposée par l’aspiration d’une micropipette. En utilisant une diode quatre quadrants, nous avons atteint une résolution temporelle de l’ordre de 4 µs, et une résolution en termes de force plus précise que le pN. Ce montage permet pour la première fois d’étudier les fluctuations de tels tubes. Cette thèse ouvre la voie à l’étude des effets de la polymérisation d’actine sur ces nanotubes / Intracellular transport involves membrane compartments and thus requires dynamic changes in the morphology of cell membranes. In this case, membrane tubes are formed whose radius is of the order of several tens of nanometers. We develop biomimetic systems based on model lipid membranes to decipher the mechanisms of membrane remodelling in particular under the action of the actin cytoskeleton. The mechanics of membrane nanotubes, especially the force needed to form and maintain a nanotube, are now well understood. The force depends on the curvature elasticity of the membrane and on its mechanical tension that is controlled in our experiment by micropipette aspiration. By using a four-quadrant diode, we obtain an unprecedented temporal resolution, in the order of 4 µs, and a force resolution under pN. This setup allows us to access unrivaled membrane nanotube properties.This thesis paves the way for studying the effect of actin dynamics on membrane nanotubes

L'électroperméabilisation est un procédé fondé sur l'application d'impulsions électriques qui peuvent induire une perméabilisation réversible de la membrane plasmique de cellules vivantes. En d'autres termes: si vous soumettez une cellule à des impulsions électriques d'amplitude et de durée judicieusement choisies, vous serez alors en mesure d'introduire dans son cytoplasme des molécules d'intérêt autrement incapables de traverser son enveloppe externe, et ce sans affecter sa viabilité. Cette technique a donné lieu à diverses applications, notamment dans le cadre de la lutte contre le cancer ou des thérapies géniques. Comportant moins de risques que les méthodes de transfection virales ou chimiques, son usage est de plus en plus répandu dans la communauté médicale. Cependant, les processus de réorganisation de la membrane, au niveau microscopique, sont encore méconnus et sujets à débat. Une meilleure description de ces phénomènes permettrait d'améliorer l'efficacité et la sécurité des protocoles de traitement. Une stratégie possible pour accroître notre compréhension de l'électroperméabilisation consiste en la réalisation d'expériences sur des systèmes modèles. Cette thèse aborde l'étude de l'effet d'impulsions électriques perméabilisantes de longue durée (quelques millisecondes) sur des systèmes lipidiques artificiels, des vésicules unilamellaires géantes. Il est décrit comment ce travail sur systèmes modèles a contribué à améliorer notre compréhension fondamentale de l'électroperméabilisation, mais aussi comment il a donné lieu à deux catégories d'applications: le chargement de vésicules avec des macromolécules et la mesure de grandeurs physiques caractéristiques des bicouches lipidiques, les tensions de bord. Ces recherches comportent aussi un aspect de modélisation de l'entrée dans des cellules électroperméabilisées de différentes molécules, via la résolution numérique d'équations aux dérivées partielles gouvernant l'évolution de leur concentration. Cette partie apporte des éléments de réponse visant à expliquer les différences observées expérimentalement entre le transfert de petites et de macromolécules.

Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux...) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J'ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j'ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J'ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J'ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d'électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m'a permis d'étudier tout d'abord l'affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j'ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j'ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J'ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l'élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l'effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d'un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindrique.

Nous démontrons qu'il est possible de former des bicouches fluides non phospholipides en milieu aqueux avec un mélange d'acide palmitique (PA), cholestérol (Chol) et sulfate de cholestérol (Schol) avec une proportion molaire de 30/28/42. Ces liposomes non phospholipidiques peuvent maintenir un gradient de pH (pHinterne 8 / pHexterne 6) sur une période 100 fois plus longue que les liposomes faits de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de cholestérol (60/40 mol/mol). De plus, ces LUV non phospholipidiques protègent l'acide ascorbique d'un milieu oxydant (1 mM de fer (III)). Une fois piégé dans les liposomes, l'acide ascorbique présente une vitesse de dégradation similaire à celle obtenue en l'absence de fer(III). Ces performances illustrent la perméabilité exceptionnellement limitée de ces liposomes, ce qui implique qu'ils peuvent présenter des avantages comme nanocontenants pour certaines applications. D'autre part, des vésicules unilamellaires géantes (GUV pour Giant Unilamellar Vesicles) ont été formées à partir d'un mélange d'acide palmitique et de cholestérol (30/70 mol/mol). Ces GUV sont stables sur l'échelle de temps de semaines, elles ne s'agrègent pas et elles sont sensibles au pH. Afin d'établir la formation des GUV, l'imagerie par microscopie confocale à balayage laser a été utilisée. Deux sondes fluorescentes ont été utilisées: le rouge du Nile, une sonde hydrophobe qui s'insère dans le cœur hydrophobe des bicouches lipidiques, et la calcéine, une sonde hydrophile qui a été emprisonné dans le réservoir interne des GUV. Cette approche a permis l'observation des parois des GUV ainsi que de leur contenu. Ces résultats montrent la possibilité de former de nouveaux microcontenants à partir d'un mélange d'un amphiphile monoalkylé et de stérol. / First, we demonstrate that it is possible to form non-phospholipid fluid bilayers in aqueous milieu with a mixture of palmitic acid (PA), cholesterol (Chol), and cholesterol sulfate (Schol) in a molar proportion of 30/28/42. These non-phospholipid liposomes can sustain a pH gradient (pHinternal 8 / pHexternal 6) 100 times longer than LUVs made of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and cholesterol (60/40 mol/mol). These non-phospholipid LUVs are shown to protect ascorbic acid from an oxidizing environment (1 mM Iron (III)). Once entrapped in these liposomes, ascorbic acid displays a degradation rate similar to that obtained in the absence of Iron (III). This ability illustrates the exceptionally limited permeability of these liposomes, indicating that they can present advantages as nanocontainers for some applications. Second, Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) were formed from a mixture of palmitic acid and cholesterol (30/70 mol/mol). These GUVs were stable over weeks, did not aggregate, and were pH-sensitive. In order to establish their formation, confocal laser scanning microscopy imaging was carried out. Two fluorescent probes were used: Nile Red, a hydrophobic probe that inserted in the hydrophobic core of lipid bilayers, and calcein, a hydrophilic probe that was trapped in the GUV internal pool. This approach allowed observation of both the walls of the GUVs as well as their entrapped content. These results show the possibility to form novel microcontainers from a mixture of a monoalkylated amphiphile and sterols.

Nous démontrons qu'il est possible de former des bicouches fluides non phospholipides en milieu aqueux avec un mélange d'acide palmitique (PA), cholestérol (Chol) et sulfate de cholestérol (Schol) avec une proportion molaire de 30/28/42. Ces liposomes non phospholipidiques peuvent maintenir un gradient de pH (pHinterne 8 / pHexterne 6) sur une période 100 fois plus longue que les liposomes faits de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de cholestérol (60/40 mol/mol). De plus, ces LUV non phospholipidiques protègent l'acide ascorbique d'un milieu oxydant (1 mM de fer (III)). Une fois piégé dans les liposomes, l'acide ascorbique présente une vitesse de dégradation similaire à celle obtenue en l'absence de fer(III). Ces performances illustrent la perméabilité exceptionnellement limitée de ces liposomes, ce qui implique qu'ils peuvent présenter des avantages comme nanocontenants pour certaines applications. D'autre part, des vésicules unilamellaires géantes (GUV pour Giant Unilamellar Vesicles) ont été formées à partir d'un mélange d'acide palmitique et de cholestérol (30/70 mol/mol). Ces GUV sont stables sur l'échelle de temps de semaines, elles ne s'agrègent pas et elles sont sensibles au pH. Afin d'établir la formation des GUV, l'imagerie par microscopie confocale à balayage laser a été utilisée. Deux sondes fluorescentes ont été utilisées: le rouge du Nile, une sonde hydrophobe qui s'insère dans le cœur hydrophobe des bicouches lipidiques, et la calcéine, une sonde hydrophile qui a été emprisonné dans le réservoir interne des GUV. Cette approche a permis l'observation des parois des GUV ainsi que de leur contenu. Ces résultats montrent la possibilité de former de nouveaux microcontenants à partir d'un mélange d'un amphiphile monoalkylé et de stérol. / First, we demonstrate that it is possible to form non-phospholipid fluid bilayers in aqueous milieu with a mixture of palmitic acid (PA), cholesterol (Chol), and cholesterol sulfate (Schol) in a molar proportion of 30/28/42. These non-phospholipid liposomes can sustain a pH gradient (pHinternal 8 / pHexternal 6) 100 times longer than LUVs made of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and cholesterol (60/40 mol/mol). These non-phospholipid LUVs are shown to protect ascorbic acid from an oxidizing environment (1 mM Iron (III)). Once entrapped in these liposomes, ascorbic acid displays a degradation rate similar to that obtained in the absence of Iron (III). This ability illustrates the exceptionally limited permeability of these liposomes, indicating that they can present advantages as nanocontainers for some applications. Second, Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) were formed from a mixture of palmitic acid and cholesterol (30/70 mol/mol). These GUVs were stable over weeks, did not aggregate, and were pH-sensitive. In order to establish their formation, confocal laser scanning microscopy imaging was carried out. Two fluorescent probes were used: Nile Red, a hydrophobic probe that inserted in the hydrophobic core of lipid bilayers, and calcein, a hydrophilic probe that was trapped in the GUV internal pool. This approach allowed observation of both the walls of the GUVs as well as their entrapped content. These results show the possibility to form novel microcontainers from a mixture of a monoalkylated amphiphile and sterols.