Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2006. / Titre de l'écran-titre (visionné le 14 mai 2007). Bibliogr.

Les vecteurs lentiviraux (LVs) dérivés du virus de l’immunodéficience humaine de type I (VIH-1) sont des outils efficaces de transfert de gène, largement utilisés en thérapie génique, en particulier pour la transduction ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPHs). Cette thèse porte sur la caractérisation de deux nouveaux additifs de culture permettant de promouvoir l’entrée des LVs dans les cellules cibles : Vectofusin-1 et Tat-Beclin1. Dans un premier temps, mon travail a consisté à caractériser la structure-fonction de la nouvelle famille de Vectofusins, dérivés du peptide LAH4. Dans cette étude, Nous avons comparé l’efficacité de transduction des CSPHs en présence de différents mutants peptidiques de la Vectofusin-1. Nous avons montré que la Vectofusin-1 est le peptide le plus performant parmi tous les isomères de Vectofusin pour la transduction des CSPHs avec les pseudotypes VSV-G-LV et GALVTR-LV. Nos résultats montrent l’importance de (i) l’angle polaire à 140° formé par les résidus histidine dans la représentation de Schiffer-Edmundson, (ii) la présence de résidus lysine à l’extrémité N-terminale, et (iii) l’utilisation de leucines comme résidus hydrophobes. Ces paramètres cruciaux pour la fonction biologique des peptides de la famille Vectofusin nous permettent de mieux comprendre leur mécanisme d’action. Cette thèse porte également sur l’étude du nouvel additif de culture Tat-Beclin1, décrit dans la littérature comme étant un inducteur d’autophagie et un inhibiteur puissant de la réplication virale, en particulier du VIH-1. De façon surprenante, nous avons observé que l’utilisation de faibles doses de Tat-Beclin1 augmente fortement les niveaux de transduction de lignées cellulaires et de CSPHs en présence de divers pseudotypes LVs. Au sein de cette étude nous avons montré que ce peptide Tat-Beclin1 est compatible avec une application en thérapie génique grâce à l’absence de cytotoxicité que ce soit ex vivo ou in vivo lors de l’utilisation de modèle murin humanisé NSG pour la greffe de CSPHs. Le peptide Tat-Beclin1 agit au niveau de l’étape d’entrée, en potentialisant l’adhésion et la fusion virale, sans induire l’agrégation des particules virales. Des études du flux autophagique montrent que Tat-Beclin1 n’induit pas d’autophagie aux faibles doses utilisées. Ceci suggère que ce nouvel additif de culture agit à travers des voies moléculaires encore inconnues impliquant probablement des voies de signalisation intracellulaire indépendantes de l’autophagie. En conclusion, ce travail de thèse permet de décrire Tat-Beclin1 et Vectofusin-1 comme des nouveaux additifs de culture performants pour promouvoir la transduction de cellules cibles avec des LVs de thérapie génique. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-derived Lentiviral vectors (LVs) are used for various gene transfer applications, notably hematopoietic gene therapy. Culture additives are necessary to promote an efficient entry of LVs into hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). This work highlights two culture additives: Vectofusin-1 and Tat-Beclin1. First, we studied the structure-function of the new family of culture additives derived from LAH4: Vectofusins. We designed Vectofusin-1 isomers and showed that Vectofusin-1 remains the lead peptide for HSPCs transduction enhancement with LVs pseudotyped with VSV-G and GALVTR envelope glycoproteins. By comparing the efficiency of numerous Vectofusin-1 mutants, it appeared the importance of (i) lysine residues on the N-terminal extremity of Vectofusin-1, (ii) a hydrophilic angle of 140° formed by histidine residues in the Schiffer-Edmundson helical wheel representation, and (iii) hydrophobic residues consisting of leucine are all essential and help to define a minimal active sequence leading to an optimal activity of the Vectofusin-1 peptide. This work also allowed the discovery of a new culture additive called Tat-Beclin1, previously described as an autophagy-inducer peptide and a powerful viral replication inhibitor, especially on HIV-1. In this study, we showed that the use of low doses of Tat-Beclin1 peptide strongly promotes the transduction of cell lines or HSPCs with LVs pseudotyped with various envelope glycoproteins. The use of low doses of Tat-Beclin1 peptide is compatible with a gene therapy application since these experiments showed no cytotoxic effect either ex vivo or in vivo using a humanized mice model of HSPCs engraftment. The Tat-Beclin1 peptide is acting on the viral entry, specifically on the adhesion and fusion steps, but without inducing any aggregation of the viral particles. Studies of the autophagic flux showed that Tat-Beclin1 is not inducing this pathway at the low doses tested. Therefore, Tat-Beclin1 is acting on LVs through signaling pathways that are still to be defined. In conclusion, Tat-Beclin1 and Vectofusin-1 peptides are performant and safe transduction enhancers for retrovirus-based vectors dedicated to gene therapy.

Le polyéthylène glycol (PEG) a longtemps été considéré comme biologiquement inerte, mais il est maintenant clair que non seulement les anticorps antiPEG existent, mais qu'aussi ceux-ci peuvent être répandus dans la population. Actuellement, le mécanisme par lequel ces anticorps se lient et interagissent avec les protéines plasmatiques est encore à l'étude. Cependant, nous savons qu'ils sont responsables du phénomène de clairance accélérée (ABC) et de certains effets néfastes comme : l'hypersensibilité et l'anaphylaxie. D'ailleurs, une étude récente suggère que 7% de la population préexposée (72%) au PEG possèdent un taux d'anticorps élevés (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), ce qui les rend plus sujets à faire des réactions allergiques.¹ ² Entre autres, six personnes sur 272 000 auraient été atteintes d'anaphylaxie, potentiellement causée par la présence du PEG, lors de l'injection du vaccin de Pfizer-BioNTech contre la COVID-19 en date de décembre 2020. Il est important au fur et à mesure que nous développons des modalités thérapeutiques utilisant des polymères, d'évaluer leurs effets in vivo. Plusieurs alternatives au PEG ont été proposées comme le polyvinylpyrrolidone, le poly(N-isopropylacrylamide), le poly(glycérol) et le poly(2-oxazoline). Malheureusement, à ce jour, aucun de ces polymères n'a encore réussi à être approuvé pour des applications biomédicales et pharmaceutiques. Les objectifs de cette étude étaient dans un premier temps de synthétiser un polymère qui pourrait potentiellement remplacer le PEG à la surface de vecteurs pharmaceutiques tels que les liposomes ou les nanoparticules. Un polymère alkylé à base de monoglycérol acrylate a été incorporé dans une formulation de liposomes. Dans un deuxième temps, l'ancrage de ce polymère à la surface du vecteur a été évalué. Nos résultats démontrent que son caractère amphiphile, créé par une ou des chaînes alkyles influence l'ancrage des polymères dans la bicouche lipidique et ainsi sa réponse in vivo. / For a long time, polyethylene glycol (PEG) has been considered as biologically inert, but it is now clear that not only antiPEG antibodies do exist , but also, they can be widespread in the general population. Currently, the mechanism by which these antibodies bind to the plasmatic proteins is still under investigation. However, they are responsible for the phenomenon of accelerated blood clearance and some adverse effects such as hypersensitivity and anaphylaxis. Moreover, recent studies suggest that 7% of the population pre-exposed (72%) to PEG have a high level of antibodies (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), making them susceptible to allergic reactions.¹ ² Among other things, 6 out of 272 000 people did suffer from anaphylaxis during the injection of Pfizer-BioNTech's COVID-19 vaccine last December, potentially because of the presence of PEG in the formulation. It is therefore very important as we develop therapeutic modalities using polymers, to assess their effects in vivo. Several alternatives have been proposed to PEG such as polyvinylpyrrolidone, poly(N-isopropylacrylamide), poly(glycerol) and poly(2-oxazoline). Unfortunately, to date none of these polymers have yet succeeded reaching the FDA approved PEG standard. The objectives of this study were initially to synthesise a polymer which could potentially replace PEG on the surface of pharmaceutical vectors such as liposomes or nanoparticles. An amphiphilic polymer based on monoglycerol acrylate was incorporated into a liposome formulation. Secondly, the anchoring of this polymer to the surface of our vector was evaluated using several techniques. Our results demonstrate that the amphiphilic character, created by one or many alkyl chains is important, and it influences drastically the anchoring of the polymer into the bilayer but also the pharmacokinetic (PK) of the nanocarrier.

Le polyéthylène glycol (PEG) a longtemps été considéré comme biologiquement inerte, mais il est maintenant clair que non seulement les anticorps antiPEG existent, mais qu'aussi ceux-ci peuvent être répandus dans la population. Actuellement, le mécanisme par lequel ces anticorps se lient et interagissent avec les protéines plasmatiques est encore à l'étude. Cependant, nous savons qu'ils sont responsables du phénomène de clairance accélérée (ABC) et de certains effets néfastes comme : l'hypersensibilité et l'anaphylaxie. D'ailleurs, une étude récente suggère que 7% de la population préexposée (72%) au PEG possèdent un taux d'anticorps élevés (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), ce qui les rend plus sujets à faire des réactions allergiques.¹ ² Entre autres, six personnes sur 272 000 auraient été atteintes d'anaphylaxie, potentiellement causée par la présence du PEG, lors de l'injection du vaccin de Pfizer-BioNTech contre la COVID-19 en date de décembre 2020. Il est important au fur et à mesure que nous développons des modalités thérapeutiques utilisant des polymères, d'évaluer leurs effets in vivo. Plusieurs alternatives au PEG ont été proposées comme le polyvinylpyrrolidone, le poly(N-isopropylacrylamide), le poly(glycérol) et le poly(2-oxazoline). Malheureusement, à ce jour, aucun de ces polymères n'a encore réussi à être approuvé pour des applications biomédicales et pharmaceutiques. Les objectifs de cette étude étaient dans un premier temps de synthétiser un polymère qui pourrait potentiellement remplacer le PEG à la surface de vecteurs pharmaceutiques tels que les liposomes ou les nanoparticules. Un polymère alkylé à base de monoglycérol acrylate a été incorporé dans une formulation de liposomes. Dans un deuxième temps, l'ancrage de ce polymère à la surface du vecteur a été évalué. Nos résultats démontrent que son caractère amphiphile, créé par une ou des chaînes alkyles influence l'ancrage des polymères dans la bicouche lipidique et ainsi sa réponse in vivo. / For a long time, polyethylene glycol (PEG) has been considered as biologically inert, but it is now clear that not only antiPEG antibodies do exist , but also, they can be widespread in the general population. Currently, the mechanism by which these antibodies bind to the plasmatic proteins is still under investigation. However, they are responsible for the phenomenon of accelerated blood clearance and some adverse effects such as hypersensitivity and anaphylaxis. Moreover, recent studies suggest that 7% of the population pre-exposed (72%) to PEG have a high level of antibodies (immunoglobuline G ˃ 500 ng/mL), making them susceptible to allergic reactions.¹ ² Among other things, 6 out of 272 000 people did suffer from anaphylaxis during the injection of Pfizer-BioNTech's COVID-19 vaccine last December, potentially because of the presence of PEG in the formulation. It is therefore very important as we develop therapeutic modalities using polymers, to assess their effects in vivo. Several alternatives have been proposed to PEG such as polyvinylpyrrolidone, poly(N-isopropylacrylamide), poly(glycerol) and poly(2-oxazoline). Unfortunately, to date none of these polymers have yet succeeded reaching the FDA approved PEG standard. The objectives of this study were initially to synthesise a polymer which could potentially replace PEG on the surface of pharmaceutical vectors such as liposomes or nanoparticles. An amphiphilic polymer based on monoglycerol acrylate was incorporated into a liposome formulation. Secondly, the anchoring of this polymer to the surface of our vector was evaluated using several techniques. Our results demonstrate that the amphiphilic character, created by one or many alkyl chains is important, and it influences drastically the anchoring of the polymer into the bilayer but also the pharmacokinetic (PK) of the nanocarrier.

Thèse de doctorat : Pharmacologie : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En thérapie génique ex vivo, les vecteurs lentiviraux peuvent être utilisés pour transduire les progéniteurs hématopoïétiques. Mais l’utilisation de vecteurs intégratifs non site-spécifique peut conduire à une mutagénèse insertionnelle. J’ai évalué le niveau de transduction des progéniteurs hématopoïétiques en mesurant le nombre de copies de vecteur intégrées dans des colonies cellulaires isolées. Il a été montré que la fréquence des cellules transduites et la distribution du nombre de copies de vecteur intégrées peut dépendre des conditions expérimentales. L’utilisation de vecteurs ciblant l’insertion du transgène à un site précis du génome permettrait de surmonter les problèmes de génotoxicité. Les introns de groupe II sont des éléments génétiques auto-épissable mobiles pouvant d’intégrer à un site précis du génome. Ils sont utilisés en ciblage génomique chez les procaryotes, mais pas chez les eucaryotes, probablement dû à une activité catalytique limitée dans ces cellules. J’ai étudié l’intron de groupe II Pl.LSU/2 de Pylaiella littoralis, qui est le seul capable de s’auto-épisser à des concentrations très faibles de magnésium. La protéine codée par l’intron Pl.LSU/2 (IEP) exprimée chez Escherichia coli a été purifiée et a montré une activité de transcriptase inverse soit seule, soit associée à l’intron ARN. Il a été montré que l’intron Pl.LSU/2 peut s’épisser chez Saccharomyces cerevisiae et que l’efficacité de l’épissage est augmentée par l’activité maturase de l’IEP. Cependant, les transcrits épissés ne sont pas traduits, et l’épissage de l’intron n’a pas été démontré dans les cellules humaines, tout comme le homing de l’intron chez E. coli et S. cerevisiae. / In ex vivo hematopoietic gene therapy, lentiviral vectors can be used to transduce hematopoietic progenitors. However, the use of non site-specific integrating vectors may lead to insertional mutagenesis. I evaluated the level of transduction of hematopoietic progenitor cells at the single-cell level by measuring vector copy number in individual colony-forming cell units. It was shown that the frequency of transduced progenitor cells and the distribution of VCN in hematopoietic colonies may depend upon experimental conditions. Nevertheless, the use of vectors that can target the integration of the transgene into a specific-site of the host genome would overcome genotoxicity issues. I evaluated the use of a group II intron for genomic targeting. Group II introns are self-splicing mobile elements that can integrate into precise genomic locations by homing. Engineered group II introns are commonly used for targeted genomic modifications in prokaryotes but not in eukaryotes, probably due limited catalytic activation in these cells. I studied the brown algae Pylaiella littoralis Pl.LSU/2 group II intron which is uniquely capable of in vitro ribozyme activity at unusually low level of magnesium. Recombinant Pl.LSU/2 IEP expressed in Escherichia coli was purified and showed a reverse transcriptase activity either alone or associated with intronic RNA. The Pl.LSU/2 intron was showed to splice accurately in Saccharomyces cerevisiae and splicing efficiency was improved by the maturase activity of the intron-encoded protein. However, spliced transcripts were not expressed, and intron splicing was not detected in human cells, as well as homing of Pl.LSU/2 in E. coli and S. cerevisiae.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Thèse de doctorat : Chimie : Strasbourg : 2009. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 9 p.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2008. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p 131-141.