O Melanoma é um tipo de neoplasia que se origina de melanócitos normalmente presentes na epiderme. Uma das características do melanoma é a capacidade de adquirir resistência a terapias. As células de melanoma podem aumentar a liberação de vesículas extracelulares (VEs) em resposta ao tratamento com quimioterápicos. A cisplatina (CDDP) e a temozolomida (TMZ) são drogas utilizadas para o tratamento de tumores. Ambas as drogas formam adutos no DNA, mas as vias de sinalização que deflagram a morte celular são distintas. O objetivo desse estudo é investigar a morte celular da linhagem B16-F10 na presença de VEs oriundas de células B16-F10 tratadas com cisplatina CDDP ou TMZ. Inicialmente as VEs oriundas de células de melanoma murino, B16-F10, tratadas com CDDP ou TMZ e seus controles, foram isoladas por ultracentrifugações sucessivas. Para os experimentos in vitro, as células foram tratadas com as drogas em combinação com as respectivas VEs. As amostras foram realizados avaliações de ciclo celular e de morte e ensaio clonogênico. Para os experimentos in vivo, as células B16-F10 foram pré-tratadas com VEs, e posteriormente, as células foram inoculadas via subcutânea em camundongos C57BL/6 e os tumores foram mensurados diariamente. Em nosso estudo concluimos que a metodologia do isolamento de VEs é eficiente. Além disso, observamos que o tratamento com CDDP ou TMZ aumenta a liberação de VEs por células tumorais. Apesar do resultado contraditorio, as VEs liberadas por células tumorais tratadas com quimioterápicos aumentam a capacidade de sobrevivência das células de melanoma in vitro. VEs oriundas de células de melanoma não participam inicialmente da sensibilização à morte de células tumorais causada pelas mesmas drogas, mas a longo prazo, as VEs oriundas de células tratadas com a TMZ podem conferir uma resposta celular de sobrevivência às células tumorais in vitro. In vivo, o resultado é inconclusivo, uma vez que para confirmar se as VEs fazem parte da adaptação tumoral conferindo fenômenos de sobrevivência celular in vivo, é necessário avaliar em outros modelos celulares e animais / Melanoma is a neoplasm derived from melanocytes normally present in the skin specifically in the epidermis. One of the malignancies of melanoma is the ability to acquire chemoresistance. Cisplatin (CDDP) and temozolomide (TMZ) are drugs used for the treatment of tumors. Both drugs can form alkylating adducts in DNA, however, the pathways that trigger cell death are distinct. Tumor cells, including melanoma, may increase the release of extracellular vesicles (EVs) in response to chemotherapeutic treatment. The aim of this study is to investigate the cell death phenomenon in B16-F10 cell line in presence of EVs derived from chemotherapeutic-treated B16-F10 cells. For in vitro experiments, the cells were treated with CDDP or TMZ in combination with EVs from chemotherapictreated samples. For in vivo experiments, B16-F10 cells were exposed to EVs and inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. The growth was measured daily. In this work, we established and characterized VEs released by melanoma cells treated with chemotherapics and we established chemotherapics treatments to isolate EVs for next EVs isolation. Our results showed that CDDP or TMZ treatment increase the release of EVs by tumor cells. The EVs released by melanoma cells after CDDP or TMZ treatment seem to increase the survival capacity of melanoma cells. Thus, we concluded that EVs derived from melanoma cells do not participate in the cell death sensitization induced by CDDP or TMZ. However, EVs derived from TMZ treated cells may offer a survival effect to tumor cells in vitro a long term. In vivo, The result is inconclusive since to confirm how VEs are part of the tumor adaptation conferring cellular survival phenomena in vivo, it is necessary to evaluate in other cellular and animal models

Na primeira parte deste trabalho foi estudada a interação da porfirina catiônica meso-tetrakis N-metil-4-piridil (TMPyP) e a porfirina aniônica meso-tetrakis 4-fenilsulfonato (TPPS4) nas formas de base livre com sistemas modelos de membrana biológica (micelas iônicas, micelas mistas e vesículas de fosfolipídios) em soluções aquosas, através das técnicas de absorção ótica, espalhamento de luz ressonante (RLS do inglês \"resonante light scattering), fluorescência e SAXS, do inglês \"Small Angle X-Ray Scattering\". As curvas de SAXS das micelas catiônicas de CTAC (cloreto de cetiltrimetilamônio) foram ajustadas como um elipsóide prolato na ausência e na presença de 2-10 mM de TPPS4. Os dados de SAXS mostraram que a presença da porfirina TPPS4 modifica o centro hidrofóbico micelar, levando a formação de micelas menores. Através das análises dos dados de SAXS das micelas de SDS (dodecilsulfato de sódio) observamos que a forma da micela na ausência e na presença de 2-10 mM TMPyP apresenta a forma de um elipsóide prolato sem mudanças. Entretanto, o coeficiente de ionização, diminuiu com o aumento da concentração de porfirina, sugerindo a \"blindagem\" da carga aniônica do SDS pela porfirina catiônica. A supressão de fluorescência da TPPS4 e TMPyP foi estudada na ausência e na presença de diferentes micelas de surfactantes, tais como as de SDS, CTAC, HPS (N-hexadecil-N,N,dimetil-3-amônio-1-propano sulfato) e TX-100 (t-octil-fenoxi-polietoxi-etanol). O iodeto de potássio (KI) foi utilizado como supressor. Os gráficos de Stern-Volmer dos dados de fluorescência no estado estacionário foram ajustados pela equação quadrática, incluindo a supressão dinâmica (KD) e estática (KS). Os valores de KS são muito menores do que os valores de KD. Os resultados da TMPyP são consistentes com as constantes de ligação reportadas na literatura: uma redução significativa de supressão acontece para a TMPyP na presença de SDS, e uma redução moderada é observada para o sistema TMPyP-HPS e quase nenhuma mudança é vista para a TMPyP na presença de TX-100. Para o sistema CTAC-TPPS4 um aumento na supressão foi observado quando comparada com a TPPS4 em tampão puro. Isto provavelmente é associado ao acúmulo de iodeto na interface da micela catiônica. A atração entre a cabeça polar do CTAC e I-, e a repulsão entre SDS e I-, aumenta e reduz a supressão de fluorescência, respectivamente, das porfirinas que se localizam na interface micelar. A pequena supressão da TPPS4 em TX-100 é coerente com a forte ligação entre a TPPS4-TX-100 reportada na literatura. A TPPS4 e a TMPyP na presença de concentrações baixas dos surfactantes CTAC e SDS, respectivamente, apresentaram formação de agregados pré-micelares. A adição de surfactante neutro, TX-100, reduziu o efeito de agregação, acompanhada pelas várias técnicas espectroscópicas utilizadas neste trabalho. Portanto, sob condições onde temos a máxima formação de agregados (porfirina-surfactante), a titulação da TPPS4 com micelas de 40%CTAC-60%TX-100 e a TMPyP com micelas de 80%SDS-20%TX-100 não foi suficiente para eliminar a agregação, apesar da diminuição significativa do efeito de supressão de fluorescência e da intensidade de luz espalhada. A interação da TMPyP com 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicero)] (POPG) e a mistura POPC + POPG é predominantemente devido à contribuição de eletrostática. O aumento da carga negativa, devido à adição de POPG, favorece a interação das vesículas com a porfirina catiônica. Na segunda parte deste trabalho foram estudados os efeitos de três surfactantes na estrutura oligomérica da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) na sua forma oxi. O estudo com o SDS, CTAC e HPS permitiu diferenciar os efeitos de cargas opostas da cabeça polar dos surfactantes na dissociação da estrutura oligomérica e na autoxidação da hemoglobina. A interação do HPS com HbGp foi claramente menos intensa que a interação desta hemoglobina com os surfactantes catiônico (CTAC) e aniônico (SDS). Provavelmente, esta menor interação da HbGp com HPS, quando comparada com o SDS e o CTAC, é devido a menor atração eletrostática entre o HPS e os sítios iônicos da proteina. Dados espectroscópicos foram discutidos e comparados com os da literatura, afim de compreender a interação hemoglobina-surfactante, e como o ponto isoelétrico ácido (pI) pode influenciar na relação da estrutura-atividade das hemoglobinas gigantes extracelulares. As amostras de HbGp foram estudadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS do inglês \"Dynamic light scattering\"). Na faixa de pH 6.0 a 8.0, HbGp é bastante estável e a distribuição de tamanho das partículas é monodispersa com um diâmetro hidrodinâmico médio (Dh) de 27 nm. O aumento dos valores de pH (pH>9.0) induziu um processo de dissociação irreversível, resultando num valor do Dh menor (10 nm). A diminuição do Dh sugere uma dissociação completa da hemoglobina. Em pH>9,0 a cinética de dissociação é lenta, com um mínimo 24 h para ser completada. As constantes cinéticas de dissociação aumentam progressivamente, com o aumento do valor do pH. As curvas de melting point para HbGp apresentaram dissociação oligomérica e desnaturação da proteina em função do pH. Os processos de autoxidação e dissociação estão intimamente relacionados, de modo que a dissociação da proteina oligomérica promove um aumento na velocidade de autoxidação e vice-versa. / In the first part of this work interactions of the cationic meso tetrakis (4-N-methilpyridil) porphyrin (TMPyP) and meso-tetrakis (4-sulfonatophenyl) porphyrin (TPPS4) in the free base forms with membrane model systems (ionic micelles, mixed micelles and phospholipids vesicles) in aqueous solutions, have been investigated by optical absorption, resonance light scattering (RLS), fluorescence and SAXS (Small Angle X-Ray Scattering). The best-fit SAXS curves were obtained assuming for cetyltrimethylammonium chloride (CTAC) micelle a prolate ellipsoidal shape in the absence and upon incorporation of 2-10 mM TPPS4. SAXS results show that the presence of TPPS4 impacts on micellar hydrophobic core, leading to a micellar reassembling into smaller micelles. SAXS data analysis demonstrated a prolate ellipsoidal shape for sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles; no significant changes in shape and size were observed for SDS-TMPyP co-micelles. Moreover, the ionization coefficient, α, decreases with the increase of the porphyrin concentration, suggesting the \"screening\" of the anionic charge of SDS by the cationic porphyrin. These results are consistent with optical absorption, fluorescence and RLS spectroscopies data, allowing to conclude that neutral surfactants present a smaller interaction with the cationic porphyrin as compared with ionic surfactants. Fluorescence quenching of TPPS4 and TMPyP is studied in aqueous solution and upon addition of micelles of SDS, CTAC, N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1- propanesulfonate (HPS) and t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100). Potassium iodide (KI) was used as quencher. Steady-state Stern-Volmer plots were best fitted by a quadratic equation, including dynamic (KD) and static (KS) quenching. KS was significantly smaller than KD. For TMPyP quenching results are consistent with reported binding constants: a significant reduction of quenching takes place for SDS, a moderate reduction is observed for HPS and almost no change is seen for Triton X-100. For CTAC-TPPS4 system an enhancement of quenching was observed as compared to pure buffer. This is probably associated to accumulation of iodide at the cationic micellar interface. The attraction between CTAC headgroups and I-, and repulsion between SDS and I-, enhances and reduces the fluorescence quenching, respectively, of porphyrins located at the micellar interface. The small quenching of TPPS4 in Triton X-100 is consistent with strong binding as reported in the literature. Anionic TPPS4 and cationic TMPyP in the presence of low concentrations of the surfactants CTAC and SDS, respectively, showed formation of aggregates, monitored by optical absorption, fluorescence and resonance light scattering intensity (RLS). The addition of nonionic surfactant, Triton X-100, reduced the effect of aggregation monitored by the various techniques used in the present work. Therefore, under conditions for the maximum of aggregate formation (porphyrin-surfactant), apparently, the CTAC: TX-100 ratio equal to 40:60 and SDS:TX-100 ratio equal to 80:20 are not sufficient to eliminate aggregation, despite the significant decrease of the quenching effect of fluorescence and of the light scattering intensity. The interaction of TMPyP with 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (POPC), 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1- glycerol)] (POPG) and the mixture POPC+POPG is predominantly due to the electrostatic contribution. The increase of the negative charge, due to addition of POPG, favors the interaction of vesicles with the cationic porphyrin. On the second part of this work the effects of three surfactants upon the oligomeric structure of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in the oxy - form was studied. The use of SDS, CTAC and HPS has allowed to differentiate the effects of opposite headgroup charges on the oligomeric structure dissociation and hemoglobin autoxidation. Furthermore, the interaction of HPS with HbGp was clearly less intense than the interaction of this hemoglobin with cationic (CTAC) and anionic (SDS) surfactants. Probably, this lower interaction with HPS is due to the lower electrostatic attraction between the HPS surfactant and the protein surface ionic sites when compared to the electrostatic interaction between HbGp and cationic and anionic surfactants. Spectroscopic data are discussed and compared with the literature in order to improve the understanding of hemoglobin-surfactant interaction as well as the acid isoelectric point (pI) influence of the giant extracellular hemoglobins on its structure-activity relationship. HbGp samples were studied by dynamic light scattering (DLS). In the pH from range 6.0 to 8.0, HbGp is stable and a monodisperse size distribution with a z-average hydrodynamic diameter (Dh) of 27±1 nm is observed. More alkaline pH (pH>9.0) induced an irreversible dissociation process, resulting in smaller Dh of 10±1 nm. Dh decrease suggests a complete hemoglobin dissociation. At pH 9.0 the dissociation kinetics is slow, taking a minimum of 24 h to be completed. Dissociation rate constants progressively increase at higher pH. Melting curves for HbGp showed oligomeric dissociation and protein denaturation as a function of pH. Autoxidation and dissociation processes are intimately related, so that oligomeric protein dissociation promotes the increase of autoxidation rate and vice-versa.

Hidrogéis (redes poliméricas tridimensionais capazes de absorver grandes quantidades de água) micro e nanoestruturados têm grande potencial como biomateriais em aplicações tais como dispositivos de liberação de fármacos e agentes embólicos. Neste trabalho foram estudadas técnicas de produção desses hidrogéis micro e nanoestruturados à base de poli(N-vinil-2-pirrolidona) (PVP), a partir da reticulação do polímero através de reações de Fenton, foto-Fenton e fotólise direta. Microgéis de PVP foram obtidos a partir da reticulação de esferas obtidas por eletropulverização ou de gotículas de solução aquosa do polímero em emulsão a/o. No primeiro caso, obtiveram-se partículas que, quando reticuladas com a reação de Fenton durante o processo de eletropulverização, apresentaram formato indefinido. No segundo caso, foram obtidas microesferas de PVP, tanto pela reticulação com a reação de Fenton, obtendo-se partículas menores da - ordem de 1 µm - como com a reação de foto-Fenton, que gerou partículas maiores de - 34 µm. Hidrogéis sub-micrométricos foram obtidos a partir da formatação em vesículas de lecitina e reticulados por meio da reação de foto-Fenton. Essas vesículas foram capazes de encapsular grande quantidade de polímero, mesmo sendo este de alta massa molar média. Os hidrogéis sintetizados apresentam estreita distribuição de diâmetro, porém sem forma definida e com baixo índice de intumescimento. Por fim, nanogéis (nanopartículas de hidrogéis) foram obtidos da reticulação de PVP com a reação de Fenton (Fe2+ na presença de H2O2), utilizando como sistema formatador o interior aquoso de micelas reversas de CTAB. Os nanogéis assim formados são esféricos e apresentam propriedades interessantes, como fator de intumescimento de até 6000, inédito na literatura, que os colocam na categoria de hidrogéis superabsorventes. Além disso, o intumescimento é passível de controle tanto pela remoção dos íons Fe3+ complexados, como pela acidez e composição iônica do meio. Durante o desenvolvimento da síntese dos nanogéis foi possível estudar a influência do Fe3+ na estruturação da solução polimérica e do hidrogel. Além disso, a cinética da reticulação do polímero dentro das micelas e uma comparação entre dois sistemas micelares diferentes na formatação do nanogel foram analisados. A análise do produto também permitiu constatar a baixa toxicidade do material obtido com testes in vitro utilizando macrófagos e fibroblastos. / Micro and nanostructured hydrogels (three-dimensional polymeric networks capable of absorbing large amounts of water) have great potential as biomaterials in applications such as drug delivery devices and embolic agents. In this work techniques to produce micro and nanostructured hydrogels from poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) (PVP) were studied from various crosslinking reactions like Fenton, photo-Fenton and direct photolysis. PVP microgels were obtained from crosslinking of polymer spheres obtained by electrospraying a polymer solution or from droplets of aqueous polymer solution in w/o emulsion. In the first case, particles were obtained that, when crosslinked with the Fenton reaction, showed undefined morphology. In the second case, spherical PVP hydrogel microparticles were obtained, which were formed by crosslinking with Fenton reaction, resulting in smaller particles - about 1µm - while with photo-Fenton reaction it generated larger particles - about 34 µm. Sub-micrometric hydrogels were obtained from lecithin vesicles as formatting system through crosslinking with photo-Fenton reaction. These vesicles were able to encapsulate large amounts of polymer, in spite of its high average molecular weight. Hydrogels synthesized by this method are formless, with narrow diameter distribution and low swelling properties. Finally, nanogels (hydrogel nanoparticles) were obtained from crosslinking of PVP by the Fenton reaction (Fe2+ in presence of H2O2), using aqueous pool of CTAB reverse micelles as formatting system. The thus formed nanogels are spherical and present interesting properties such as swelling ratio of 6000, a level unreported in literature, which classifies them as superabsorbent hydrogels. Moreover, the swelling is susceptible to control either by the removal of complexed Fe3+ ions or by acidity and ionic composition of the medium. During the nanogels synthesis development, the influence of Fe3+ in the arrangement of the polymer solution and of the hydrogel was studied. Morever, the polymer crosslinking kinetics inside the micelles and a comparison between two different micellar systems in formatting of nanogel were analyzed. The product analysis also revealed low toxicity of the obtained material by in vitro experiments using macrophages and fibroblasts.

As células que compõem o tumor podem interagir entre si, através da liberação e incorporação de vesículas extracelulares, muitas vezes contribuindo para a progressão tumoral. Dessa maneira, o presente trabalho teve como objetivo observar se as vesículas extracelulares , como as microvesículas e os exossomas liberados pelas células cancerosas em condições de estresse celular, após quimioterapia e indução de hipóxia conferem alguma vantagem adaptativa às células tumorais. Nossos resultados mostram que vesículas liberadas por células de melanoma humano em hipóxia ou normóxia apresentam tamanho médio característico de exossomos e microvesículas e não modulam os processos de proliferação, morte e migração celular. As vesículas liberadas pelas células após tratamento com o quimioterápico temozolamida também apresentam tamanho característico de exossomos e microvesículas; em adição, o tratamento com a temozolamida induziu um aumento na secreção dessas vesículas pelas células de melanoma. A incubação das células tumorais com vesículas oriundas da terapêutica com a temozolamida aumentou a proliferação celular, conferindo vantagem proliferativa às células de melanoma humano / Tumor cells can interact with each other by releasing and incorporating extracellular vesicles, contributing to tumor progression. Therefore, the aim of this study was to evaluate if extracellular vesicles, such as microvesicles and exossomes, released by cancer cells under cell stress conditions like chemotherapy and hypoxia, induce an adaptive advantage to tumor cells. Our results show that vesicles shed by human melanoma cells under hypoxia, or normoxia exhibit the characteristic size of exossomes and microvesicles and do not modulate cell proliferation, death or migration. The vesicles released by melanoma cells after temozolomide treatment also showed the average size of exossomes and microvesicles; moreover, temozolomide treatment induced an increase in extracellular vesicles shedding by tumor cells. Incubation of tumor cells with vesicles released under temozolamide therapeutics caused an increase in cell proliferation, providing a proliferative advantage to human melanoma cells

Orientador: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: O uso de animais de grande porte como sorodoadores tem se mostrado de grande importância para a produção do selante de fibrina do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP). O objetivo deste trabalho foi certificar um plantel de bubalinos, realizar uma investigação sobre os potenciais candidatos à biomarcadores de brucelose em soro de búfalos e evidenciar o isolamento e a quantificação pioneira de exossomos (EVs) do soro de bubalinos com theileriose e babesiose. Realizaram-se os seguintes testes sorológicos: brucelose (BRU), leptospirose (LEP), febre aftosa (FMD), rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), diarréia viral bovina (BVD), varíola bovina (Pox) e tuberculose, língua azul (BTV), estomatite vesicular (EV) - sorotipos cocal (COCV) e alagoano (VSAV), leucose bovina (BLV), neospora (NC), toxoplasmose (TX) e testes bioquímicos laboratoriais. Todas as amostras de soro foram submetidas ao diagnóstico sorológico para detecção de brucelose, diagnóstico de reação em cadeia da polimerase para detecção de theileriose e babesiose, cromatografia líquida de afinidade, isolamento de exossomos, digestão de proteínas em solução, análise de espectrometria de massa e ferramentas de bioinformátca. Observamos um enriquecimento de 90,5% de proteínas nos soros de búfalos após este protocolo de depleção. A análise MS/MS evidenciou que as principais diferenças no proteoma dos animais com brucelose. No que se refere ao exossosmos isolados e quantififcados neste trabalho, nossa met... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of large animals as sorbozers has been shown to be of great importance for the production of fibrin sealant from the Center for the Study of Venoms and Poisonous Animals (CEVAP). The objective of this work was to certify a flock of buffaloes, to conduct an investigation of the potential candidates for brucellosis biomarkers in buffalo serum and to evidence the isolation and the pioneer quantification of buffalo serum exosomes (EVs) with theileriose and babesiosis. The following serological tests were carried out: brucellosis (BRU), leptospirosis (LEP), foot-and-mouth disease (FMD), infectious bovine rhinotracheitis (IBR), bovine viral diarrhea (BVD), bovine pox (Pox) and tuberculosis, blue tongue (BTV), vesicular stomatitis (EV) - cocal (COCV) and alagoan (VSAV) serotypes, bovine leukosis (BLV), neospora (NC), toxoplasmosis (TX) and laboratory biochemical tests. All serum samples were submitted: 1) serological test; 2) Polymerase chain reaction; 3) Depletion; 4) Isolation of exosomes; 5) Mass spectrometry and 6) Analysis and interpretation of the data. The MS / MS analysis showed that the major differences in the proteome of animals with brucellosis. Regarding the isolated and quantified exosmos in this work, our methodology is strongly encouraged for the isolation and characterization of EVs in Apicomplexa infections in farm animals. We conclude that this study on different fronts such as management, infectious diseases and parasitic diseases can be used in small pro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O sucesso no desenvolvimento de tumores não dependente somente de mutações, mas também é influenciado pelo microambiente do tumor; nele ocorre a interação entre as células tumorais e o estroma. Essa interação pode ser mediada por vesículas liberadas por essas células para o meio extracelular. Essas vesículas atuam na comunicação celular que pode influenciar a progressão tumoral. O objetivo deste estudo foi analisar as interações mediadas por vesículas entre células tumorais e fibroblastos normais. As células tumorais foram plaqueadas sobre a monocamada de fibroblastos e carregadas com diferentes corantes vitais. Nossos resultados evidenciaram a presença e a troca de vesículas entre as células em co-cultura. Vesículas isoladas mostraram tamanhos heterogêneos. Células tumorais possuem mais vesículas que as células normais. As vesículas são compostas pelas proteínas AHNAK e Anexinas. AHNAK foi detectada em vesículas trocadas e estava aumentada em tumores. AHNAK é molécula estrutural das vesículas extracelulares que pode influenciar a biologia dos tumores de mama. / The successful development of tumors is not only dependent on cell mutations, but also driven by the tissue microenvironment; relies on interaction of cells and their surrounding stroma. Some cell types release vesicular structures into the extracellular space that would be involved in cellular communication and tumor progression. The aim of this study was to analyze vesicle-mediated interactions between tumor cells and normal fibroblasts. Tumor cells were plated above fibroblasts monolayer and both loaded with different vital dyes. Our results evidenciated presence and exchange of vesicles between breast tumor cells and fibroblasts in co-culture. Vesicles isolated showed heterogeneous sizes. Tumor cell showed more vesicles than normal cells. These vesicles were composed of AHNAK and Annexins proteins. The protein AHNAK was detected in exchanged vesicles and was increased in tumors when compared to normal breast tissues. AHNAK could represent a vesicle structural molecule that would influence breast tumor biology.

A Anfotericina B (AB) é um antibiótico antifúngico natural, do grupo dos polienos, produzido por cultura de bactérias Streptomyces nodosus. A AB foi isolada pela primeira vez em 1953, e desde então tem sido utilizada extensivamente no tratamento clínico de infecções sistêmicas. Como a AB é altamente insolúvel em meio aquoso, a formulação de escolha tem sido dispersões aquosas de micelas mistas de AB e desoxicolato de sódio (Fungizon). Entretanto, a alta toxicidade deste fármaco tem estimulado a proposição de várias outras formulações. O presente trabalho estuda uma dessas formulações alternativas propostas: agregados de AB e Brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB). O objetivo principal deste trabalho foi tentar avaliar, numa visão estrutural, as propriedades e peculiaridades envolvidas na interação da AB com as dispersões de DODAB. Neste trabalho, centrou-se no estudo de dispersões de DODAB, sonicadas (DODABS) e não sonicadas (DODABNS), onde o antibiótico estivesse, principalmente, na forma monomérica, tendo em vista a proposta baixa toxicidade da AB enquanto monômero. Para avaliar estes sistemas utilizaram-se as técnicas de absorção óptica, calorimetria diferencial de varredura (DSC) e a Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) de marcadores de spin incorporados nos agregados lipídicos. Mostrou-se que a AB monomérica incorpora-se tanto em vesículas de DODABNS, como nos pequenos agregados de DODABS, sendo maior sua incorporação nestes últimos. Foi possível mostrar que até a fração molar (AB/DODAB) de 1,2 mol% a AB está totalmente monomérica, incorporada em agregados de DODABS, mas somente parcialmente em vesículas de DODABNS. Nas bicamadas de DODABNS, a preferência da AB monomérica é pela fase gel, 40 % incorporada, comparada com 23 % na fase fluida. As várias técnicas indicam que a AB encontra-se na superfície da bicamada, com seu cromóforo hidrofóbico enxergando um meio de polarizabilidade maior do que a da água, tanto em DODABS como em DODABNS. Marcadores de spin mostram a coexistência de domínios lipídicos em fases diferentes, gel e fluida, a baixas temperaturas, em DODABS. Curiosamente, indicam que a AB monomérica interage, preferencialmente, com os domínios mais fluidos, em desacordo com a observada maior afinidade da AB pela fase gel de bicamadas lipídicas de DODABNS. O estudo termo-estrutural de dispersões de DODABNS e DODABS aqui apresentado, na presença e ausência de AB, pode ser relevante na proposta de novas formulações farmacológicas. / Amphotericin B (AB) is a natural antibiotic, produced by Streptomyces nodosus, with a very potent antifungal activity. It is a polyene macrolide molecule, isolated in 1953. Since then, it has been extensively used in the treatment of systemic mycotic infections. Considering AB very low solubility in aqueous medium, it has been largely used as an aqueous dispersion of sodium deoxycholate-AB mixed micelles (Fungizon). However, the high toxicity of this preparation has led to the proposition of different other formulations. The present work focuses on one of the proposed preparations, namely aggregates formed by AB and the cationic lipid dioctadecyldimethylammonium (DODAB). Considering the proposed low toxicity of monomeric AB, the present work studies DODAB dispersions, sonicated (DODABS) and non-sonicated (DODABNS), where AB is mostly monomeric. To the structural analysis, optical absorption, differential scanning calorimetry (DSC) and electron spin resonance of spin labels incorporated in the aggregates were used. It was found that AB as a monomer incorporates in aggregates present in both dispersions, DODABS and DODABNS, but the incorporation of monomeric AB in the small fragments present in DODABS is much larger. It was shown that AB incorporates in DODABS aggregates, as a monomer, up to AB/DODAB concentration of 1.2 mol%. At this concentration, only 40 % and 23 % of AB molecules are in the monomeric state in the gel and fluid phases of DODABNS bilayers, respectively. Hence, the gel phase of DODABNS bilayers favors the monomerization of AB, as compared to the bilayer fluid phase. All the applied techniques point to a superficial interaction of monomeric AB with DODAB aggregates, with the hydrophobic polyene chromophor positioned relatively inside the bilayer, in a region of polarizability higher than that of water, in both dispersions, DODABS and DODABNS. Spin labels indicate the coexistence of gel and fluid domains in DODABS aggregates, at low temperatures, supporting the proposed hypothesis of the presence of bilayer fragments in the dispersion. Contrarily to the higher detected affinity of monomeric AB for the gel phase, as compared to the fluid phase of DADABNS bilayers, spin labels indicate that monomeric AB is mostly adsorbed at the fluid domain of the fragments, possibly corresponding to the periphery of the fragments. The thermal-structural study presented here of DODABNS and DODABS, in the presence and absence of AB, can be relevant in the design of new pharmaceutical formulations.

Lipossomos de cloreto de dioctadecildimetilamonio (DODAC) com 0,51µ de diâmetro externo médio e transição de fase ocorrendo em uma faixa estreita de temperaturas (0,5-1,0°C) foram obtidos por vaporização de clorofórmio e comparados com vesículas sonicadas de DODAC (cerca de 250 Å de diâmetro externo). Sacarose foi impermeante através de lipossomos grandes de DODAC ou de vesículas sonicadas de DODAC podendo ser utilizada para determinações de volume interno em ambas as preparações. Volume interno aparente para lipossomos grandes de DODAC foi 9,7 ± 1,3 1/mol e para vesículas sonicadas de DODAC, 0,33 ± 0,20 1/mol (adsorção de sacarose à bicamada de, respectivamente, 0,64 ± 0,30 e 0,20 ± 0,08 1/mol). Lipossomos grandes de DODAC comportaram-se como osmômetros em relação à sacarose e ao KCl (0-50mM KCl). Já as vesículas sonicadas de DODAC foram osmoticamente não-responsivas em relação à sacarose, floculando em presença de KCl. Essa não-responsividade osmótica foi interpretada como decorrente da presença única e exclusiva de água de hidrataçao no compartimento aquoso interno das vesículas sonicadas. Outras propriedades de lipossomos grandes de DODAC foram análogas às apresentadas por lipossomos de fosfolípides. Permeabilidades relativas (KCl como referência incorporado ao compartimento aquoso interno) do NaCl, HCl e sacarose foram similares às descritas para lipossomos de fosfatidilcolina; NaCl e sacarose sendo tão impermeantes quanto o KCl e HCl, sendo ligeiramente mais permeante que o KCl. Nas vizinhanças da temperatura de transição de fase, ocorreu um acentuado aumento da velocidade inicial de encolhimento e a extensão total de encolhimento chegou a um mínimo. A comparaçao de algumas propriedades físicas e funcionais de vesículas sonicadas e de lipossomos grandes de DODAC permitiu concluir que lipossomos grandes de DODAC constituem um modelo mais adequado para estudos de transporte. Adicionalmente, o método de vaporização de clorofórmio foi testado para o dihexadecilfosfato de Na+ (DCP) sendo obtidas dispersões homogêneas desse anfifílico capazes de incorporar um volume de 13 ± 4 1/mol e de responderem como osmômetros a gradientes osmóticos de sacarose, um soluto que praticamente nao é adsorvido à bicamada de DCP e que resultou impermeante através da mesma. / Dioctadecyldimethylammonium chloride (DODAC) liposomes with 0.51µ mean external diameter and sharp phase transitions were obtained by chloroform vaporization and compared with (small) sonicated DODAC vesicles. Sucrose was impermeant through large DODAC liposomes and sonicated vesicles and was used for internal volume determinations. The apparent internal volumes for large DODAC liposomes and sonicated DODAC vesicles were, respectively, 9.7 ± 1.3 and 0.33 ± 0.20 1/mol. (External sucrose adsorption were, respectively, 0.64 ± 0.30 and 0.20 ± 0.08 l/mol). Ideal osmometer behaviour towards KCl over the 0-50mM concentrations range and towards sucrose were observed only for large DODAC liposomes. Sonicated DODAC vesicles were osmotically non responsive towards sucrose and floculate with KCl. Other properties of large DODAC liposomes closely resembled those of phospholipid liposomes. At temperatures near the phase transition temperature, a steep increase in the initial shrinkage rate and a minimum for the total extent of shrinkage occured. Relative permeabilities (KCl as reference entrapped inside) to NaCl, HCl and sucrose were similar to those of phosphatidyl choline liposomes. NaCl and sucrose were as impermeant as KCl, and HCl slighthly more permeant than KCl. Large DODAC liposomes are proposed as an adequate synthetic membrane model, in contrast to sonicated DODAC vesicles. In addition, the chlroform vaporization method was tested for sodium dihexadecylphosphate (DCP). Large DCP liposomes were demonstrated to be impermeant towards sucrose entrapping 13 ± 4 l/mol and behaving as an osmometer towards this solute.

Orientador: Frank Nelson Crespilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2013

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-13Bitstream added on 2014-06-13T19:19:37Z : No. of bitstreams: 1 alves_fr_dr_sjrp.pdf: 2029517 bytes, checksum: f737742cea44bc8699abdd17def3823d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Estudos de calorimetria diferencial de varredura (DSC) e fluorescência de estado estacionário da sonda Vermelho do Nilo indicam a formação de vesículas de DODAX (X = Cl- ou Br-) em concentrações de surfactantes tão baixas quanto 10 µM. Estas vesículas foram denominadas microvesículas (µV), cuja Tm diminui monotonicamente com a concentração de DODAX até valores de Tm das vesículas tradicionais preparadas em 1.0 mM do surfactante. O efeito do contra-íon (Br- e Cl-) no comportamento termotrópico de fase das vesículas mistas de DODAB-DODAC foi investigado por DSC, condutimetria e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Observou-se que a Tm aumenta sigmoidalmente de 45.8 a 48.9 oC com a fração molar de DODAC (xDODAC), com um ponto de inflexão no ponto eqüimolar. A condutividade e o diâmetro hidrodinâmico das vesículas variam muito pouco com xDODAB, indicando que a densidade superficial de carga das vesículas de DODAX é semelhante entre si, e o efeito do contra íon na Tm de DODAX se deve a interações específicas desses contra-íons na interface das vesículas. Medidas de DSC, fluorescência e turbidez de misturas de DODAB-DDAB indicam que as vesículas de DODAB têm maior afinidade por DDAB do que o oposto, resultando na formação de duas populações de vesículas mistas de DDAB-DODAB, com propriedades distintas. Além disso, medidas de fluorescência mostraram que a presença de pequena quantia de DODAB incorporado nas vesículas de DDAB causa um efeito significante na emissão da sonda devido ao aumento do tamanho das vesículas, sugerido por medidas de turbidez. O estudo dos sistemas DODAB/CnTAB/água na concentração total de surfactante igual a 1,0 e 5,0 mM, variando a concentração de CnTAB, e também mantendo a concentração de DODAB fixa em 1,0 mM, revelou uma forte dependência do comprimento da cadeia de hidrocarbonetos... / Differential scanning calorimetry (DSC) and fluorescence of the probe Nile Red studies reveal the formation of DODAX vesicles (X = Br- and Cl-) at surfactant concentrations as low as 10 µM. These vesicles were referred to as microvesicles (mV), whose Tm decreases monotonically with increasing DODAX concentration to the value for the ordinary vesicles at 1 mM. The effect of counterion (Br- and Cl-) on the thermotropic phase behavior of mixed DODAB-DODAC vesicles were investigated by differential scanning calorimetry (DSC), conductimetry and dynamic light scattering (DLS). Tm increases sigmoidally from 45.8 to 48.9 oC with DODAC molar fraction (xDODAC), with an inflection point at the equimolarity. The conductivity and the apparent hydrodynamic diameter vary little with xDODAB, indicating that the surface charge density is similar for DODAX, evidencing that the effect of counterion on Tm is due to the counterion specific interactions. DSC, fluorescence and turbidity measurements indicate a higher affinity of DDAB for DODAB vesicles than the reverse, resulting in two populations of mixed DDAB-DODAB vesicles with different properties. Besides, fluorescence measurements show that the presence of a small amount of DODAB in DDAB vesicles causes a pronounced effect on the Nile Red emission, due to the increase in vesicle size, as suggested from turbidity results. The study of DODAB/CnTAB/água systems at 1.0 and 5.0 total surfactant concentration, and varying CnTAB concentrations with constant 1.0 mM DODAB revealed a strong dependence of the chain length n and relative concentration of the surfactante in the properties of mixed DODAB-CnTAB vesicles. This study allowed analyzing the thermotropic phase behavior containing different amount of DODAB, and the mechanism of vesicle-micelle transition with increasing CnTAB concentration, below and above CMC... (Complete abstract click electronic access below)