L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Depuis la découverte du virus de l'Immunodéficience humaine, un lentivirus, comme agent pathogène responsable de l'épidémie du SIDA en 1983, beaucoup de progrès sur le sujet ont été réalisés. Il existe deux types de virus différents pouvant infecter l'Homme, le HIV-1 et le HIV-2. Ces deux virus se regroupent en différents groupes et sous-types qui témoignent d'une grande diversité inter et intra individus (notions de quasi-espèces). La découverte de lentivirus infectant naturellement au moins quarante-cinq espèces de primates en Afrique sub-saharienne, a permis un enrichissement des connaissances sur les origines des épidémies lentivirales humaines. Aujourd'hui , il est clairement admis que l'origine des épidémies d'HIV-1 et HIV-2 sont le résultat de transmissions zoonotiques de virus de chimpanzés/gorilles et de mangabeys enfumées, respectivement. La mise en évidence de nombreux SIV circulant chez ces primates non-humains indique bien le risque potentiel de nouvelles zoonoses dans la population humaine exposée, cependant, il peut paraître surprenant que jusqu'à maintenant, deux lignées lentivirales seulement ont été capables de franchir cette barrière d'espèce. Pour pouvoir se répliquer dans les cellules d'un nouvel hôte, un lentivirus doit pouvoir contrecarrer les différents facteurs de restriction exprimés par les cellules cibles tout en exploitant au maximum la machinerie cellulaire. La famille de protéines TRIM5, APOBEC3 et les protéines Tetherin/Bst2 et SAMHD1 sont capables de bloquer une infection rétrovirale. Dans ce travail, le rôle des protéines TRIM5 a été étudié ainsi que celui d'autres protéines interagissant avec des capsides rétrovirales, dans un contexte de transmission inter-espèces de lentivirus de primates. L'étude de TRIM5α humain a montré que cette protéine n'était capable de bloquer aucune des infections par les lentivirus primates testés dans cette étude, ni par les autres SIV. Nous avons pu mettre en évidence que la dépendance de la liaison à la Cyclophiline A pour l'infection des différents SIV était variable en fonction de la capside testée. Ainsi, si cette interaction est largement répandue parmi les différentes lignées de SIV, elle n'est toutefois pas universelle. La sensibilité des SIV à la déplétion de nucléoporines qui sont connues pour affecter l'infection par HIV-1, était également variable pour différents SIV, et la même diversité a été observée concernant les déplétions de RanBP2 et Nup153. De plus, nous avons découvert une capside de SIV soumise à une forte restriction de son infection dans les cellules humaines, ce phénotype a été nommé Ref2.Il a été suggéré qu'il existait une possible corrélation entre des variations de la capside de HIV-2 et la progression vers le SIDA, nous avons donc élaboré une étude afin de déterminer si les protéines TRIM5 étaient impliquées dans ce phénotype. La conclusion est que TRIM5α humaine ne restreint fortement aucune des capsides de HIV-2 testées provenant d'une cohorte d'individus à “progression rapide“ ou “lente“ vers le SIDA. Cependant nous avons observé une capacité d'infection qui corrélait avec la pathogénicité. Il est intéressant de noter que toutes les capsides d'HIV-2 testées étaient dépendantes de la présence de Cyclophiline A pour leur infection. Toutes ces capsides étaient sensibles à la déplétion de RanBP2, et l'interaction est très probablement médiée par le motif C-ter de RanBP2 qui a une forte homologie avec la Cyclophiline A. En conclusion, il est très probable que des SIV infectant naturellement des singes puissent utiliser les mêmes protéines que HIV-1, pour un éventuel passage inter-espèces. TRIM5α ne semble pas être une barrière efficace aux différents SIV, et l'interaction avec la Cyclophiline A est probablement très conservée par les lentivirus primates / Ever since HIV has been discovered to be the pathogenic agent that causes AIDS in 1983, much progress has been made in the field. Two different viruses are now known to infect humans, HIV-1 and HIV-2. These two distinct viruses have many sub-types and clades representing a high diversity inter and intra-individuals (quasi-species). The finding of HIV simian counterparts, the Simian Immunodeficiency Viruses (SIVs), has broadened the knowledge of primate lentiviruses and to date forty-five species of non-human primates are known to be infected with SIVs in sub-saharan Africa. It is now clear that HIV-1 and HIV-2 epidemics are the result of zoonosis from chimpanzees/gorillas and sooty mangabeys, respectively. With such a big diversity of SIVs in the wild and a frequent contact of SIV infected monkey species with humans, it is interesting that so far, only two lineages breached the species barrier and infected human populations. To be able to correctly infect a cell, a lentivirus has to overcome the installed cellular barriers known as restriction factors while at the same time correctly exploiting the established host cellular machinery. Proteins such as TRIM5, APOBEC3, Tetherin/Bst2, SAMHD1 are able to restrict retroviral infections in certain conditions. In this thesis, it has been evaluated the role of TRIM5 proteins and other capsid interacting proteins with a scope to the eventuality of a cross-species transmission infection. The results showed that human TRIM5alpha does not restrict any of the primate lentiviruses tested, and so far, no primate lentivirus is known to be restricted by it. Cyclophilin A binding and dependence is variable depending on the SIV capsid; this interaction is widespread among the primate lentiviruses phylogenetic tree but not a universal phenotype. Different capsids from SIVs have been tested for the sensitivity to the depletion of nucleoporins that are known to be used by HIV-1 in its infection; it has been concluded that the same diversity applies to the interaction with RanBP2 and Nup153. Additionally, we identified a SIV capsid that is highly restricted in human cells; this phenotype was called Ref2. With the report of a possible correlation between HIV-2 capsid variations and different levels of progression to AIDS, we devised a study aiming to identify if TRIM5 proteins were involved in this phenotype. We concluded that human TRIM5alpha does not restrict any HIV-2 capsid obtained from a HIV-2 cohort, in which individuals were presenting different levels of progression to AIDS. However, we observed a different viral fitness that correlated with pathogenicity. Moreover, Cyclophilin A dependence seems ubiquitous among all of the tested HIV-2 capsids. All of these capsids are sensitive to RanBP2 depletion and the interaction is much likely mediated by RanBP2's C-terminal motif that shares a high homology with Cyclophilin A. Summing up, it is much likely that some SIVs that still circulate in the wild can hijack the same specific cellular co-factors as HIV-1 to produce a new epidemic in humans. TRIM5α does not seem to be a potent barrier to an eventual cross-species transmission from lower primates to humans, and Cyclophilin A interaction seems to play a major role to the infection of some SIVs.

Le nombre de virus détectés chez les chauves-souris est en augmentation, la plupart étant des virus à ARN. L'identification chez différentes espèces de chauves-souris, de virus ayant été responsables d'épidémies voire de pandémies chez l'homme (coronavirus agent du SRAS, virus Nipah et Hendra, filovirus Ebola et Marburg) a fait prendre conscience du risque que peuvent présenter ces animaux pour la santé humaine, ainsi que des possibilités réelles d'émergence de nouvelles pathologies dans les années futures. Ce travail avait donc pour objectifs: (i) d'identifier et caractériser les virus circulant au sein des populations de chauves-souris d'Afrique Centrale et (ii) d'explorer et d'identifier des déterminants bioécologiques, qui pourraient expliquer la richesse virale observée chez certaines espèces de chauves-souris rencontrées en Afrique tropicale forestière. A partir d'un total de 3472 individus testés, représentant 16 espèces provenant du Gabon, de la République du Congo et de la République Centrafricaine, nous avons confirmé la présence du virus Marburg chez les roussettes d'Egypte (Rousettus aegyptiacus) au Gabon, et mis en évidence des séquences virales de paramyxovirus très proches de virus zoonotiques émergents (les virus Nipah et Hendra) et réémergents (virus des oreillons) chez des chauves-souris frugivores. Des séquences de nouveaux coronavirus, flavivirus et paramyxovirus ont été également identifiées. Par ailleurs, la fragmentation de l'aire de distribution et le type de gîte ont été identifiés comme des déterminants de la richesse virale chez 15 espèces de chauves-souris d'Afrique Centrale. Les chauves-souris en Afrique Centrale seraient donc des réservoirs de virus apparentés à des virus pathogènes pour l'homme. Ces animaux pourraient donc être à l'origine de l'émergence des encéphalites à hénipavirus en Afrique et de la réémergence de certaines maladies humaines comme les oreillons, la rougeole. Des recherches futures s'orienteront vers la poursuite de la caracterisation génétique des virus détectés chez les chauves-souris d'Afrique Centrale et la détermination du risque zoonotique associé à ces virus. Des études écologiques seront également réalisées pour identifier les facteurs de risque d'émeregence des virus de chauves-souris potentiellement pathogènes pour l'homme. / The number of viruses détected in bats is growing, the most common are RNA viruses. The identification in different bat species of viruses that cause major epidemics or pandemics in human such as SARS coronavirus, Nipah and Henda viruses, the filoviruses Ebola and Marburg has raised awareness of potential risk that these animals may present to human health, as well as real possibilities of development of new diseases in future years. This work had two objectives: (i) to identify and characterize the viruses circulating in populations of bats in Central Africa and (ii) to explore and identify bioecological factors that could explain the viral richness observed in some bats species seen in tropical Africa forest. From 3472 individuals tested accounting for 16 species from Gabon, Congo and the Central African Republic, we established the presence of Marburg virus in Egyptian fruit bats (Rousettus aegyptiacus) in Gabon and identified viral sequences of paramyxoviruses close related to emerging and re-emerging zoonotic paramyxoviruses (Nipah virus, Hendra viruses and mumps virus) in fruit bats. Sequences of novel coronaviruses, paramyxoviruses and flaviviruses have also beenidentified. Moreover, the fragmentation of the range and roost type have been identified as determinants of viral richness in 15 bats species of Central Africa. Bats in Central Africa thus would be reservoirs of viruses related to viruses pathogenic for humans. These animals would lead to the emergence of encephalitis Henipavirus in Africa and the reemergence of certain human diseases such as mumps, measles. Further research will be conducted to continue the genetic characterization of viruses detected from bats in Central Africa and to determine the zoonotic risk associated with these viruses. Ecological studies will also be performed to identify the risk factors for the emergence of bats viruses potentially pathogenic for humans.

Le Virus de l’Hépatite C (VHC) infecte 170 millions de personnes dans le monde mais aucun vaccin n’est encore disponible. Le processus d’entrée du VHC dans les hépatocytes représente une cible prometteuse pour le développement de stratégie thérapeutique et est finement régulé par un nombre par les deux glycoprotéines d’envelope du VHC, E1 et E2, assemblé sous la forme d’un hétérodimère incorporé à la surface des particules virales. Cependant, comment E1 et E2 dialoguent, modifient leurs conformations et se coordonnent mutuellement au cours de l’entrée reste encore à être définit. Dans ce travail, nous avons souhaité clarifier l’interrelation entre E1 and E2 au cours de l’entrée afin d’ouvrir la voie à de potentiels stratégies thérapeutiques. Nous avons tout d’abord examiné si une importante divergence génétique entre des hétérodimères E1E2 pouvait être liée à l’existence de fonctions particulières. Nous avons observé une spécialisation des E1E2 isolé des Lymphocytes B pour l’infection de ces mêmes cellules mais pas des hépatocytes, suggérant que de nouvelles fonctions peuvent émerger de la plasticité conformationel de E1E2. Dans un second temps, nous sommes parvenus à identifier un dialogue conservé entre E1 et le domaine III de E2 (E2 DIII), critique pour les processus d’attachement et de fusion du VHC. Nous avons aussi montré grâce à une approche bio-informatique l’existence d’une co-évolution très importante entre E1 et E2. Cette approche a également prédit de potentiel changement de conformations au sein de l’hétérodimère, suggérant que E2 est sans doute une protéine de fusion capable de se replier sur elle-même via le repliement de son domaine III et l’aide de E1. Ainsi, ces différents travaux soulignent l’implication de E1 et E2 au sein de dialogues fins et complexes, qui régulent à la fois les conformations et les fonctions de l’hétérodimère. Ainsi, cela suggère que l’hétérodimère E1E2 représente plutôt une unité fonctionnelle et structurale unique, plutôt que l’association de deux protéines aux fonctions distinctes. / Hepatitis C Virus (HCV) infects more than 170 million people worldwide but no vaccine is available yet. HCV entry may represent a promising target for therapies and is mediated by two envelope glycoproteins, E1 and E2, assembled as heterodimer onto the virus surface. However, how E1 and E2 dialog, structurally rearrange and act together during these steps remain poorly defined. In this work, we aimed to clarify the interrelation of E1E2 during virus entry, thus opening ways to potential new therapeutic strategies. We first investigated whether a strong genetic divergence between E1E2 heterodimers may highlight distinct functions. We observed that B-cell derived E1E2 were specialized for B-cell infection, suggesting that new functions can emerge from the E1E2 conformational plasticity. In a second approach, we identified a conserved dialog between E1 and the domain III of E2 that was critical for virus binding and fusion. Moreover, a computational model predicted a strong co-evolution between E1 and E2 as well as potential structural rearrangements, suggesting that HCV E2 is likely a fusion protein able to fold over via its domain III through the mediation of E1. Altogether, these different works highlight that E1 and E2 are involved in complex dialogs that regulate the heterodimer folding and functions, suggesting that E1E2 heterodimer is more likely a single functional protein entity than an association of two proteins with specific functions.

En utilisant une technique originale de détection et de quantification des HPV16 et 18 par PCR duplex, ce travail de thèse illustre la signification, l’intérêt et les limites de l’utilisation clinique de la mesure de la charge virale pour ces deux types d’hrHPV. Si nous n’avons pas démontré de réelle signification de la charge virale en HPV18, il n’en est pas de même pour l’HPV16 dont la charge virale augmente avec la sévérité des lésions constatées. Néanmoins, l’extrême variabilité des charges virales mesurées limite son utilisation en pratique clinique. Après un frottis cervico-utérin (FCU) anormal, une charge virale seuil en HPV16 à 3,0x106 copies par millions de cellules permet la prédiction optimale de la présence d’une CIN2+ (spécificité : 91 % et sensibilité : 58,2 %). Cette valeur seuil est particulièrement performante pour les patientes ayant un FCU de bas grade (spécificité : 96,4 % et sensibilité : 88 %). Si la charge virale en HPV16 et 18 ne semble pas être prédictive de la clairance virale chez les jeunes femmes de moins de 30 ans ayant un FCU normal, elle l’est chez les patientes HPV16 positives ayant une colposcopie normale malgré un FCU équivoque ou de bas grade (spécificité : 86,7 % et sensibilité : 85,7 %). / Using duplex PCR technique for the detection and quantification of HPV16 and 18, this work investigates the significance, value and limitations of the use of HPV16 and 18 viral load quantitation in routine clinical practice. Although HPV18 viral load was not found to be of any clinical relevance, HPV16 viral load was found to significantly increase with the severity of cervical lesions. However, the wide range of viral load observed strongly limitates its use in routine clinical practice. After an abnormal cervical cytology, a HPV16 viral load cut-off of 3.0x106 copies per million cells allows for the best prediction of CIN2+ (91% specificity and 58.2% sensitivity). Such cut-off is particularly efficient in case of low grade abnormal cytology (96.4% specificity and 88% sensitivity). Although HPV16 viral load does not appear to predict for HPV16 clearance in women under 30 with normal cytology, such prediction was observed among women with normal colposcopy following equivocal or low grade cytology (86.7% specificity and 85.7% sensitivity).

Les études des interactions entre cellules hôtes et rétrovirus ont conduit à définir le concept de restriction virale dont les facteurs constituent une part de l'immunité innée des cellules hôtes. Ces facteurs contribuent au contrôle des rétrovirus endogènes (ERV) dont l'émergence peut être associée à certaines pathologies telles que des leucémies ou des immunodéficiences. Chez le porc, certains ERV (PERV) sont réplicatifs, pourtant aucune pathologie ne leur a, à ce jour, été associée. Les mécanismes de restriction virale impliqués dans ce phénomène ont fait l'objet de nombreuses études. Elles n'ont cependant concerné que certains facteurs. Les protéines porcines à motif tripartite (poTRIM) n'ont ainsi fait l'objet que de peu d'études. Pourtant, de nombreux membres de cette famille participent à la restriction virale chez d'autres organismes que le porc. La présente étude s'intéresse par conséquent aux orthologues porcins de ces protéines et à leur relation avec les PERV. L'élaboration d'une stratégie d'expression de ces protéines dans un modèle humain, sensible à l'infection par le PERV nous a permis d'évaluer et de caractériser les effets des TRIM sur le cycle infectieux du PERV. Cette stratégie a mis en évidence une activité de restriction par TRIM8 tandis que TRIM44 semble au contraire agir en faveur de la réplication virale. En ce qui concerne poTRIM11, elle favorise l'entrée du PERV tout en inhibant son expression. L'étude a également confirmé l'insensibilité du PERV vis-à-vis de poTRIM5α. L'ensemble de ces résultats contribuent à la compréhension de la relation entre la réplication des PERV et le contrôle mené par son hôte. / From studies of pathogens and their host interaction has emerged the concept of viral restriction considered to be part of an innate immune system. These factors contribute to the control of endogenous retroviruses (ERV) whose emergence may be associated with several diseases such as leukemia or immunodeficiency. Three subgroups of the porcine ERV-γ-1 group (PERV) are replicative. Nevertheless, these PERVs are not associated with any pathology in the pig. Several studies have been performed on viral restriction mechanism capabilities of the pig but these covered a very limited number of restriction factors. Regarding the porcine tripartite motif-containing (poTRIM) proteins, knowledge is weak although several members of this family have proved to be implicated in the viral restriction of other species. The purpose of this study is to investigate the relationship between these orthologous poTRIMs proteins and replicating PERVs. In order to explore this potential interaction, a TRIM protein expressing model in human cells, known to be sensitive to the PERV infection, has been developed. It has enabled us to assess and characterize potential TRIMs effects on the PERV infection cycle. We equally identified poTRIM8 as a restriction factor. Conversely, poTRIM44 seems to act as an enhancer of the PERV infection, while, TRIM11 displayed ambiguous effects including an enhancer effect of the early infectious stages and an inhibitor activity of the late infectious stages. In this study, we also confirmed the PERV insensitivity to the porcine TRIM5α protein. Finally, this work aims at contributing to the understanding of the relationship between PERV replication and their control leading by the host cells.

La grippe est une infection respiratoire responsable de complications respiratoires ou neurologiques nécessitant une prise en charge rapide et adaptée. L’émergence des technologies de séquençage à haut débit (NGS) permet l’étude des communautés microbiennes résidentes ainsi qu’une étude approfondie du génome des pathogènes impliqués. Cette thèse a pour objectif de caractériser le microbiome respiratoire et la diversité génomique virale des patients infectés par les virus grippaux, en corrélant les données clinicobiologiques recueillies. Après recueil des prélèvements respiratoires d’enfants hospitalisés entre 2010 et 2014, le séquençage de leur microbiome respiratoire a mis en évidence une augmentation de la diversité microbienne ainsi qu’une signature microbienne différentielle entre formes cliniques. Une répartition différentielle de taxons (OTU) permet la prédiction de complications chez les enfants infectés. L’étude d’échantillons respiratoires de patients adultes permettra de compléter la signature prédictive. Après validation des processus analytiques et bioinformatiques par reconstitution artificielles de quasi espèces et recueil de 125 prélèvements cliniques respiratoires, le séquençage du génome entier par NGS des virus grippaux permet de différencier les diversités initiales en fonction de la nature du virus infectant et de la complication. En comparaison du prélèvement initial précoce les échantillons prélevés successivement mettent en évidence une diversification différentielle entre les différents segments des virus grippaux infectant les patients, que ce soit chez les patients immunocompétents ou chez un patient immunodéprimé à l’excrétion prolongé / Influenza is a respiratory infection responsible for respiratory or neurological complications and require rapid and adapted management. The emergence of next-generation sequencing (NGS) allows the study of resident microbial communities as well as an in-depth study of the genome of the pathogens. This thesis aimed to characterize the respiratory microbiome and the viral genomic diversity of influenza virus infected patients, correlating these data to the collected clinical data. After sampling of respiratory specimens from hospitalized children between 2010 and 2014, the sequencing of their respiratory microbiome revealed an increase in microbial diversity and a differential microbial signature between clinical forms. A differential taxon distribution (OTU) allows the prediction of complications in infected children. The study of adult respiratory samples will complete the predictive signature.After validation of the analytical and bioinformatic processes by artificial reconstitution of quasi-species and collection of 125 respiratory clinical specimens, the sequencing of the whole genome by NGS of the influenza viruses allow to differentiate the initial diversities according to the nature of the infecting virus and the complication. Compared to early samples, specimen sampled successively show a differential diversification between the different segments of influenza viruses, whether in immunocompetent patients or in an immunocompromised patient with prolonged excretion

Les entérovirus humains (EV) représentent la première cause des méningites aseptiques chez l'enfant. Le diagnostic de certitude repose sur la détection génomique de l'entérovirus par RT-PCR dans des échantillons de liquide céphalorachidien (LCR) est recommandée pour le diagnostic. La fièvre sans point d'appel et les maladies de type "sepsis" sont également des affections fréquentes chez les nourrissons (0 à 2 ans), qui peuvent être la conséquence d'une infection virale, en particulier à EV. Actuellement, le diagnostic des EV dans le sang est rarement établi dans la pratique courante.Les données concernant 1) l’existence d’une réplication de l’EV dans les leucocytes sanguins, 2) le niveau de charge virale de l’EV dans le sang et les échantillons de LCR et sa corrélation éventuelle avec l’intensité du processus inflammatoire réactionnel sont fragmentaires. Dans la première partie de cette thèse, l'objectif était d'évaluer la détection des EV par PCR dans des échantillons de sang de nouveau-nés, de nourrissons et d'enfants hospitalisés pour une fièvre isolée, un sepsis ou un syndrome méningé. Nous avons mené une étude observationnelle prospective multicentrique nationale (étude BLEDI) dans 35 départements de pédiatrie au cours de la période estivo-automnale (augmentation des circulations d'EV) en 2015-2016. Nos résultats ont montré que le taux de détection des EV dans le sang était significativement plus élevé que dans le LCR chez les nouveaux-nés et les nourrissons hospitalisés pour une fièvre isolée, un sepsis ou un syndrome méningé.Ces données ouvrent des perspectives pour un nouvel algorithme de diagnostic des fièvres inexpliquées chez les enfants âgés de moins de 2 ans. Dans le second volet de cette thèse, nous avons étudié de manière prospective la charge virale d'EV dans le sang et dans des échantillons de LCR de patients infectés. Nos résultats ont montré que la charge virale d'EV dans le sang variait selon le groupe d'âge, la présentation clinique et le type d'EV. Trois profils de cinétique d'infection comparant la charge virale dans le sang et le LCR ont été envisagés et sont en cours d'étude. Enfin, le dernier axe était de déterminer s'il existait une réplication de l’EV dans les leucocytes sanguins. Nous avons montré à partir d'échantillons de sang infectés in vitro par EV que la réplication de ces virus variait selon les génotypes d'EV. / Human enteroviruses (EV) are the most frequent cause of paediatric aseptic meningitis. Detection of enterovirus by PCR in cerebrospinal fluid (CSF) specimens is recommended for diagnosis. Fever without source and sepsis-like diseases are frequent affections in infants (0 to 2 years) which can be the consequence of a viral infection in particular to EV. At present, the daily routin diagnosis of EV in the blood is rarely performed. The concerning data 1) existence of EV replication in the blood leukocytes, 2) the EV viral load level in blood and CSF specimens and its possible relation with the intensity of the associated inflammatory process are fragmented. In the first part of this PhD thesis, the aim was to assess detection of enterovirus by PCR in blood specimens of newbrons, infants, and children with fever without source, sepsis-like disease or suspected meningitis. We did a prospective, multicentre, observational study (BLEDI study) at 35 paediatric departements during the seasonal period of increased EV circulation in 2015-2016. Our results showed that detection of EV was significantly higher in the blood than in the CSF from newborns and infants admitted with fever without source or sepsis-like disease. These data open up the perspectives for a new diagnostic algorithm of febrile illness in patients aged 2 years or younger. We also explored prospectively EV viral load in blood and in CSF specimens of infected patients. Our results showed that EV viral load in the blood varied by age group, clinical presentation and EV type. Three profiles of infection kinetics comparing EV viral load in the blood and the CSF have been considered and are under study. Finally, we explored the hypothesis of an EV replication in the blood leukocytes. We showed from blood samples infected in vitro by EV that the replication of these viruses varied by EV genotypes.

La peste des petits ruminants (PPR), causée par un Morbillivirus, est l'infection virale la plus grave des caprins et ovins. Elle est largement répandue en Asie, au Moyen Orient et en Afrique. En Afrique elle est en émergence au nord et au sud du continent et représente un facteur majeur d'insécurité alimentaire pour la population agricole (70% des populations pauvres des régions considérées). La PPR est un modèle d'étude des maladies transfrontalières ; sa diffusion est très liée aux mouvements régionaux d'animaux vivants. La compréhension de cette diffusion est une condition essentielle à la mise en place de mesures de contrôle efficaces (vaccination, quarantaine, contrôle aux frontières,…). A notre connaissance aucune étude n'a été entreprise pour connaître l'ampleur de la diversité génétique du PPRv au cours d'infections naturelles de petits ruminants et l'accumulation des mutations virales dans un circuit de diffusion. Or dans les pays d'élevages extensifs tropicaux l'identification et la traçabilité animale sont inexistantes, ce qui rend difficile reconstruction des circuits de diffusion des animaux et du virus. Dans ces conditions, la diversité génétique du virus peut être utilisée comme marqueur de diffusion épidémiologique. L'objectif de cette thèse est d'utiliser la variabilité génétique du PPRV pour caractériser les lignées virales circulantes et retracer les processus de transmission du virus à travers un large territoire centré sur le Sénégal. En analysant 2 gènes de PPR nous avons estimé la vitesse d'évolution du virus sur une période de 4 années comprise en 2010 et 2014.Les résultats montrent que les premières souches de la lignée 2 de PPRv ont été introduites en 2005 au Sénégal et dans les pays voisins. L'horloge moléculaire et l'arbre phylogéographique rapportés ici indiquent clairement que la lignée II maintenant enzootique en Afrique de l'ouest prend son origine au Nigeria. Les mouvements trans-africains à l'origine du déplacement est-ouest de la lignée II trouvent leur origine dans le commerce de bétail à la croisée des frontières, une évidence économique et culturelle en Afrique de l'Ouest.Mots clés : peste des petits ruminants ; gène viral ; mutation virale ; circuit de transmission ; phylogénie ; phylogéographie ; surveillance épidémiologique, Sénégal. / Peste des petits ruminants (PPR), caused by a Morbillivirus is one of the most important viral infections in sheep and goats. It is widely spread in Asia, Middle East and Africa. In Africa, it is an emerging disease in the north and the south of the continent. It is a major factor of food insecurity for the farming population (70% of the poor population in the tropical regions). PPR is a study model of transboundary diseases; its spread is highly related to regional movements of livestock. Understanding the spread of PPR is an essential condition for the implementation of efficient control measures (vaccination, quarantine, border controls etc.). Up to our knowledge, no studies have investigated the range of genetic diversity of PPR virus (PPRv) during natural infections in small ruminants and the accumulation of virus mutations during its spread. Further on, in tropical countries with extensive farming, animal identification and traceability are a current problem. In such conditions, the genetic diversity of the PPRv can be used as a marker of animal movement and spread of the virus. The objective of this study was to investigate the genetic diversity of the PPRv in order to characterise the actual viral lineages and to retrace the transmission of the virus in Senegal and its surrounding countries. Analyzing two complete viral genes of the PPR, we have estimated the rate of evolution of this virus, in a four year period, between 2010 and 2014. The results of the study show that the first strains of lineage II of PPRv have been introduced in 2005 in Senegal and its surrounding countries. Molecular clock analysis and phylogeographical reconstitution of the PPRv indicate that the lineage II, actually enzootique in western Africa, has its origins in Nigeria. This viral introduction from the direction east towards west, corresponds to the transboundary movement and commerce of livestock in the countries of western Africa, which represents the economic and cultural tradition of the people of this region.Key words: Peste des petits ruminants, viral gene, virus mutation, transmission, phylogeny, phylogéographie, epidemiosurveillance, Senegal, West Africa