Les arbovirus (dont le virus chikungunya, CHIKV) sont responsables de millions d'infections chaque année ; aucun vaccin n'est encore approuvé, et les traitements disponibles restent limités. De part leur circulation constante entre le moustique et l'humain, leur adaptation rapide à différents hôtes est un facteur clé pour leur pathogenèse. Le taux d'erreur particulièrement élevé de leur polymérase ARN permet une rapide diversification génique qui conduit à la génération d'un nuages de mutants, appelée quasi espèce. Les quasi espèces contiennent non seulement des génomes mutés, mais aussi des ARN recombinés à partir de deux génomes d'origine différente, ainsi que des génomes avec de grandes délétions, incapables de se répliquer sans l'aide d'un autre virion qui doit infection la même cellule, nommés génomes viraux défectifs (GVD). Une régulation étroite de la taille du nuage de mutants est clé pour une pathogenèse efficace : si trop petit, le potentiel adaptatif du virus sera impacté ; au contraire, une quasi-espèce trop grande peut mener à l'accumulation rapide de mutations délétères pour le virus. Alors que la régulation du paysage mutationnel est atteinte grâce à un taux d'erreur de la polymérase viral finement contrôlé, la recombinaison et la réplication des génomes défectifs sont influencés par le potentiel de co-infection des cellules cibles. Dans ce contexte, l'exclusion de la surinfection (ESI), un processus par lequel l'infection par un premier virus inhibe l'infection par un second virus, peut influer le dynamique de la quasi-espèce. Bien que décrite dans la plupart des familles virales, les mécanismes à l'origine de l'ESI restent mal caractérisés. Dans ce travail, je montre que CHIKV exclut une infection future par CHIKV, mais aussi par le virus Sindbis et le virus de la grippe A, mais non par le virus du Nil occidental. Je démontre que l'exclusion de CHIKV se situe au niveau de la pénétration du génome viral dans le cytoplasme, puis de sa réplication, mais n'influence ni l'attachement du virion ni la traduction de son génome. Je montre également que l'ESI est indépendant de l'action des interférons de type I, et qu'elle n'est médiée ni par la transcription cellulaire, ni par un facteur soluble. De plus, l'exclusion n'est pas due à une unique protéine virale, suggérant un potentiel rôle de la réponse cellulaire à l'infection.Déterminer l'influence des pressions immunologiques dans l'établissement de la quasi-espèce peut aider à une meilleure compréhension de l'interaction entre évolution virale et réponse immunitaire. Bien que la caractérisation non biaisée des mutations ponctuelles fût le fruit de nombreux travaux, les GVD restent peu caractérisées, en particulier chez les alphavirus. Dans la deuxième partie de ce travail, je développe des outils bio-informatiques pour isoler rapidement les GVD de données de séquençage à haut débit, et analyse les avantages et les inconvénients d'un ajout d'une étape de pré-amplification pour détecter et quantifier les GVD. À l'aide de ces outils, je fournis ensuite la première description complète des GVD produits par des passages séquentiels de CHIKV en culture cellulaire. En particulier, je montre que le type de GVD générés est très dépendants du type cellulaire, avec des motifs de séquences et des cadres de lecture ouverts différents lorsque les cellules hôtes sont des cellules de mammifère ou d'insecte. Ces résultats soulignent le role de l'environnement cellulaire dans le modelage de la quasi-espèce, et des GVD en particulier. Des travaux futurs aideront à dévoiler les mécanismes sous-jacents à cette interaction et pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les dynamiques des quasi-espèces. / Arboviruses such as chikungunya virus (CHIKV) are responsible for millions of yearly infections, with no approved vaccines and limited treatments. Because they circulate between mosquitoes and humans, their fast adaptation potential to different hosts is key to pathogenesis. To achieve genome diversification, they rely on the error-prone nature of their self-encoded RNA-dependent RNA polymerase, which quickly generates a cloud of mutants, termed quasispecies. Quasispecies contain not only mutated genomes, but also shuffled genomes of different parental origin (through a process known as recombination), as well as genomes with large deletions, unable to replicate without the co-infection with a full-length helper genome, and thus termed defective viral genomes (DVGs). A tight regulation of the mutant cloud size is key to pathogenesis: if too small, it will limit the adaptation potential of the virus, whilst too big a quasispecies may lead to the fast accumulation of deleterious mutations. While regulation of the mutational landscape is achieved through the finely tuned error rate of the viral polymerase, recombination and DVG replication are influenced by the co-infection potential of the target cells.In this context, superinfection exclusion (SIE), a process by which infection by a first virus prevents infection by a second, closely related virus, can regulate quasispecies dynamics. While described in most viral families, mechanisms underlying SIE remain poorly characterised. Here, I show that CHIKV infection excludes subsequent infection by CHIKV, Sindbis virus and influenza A virus, but not West Nile virus. I demonstrate that CHIKV exclusion occurs at two steps, impacting independently viral penetration and replication, but does not directly influence binding, nor viral protein translation. I further show that SIE is interferon independent, and does not rely on host cell transcription nor on soluble cellular factors. Moreover, exclusion is not mediated by the action of a single CHIKV protein, suggesting that a cellular response may be at play. Assessing how different immunological pressures can shape quasispecies landscape may prove useful to a more thorough understanding of the interplay between viral evolution and the immune response. Although the unbiased study of point mutations has received much attention, less is known about the characteristics of DVGs, especially in alphaviruses. In the second part of this work, I develop bioinformatics tools to quickly isolate DVGs from next-generation sequencing data, and assess the advantages and drawbacks of pre-amplification steps to detect and quantify DVGs. Using these tools, I provide the first unbiased description of the DVG landscape generated through serial passaging of CHIKV in cell culture. In particular, I show that the DVG landscape is highly dependent on the cell type, with sequence patterns and open reading frames differing between DVGs generated in mammalian and insect cells. These results highlight the role of the cellular environment in shaping quasispecies, and DVGs in particular. Future work will help uncover the mechanisms underlying this crosstalk and may prove useful for the design of treatments targeting quasispecies dynamics.

Au cours d'une infection lytique, le virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1) doit entreprendre plusieurs étapes de fusion afin de se répliquer et se propager correctement. Ainsi, le virus a évolué afin de tirer avantage de la machinerie cellulaire en utilisant des protéines et facteurs de l’hôte à cet effet. Dans la littérature, les processus sous-jacents à l’entrée du VHS-1 ont été largement élucidés. Cependant, on ne sait toujours pas comment les particules virales nouvellement synthétisées sortent de la cellule hôte et quels facteurs cellulaires sont impliqués dans ce processus. Des résultats publiés par notre laboratoire indiquent que la protéine cellulaire, Extended Synaptotagmin 1 (E-Syt1), a un impact négatif sur la propagation globale du virus lorsqu’inhibée par de l’ARN d’interférence. Conséquemment, la présente étude a pour objectif de confirmer et d'approfondir le rôle d’E-Syt1 sur la propagation virale, en particulier sur la sortie du virus. Étant donné que l’activation d’E-Syt1 est liée à l’augmentation de la concentration de calcium cytoplasmique, nous avons également étudié l'implication du calcium au cours des stades ultérieurs de la réplication virale. Ici, nous avons démontré que la surexpression d’E-Syt1 n’a pas d’effet détectable sur la sortie du VHS-1, mais que le calcium a effet sur la propagation virale. Alors que la séquestration précoce du calcium (4 et 6 heures post-infection) à l'aide de chélateurs réprime la sortie virale, aucun effet significatif a été détecté lorsque les chélateurs ont été ajoutés à un stade avancé de l’infection (12 et 16 heures post-infection). Nos résultats fournissent des données intéressantes sur la nécessité de l’homéostasie du calcium intracellulaire afin que VHS-1 puisse assurer une médiation adéquate de la sortie virale. Ces résultats pourraient conduire à la découverte de nouveaux mécanismes ou protéines cellulaires régulées par le calcium et utilisés par le VHS-1 lors de réplications lytiques virales. / During a lytic infection, Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) must go through multiple steps of fusion to replicate and propagate properly. For this purpose, the virus has evolved consequently by taking advantage of the cellular machinery using host factors and proteins. In the literature, processes underlying HSV-1’s entry have been extensively elucidated. However, it remains unclear how newly synthesized viral particles egress from the host cell, and what cellular factors are implicated in this process. Results published by our laboratory suggest that the cellular protein, Extended Synaptotagmin 1 (E-Syt1), has a negative and global impact on the viral propagation when down regulated by RNA interference. Consequently, this study aims to confirm and deepen our understanding of E-Syt1’s role on HSV-1, particularly during viral egress. Since activation of E-Syt1 is linked to the increase in cytoplasmic calcium concentration, we also investigated calcium involvement during later stages of viral propagation. Interestingly, overexpression of E-Syt1 had no measurable effect on HSV-1 propagation whereas calcium has a dual effect on viral propagation. While early calcium sequestering (4 and 6 hours post-infection) using chelators represses viral egress, no significant effect was detected when chelators were added at later time points (12 and 16 hours post-infection). Our results give interesting insights on how HSV-1 relies on intracellular calcium homeostasis to properly mediate viral egress. These results may lead to the discovery of new mechanisms or cellular proteins that are regulated by calcium and hijacked by HSV-1 during lytic replication.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une maladie virale d'une importance économique considérable, caractérisée par des signes d'hyperthermie et d'anorexie, accompagnés de problèmes reproducteurs chez les truies de toutes parités, et de problèmes respiratoires chez les porcs de tous âges. Le SRRP est apparu dans plusieurs États américains ainsi qu'au Canada au cours de l'année 1987. La maladie fut rapportée en Allemagne vers la fin de l'année 1990 et se propagea rapidement en Europe occidentale. Dès 1994, la présence de l'infection avait été officiellement reconnue dans les élevages de porc de plus de 16 pays d'Amérique, d'Europe et d'Asie. La sévérité des signes cliniques est très variable selon le statut immunitaire des animaux et les souches virales en cause : il peut s'agir d'une atteinte asymptomatique, d'une infection chronique se manifestant par une baisse de la productivité (retard de croissance, problèmes d'infertilité), ou d'une atteinte plus manifeste où les problèmes respiratoires peuvent être responsables de mortalités, de hauts taux de condamnation à l'abattage et d'un nombre très accru d'avortements tardifs ou de pertes majeures de jeunes porcelets.

Contexte : La surveillance de la charge virale (CV) et les dépistages des infections sexuellement transmissibles et par le sang (ITSS) sont indispensables à la prise en charge du VIH. L’utilisation de ces soins pendant la pandémie de la Covid-19 au Québec reste largement inconnue. Objectif : Mesurer et comparer les taux de surveillance de la CV et des dépistages des ITSS en période pré et per-pandémique chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH) à Montréal. Méthodes : Dans une étude de cohorte avec devis pré-post, 1702 PVVIH ont été retenues. Des modèles de régression de Poisson avec effet aléatoire sur l'individu ont estimé les taux, les ratios de taux d'incidence (IRR), leurs intervalles de confiance à 95 % (IC95%) ainsi que des termes d’interaction entre la variable de la période et les covariables. Résultats : La période pré-pandémique était associée à une diminution du taux de surveillance de la CV (IRR=0,58, IC95% 0,55-0,60) et du taux de dépistage des ITSS (IRR=0,65, IC95% 0,62-0,68). La diminution de la surveillance de la CV pendant la période per-pandémique était plus importante avec l’utilisation de drogues par injection, une augmentation de la distance et une CV détectable au début de l’étude. La diminution de dépistage des ITSS était plus importante avec une augmentation d’âge et de la distance. La suppression virologique et les pourcentages de positivité des ITSS sont demeurés constants au cours des périodes. Les taux d'incidence des ITSS ont diminué en période per-pandémique. Conclusion : Une diminution du suivi a été observée en période per-pandémique. Nos résultats suggèrent que ces réductions n'ont pas eu d'impact sur la suppression virologique ou l’incidence des ITSS. / Context: Routine viral load (VL) monitoring and sexually transmitted infections (STI) screenings are integral parts of HIV care. In Québec, the effects of the Covid-19 pandemic on accessibility to care and resulting inequalities remain widely unknown. Objective: We aimed to measure and compare rates of VL monitoring and STI screenings before and during the COVID-19 pandemic amongst people living with HIV (PLWHIV) in Montréal. Methods: A cohort study with pre-post design followed 1702 PLWHIV. Poisson regression models with individual clustering were used to estimate testing rates, incidence rate ratios (IRR), their 95 % confidence intervals (95%CI) and interaction terms between the period variable and other covariates. Results: The per-pandemic period was associated with a decrease in VL monitoring (IRR=0.58, 95%CI 0.55-0.60) and STI screening (IRR=0.65, 95%CI 0.62-0.68). The per-pandemic period intensified VL monitoring gaps with intravenous drug use, distance from the testing center and a detectable VL at the beginning of the study. STI screening gaps were amplified during the per-pandemic period by an increase in age and in distance. VL suppression and STI positivity percentages remained unchanged while STI incidence rates decreased. Conclusion: A significant decline in VL monitoring and STI screening was observed during the per-pandemic period. Our findings suggest that these reductions had no impact on the virological suppression or STI incidence in PLWHIV.

Le criblage par siRNA de 49 protéines de l'hôte qui sont incorporées dans les particules matures du virus herpès simplex de type 1 (VHS-1) a révélé l'importance d'au moins 15 d’entre elle pour infectivité du virus (Stegen, C et al. 2013). Parmi celle-ci figure la protéine humaine DDX3X, qui est une ARN hélicase ATP-dépendante. Cette protéine multifonctionnelle participe à différents stages de l'expression génique, tels que la transcription, la maturation et le transport d'ARNm ainsi que la traduction. DDX3X est impliquée dans la réplication de plusieurs virus tels que le Virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l'hépatite B (VHB), le virus de la vaccine (VACV) et le virus de l'hépatite C (VHC). Le rôle exact de DDX3X dans le cycle de réplication du VHS-1 est toutefois inconnu. Ce mémoire consiste en l’étude détaillée de l'interaction de DDX3X avec le virus. De manière surprenante, tant l’inhibition que la surexpression de DDX3X réduit de manière significative l'infectivité du VHS-1. Fait intéressant, lorsque nous avons restauré la déplétion de DDX3X par une construction résistante aux ARNi utilisés, le virus pouvait de nouveau infecter les cellules efficacement, indiquant que le virus est sensible aux quantités de cette protéine de son hôte. Nos résultats indiquent de plus que le virus modifie la localisation de DDX3X et cause son agrégation tôt dès les premiers temps de l'infection. Cependant, le virus ne modifie pas les niveaux cellulaires de DDX3X dans deux des trois lignées cellulaires examinées. Nous avons également pu établir que cette protéine n'a pas d'effet sur l'entrée du VHS-1, suggérant qu’elle agit à un stade ultérieure de l’infection. En examinant cette relation plus en détail, nos résultats ont démontré que l’inhibition ou la surexpression de DDX3X inhibent toutes deux la production de nouvelles particules virales en réduisant l'expression des diverses classes cinétiques des protéines virales et ce au niveau de leur transcription. Malgré le rôle connu DDX3X dans la stimulation de la réponse immunitaire innée et la production d’interférons de type I, l’impact de DDX3X sur la réplication du VHS-1 est ici indépendante de cette fonction. Ces travaux démontrent donc une nouvelle voie d’action de DDX3X sur les virus en agissant directement sur la transcription de gènes viraux et la réplication du génome d’un virus à ADN. En comprenant mieux cette interactions hôtepathogène, il est maintenant envisageable de concevoir des nouvelles approches thérapeutiques contre ce virus. / siRNA screening of 49 host proteins that are known to be incorporated in the mature virions of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) revealed the importance of at least 15 cellular proteins for viral infectivity (Stegen, C et al. 2013). Among these, was the human protein DDX3X, a DEAD-box ATP-dependent RNA helicase. This multifunctional protein participates in different stages of gene expression such as mRNA transcription, maturation, mRNA export and translation. DDX3X has been shown to be involved in the replication of several viruses such as human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), hepatitis B virus (HBV) vaccinia virus (VACV) and hepatitis C virus (HCV). The exact role of DDX3X in HSV-1 replication cycle is not known. Here we sought to find the detailed interaction between DDX3X with HSV-1. Surprisingly, the down-regulation as well as overexpression of DDX3X, significantly reduced the infectivity of HSV-1, indicating that the virus is sensitive to the precise levels of DDX3X. Accordingly, when we rescued DDX3X back to its normal cellular levels by sequential transfection of DDX3X siRNA and siRNA resistant DDX3X plasmid, the virus was able to infect cells efficiently compare to wild-type conditions. Furthermore, the virus changes the localization of DDX3X and causes its aggregation at early times in the infection. However, the virus does not change the cellular levels of DDX3X in at least two of three different cell lines tested. Using a luciferase assay we were able to establish that this protein has no effect on the entry of HSV-1. In fact, depleting or overexpressing DDX3X impaired the production on newly assembled viral particles by blocking the expression of all classes of viral proteins at the transcription level. Despite the known role of DDX3X in the stimulation of innate immune response and interferon type I production, DDX3X appears to act on HSV-1 replication independently of this pathway. This highlights a novel route of action of DDX3X by acting at the transcription level and the consequent genome replication of a DNA virus. By better understanding such pathogen interactions, it might now be possible to design novel therapeutic approaches.

Les inhibiteurs de la protéase virale (IPs) sont utilisés avec succès dans le cadre d'une thérapie anti-VIH-1. L'efficacité de ce traitement est incontestable notamment en terme de réduction de la charge virale et de maintient du taux de lymphocytes CD4 circulants. Depuis l'incorporation des IPs dans la prise en charge thérapeutique, on note une réduction significative de la morbidité et de la mortalité ainsi qu'un allongement de la durée de vie des patients. Cependant, la prise de ces molécules anti-rétrovirales s'accompagne de nombreux effets secondaires. Les plus préoccupants d'entre eux sont : une lipodystrophie partielle, une hyperlipidémie, une insulino-résistance, une athérosclérose prématurée, ainsi que des infarctus du myocarde. Les patients sont également confrontés à l'apparition de maladies généralement associées à l'âge telles que la neurodégenérescence, l'ostéopénie et le développement de tumeurs malignes. Les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ces altérations métaboliques n'ont pas encore été élucidés. L'objectif de cette étude était d'étudier les effets cellulaires de quatre IPs (Atazanavir, Lopinavir, Ritonavir et Saquinavir) sur la cellule musculaire striée squelettique humaine. Ces travaux ont permis d'identifier une augmentation de la production d'espèces oxygénées réactives (ERO), une altération morphologique du réticulum sarco/endoplasmique (RS/RE) ainsi qu'une augmentation de l'expression de CHOP, un marqueur du stress de ce compartiment et une diminution de l'expression et de la localisation dans les microdomaines membranaires (lipid rafts) de la cavéoline 3 et de la flotilline 1. Enfin, l'utilisation d'un antioxydant, le Resvératrol protége le myotube primaire humain de ces différentes altérations engendrées par les IPs. Ces données suggèrent un rôle central de la surproduction d'ERO dans le développement du stress du RE/RS et de la perte de localisation des protéines résidantes des microdomaines membranaires. De plus , en l'absence de persceptive vaccinale concrète, le Resvératrol, au travers de ces effets protecteurs, pourrait se révéler un atout de choix dans l'atténuation des effets secondaires des IPs en contribuant ainsi à l'amélioration de la prise en charge du patient séropositif. / HIV protease inhibitors (PI) have been successfully used in highly active antiretroviral therapy (HAART) of HIV-1 infection, the most effective treatment currently available. Incorporation of protease inhibitors in HAART has significantly reduced the morbidity and mortality and prolonged the lifespan of patients with HIV infection. Protease inhibitor benefits are unfortunately compromised by a number of clinically important adverse side-effects. Most patients on HAART develop a metabolic syndrome associated with partial lipodystrophy, hyperlipidemia, insulin resistance, premature atherosclerosis and myocardial infarction. Moreover, these patients face a growing number of other age-related comorbidities, such as neurodegeneration, osteopenia and malignancies. The cellular and molecular mechanisms underlying protease inhibitor-associated metabolic abnormalities remain elusive, but they seem to be related to overproduction of reactive oxygen speci es (ROS), induction of endoplasmic reticulum stress and activation of the unfolded protein response (UPR). The objective of this thesis was to determine the cell effects of four PIs (Atazanavir, Lopinavir, Ritonavir and Saquinavir) in cultures of primary human skeletal myotubes. This study showed that PIs increased ROS production, altered sarco/endoplasmic reticulum (SR/ER) morphology, increased expression of C/EBP homologous protein, a SR/ER stress marker, and decreased expression and localization at lipid rafts of Caveolin 3 and Flotillin 1. In addition, we showed that the antioxidant Resveratrol protected the human primary myotube of these iatrogenic effects. These data suggest a central role of the overproduction of ERO in the development of SR/ER stress and mislocalization of lipid raft proteins induced by PIs. Besides, in absence of vaccine, Resveratrol may be used by a potentiel therapeutic agent to attenuate PI-induced side effects

Les invasions biologiques sont un fardeau économique important si elles affectent des ressources critiques pour l’alimentation, la sante humaine ou les productions agricoles. Les ravageurs de la pomme de terre sont un challenge économique important tant ce tubercule est un aliment clé dans les pays andins. Il est possible de suivre la dispersion récente de la teigne du Guatemala, T. solanivora en Amérique du Sud depuis son introduction au Vénézuela à sa propagation progressive vers le sud. Par ailleurs, les invasions récentes fournissent un modèle unique pour analyser les processus d’adaptation de tout l’écosystème receveur au nouveau venu. Cette introduction de T. solanivora et sa coexistence avec la teigne endémique Phthorimaea operculella, nous offre la possibilité d’étudier l’adaptation de populations virales inféodées à P. operculella au nouvel hôte T. solanivora. Une étude de terrain a été engagée dans les régions productrices de pomme de terre en Colombie. A partir des larves de T. solanivora collectées sur 5 sites distincts, des infections à granulovirus ont été détectées. Tous les isolats viraux sont apparentés au Phthorimaea operculella granulovirus (PhopGV) précédemment décrit. Des différences de pathogénicité envers les deux hôtes ont été observées. Une variabilité a été détectée pour certains isolats au niveau de deux marqueurs génétiques. Les populations présentant une diversité génétique s’avèrent plus pathogènes sur les deux hôtes que des populations génétiquement homogènes. Elles offrent une opportunité pour le contrôle biologique de ces ravageurs. Des populations artificielles ont été construites pour mimer des populations naturelles mélangées. Elles se comportent de la même manière d’un point de vue biologique, mais l’évolution de la fréquence des marqueurs n’est pas liée à l’efficacité biologique, ce qui suggère que des différences non détectées dans le génome pourraient être responsables de l’adaptation de l’hôte. La productivité des infections dans les deux hôtes a été étudiée car elle est la clé de voute du développement d’un agent de contrôle biologique. Les productivités sur P. operculella (1,36 à 2,69 × 108 OBs/ mg) et T. solanivora (0,48 à 3,64 × 108 OBs/mg) ne sont pas très différentes. Les populations génétiquement mélangées ne se distinguent pas des populations homogènes par leur production totale dans l’un ou l’autre des deux hôtes, cependant, les rendements (production virale/inoculum) montrent des différences claires, les populations mélangées (naturelles ou artificielles) sont plus performantes sur les deux hôtes. Aucune réduction de la pathogénicité sur l’hôte d’origine n’a été observée après plusieurs cycles de réplication de la population virale sur l’hôte alternatif. Les populations virales originellement adaptées à P. operculella ont évolué pour infecter T. solanivora. Dans les régions où les deux hôtes sont présents, les populations virales développent une stratégie pour être efficaces sur les deux hôtes. / Biological invasions constitute an important economical burden when they affect key resources for human alimentation, health or agronomic productions. Potato pests are important as this tuber is a key food source in Andean countries. The recent dispersion of the Guatemalan potato tuber moth, T. solanivora in South America can be traced back to the introduction in Venezuela, with progressive dispersion towards the South. Recent invasions provide, in addition, a unique model to analyse the process of adaptation of the whole receiving ecosystem to the new comers. This introduction of T. solanivora and its coexistence with the endemic potato tuber moth, Phthorimaea operculella offer us the possibility of studying the adaptation to T. solanivora of virus populations infeodated to the later. A survey has been carried out in the potato-producing regions of Colombia. From the T. solanivora larvae collected, granulovirus infections were detected in five different locations. All virus isolates are related to the previously described Phthorimaea operculella granulovirus (PhopGV). Differences in the pathogenicity against the two hosts were observed. Variability was detected in some isolates at two genetic markers. Genetically diverse populations appear to be more pathogenic for both hosts than genetically homogeneous populations. They provide a possible solution for the biological control of these insect pests. Artificial populations were constructed to mimic the mixed natural populations. They behave similarly from a biological point of view, but the evolution of the markers frequencies is not related to the biological efficacy, suggesting that undetected differences in the genomes could be responsible of this host adaptation. The productivity of the infections in both hosts has been studied as it constitutes a key point for the development of a biocontrol agent. The productivity in P. operculella (1.36 to 2.69 × 108 OBs/ mg) and T. solanivora (0.48 to 3.64 × 108 OBs/mg) are not very different. Genotypically mixed populations cannot be differentiated from homogeneous populations by their total production in one or the other host, however, the yields (virus output/doses to infect) show clear differences, mixed populations (natural or artificial) perform better in both hosts. No reduction in the pathogenicity for one host was observed after few cycles of replication of the virus population in the second host. Virus populations originally adapted to P. operculella had evolved to infect T. solanivora. In regions where both host are present, the populations developed a strategy to be efficient on both hosts.

Le VPH-16 de même que certains VPH, dont le VPH-18, causent le cancer du col utérin. Son intégration dans le génome humain pourrait être un marqueur de progression de l’infection. Les charges virales totale et intégrée sont présentement mesurées en quantifiant par PCR en temps réel les gènes E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1) du VPH-16. Nous avons évalué l’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de l’ADN du VPH-16 dans des spécimens cliniques. Dans un premier temps, le gène E2 de 135 isolats de VPH-16 (123 appartenaient au clade Européen et 12 à des clades non- Européens) fut séquencé. Ensuite, un test de PCR en temps réel ciblant les séquences conservées dans E2 (RT-E2-2) fut développé et optimisé. Cent trente-neuf spécimens (lavages cervicaux et vaginaux) provenant de 74 participantes (58 séropositives pour le VIH, 16 séronégatives pour le VIH) ont été étudiés avec les trois tests E2 (RT-E2-2), E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1). Les ratios de la quantité d’ADN de VPH-16 mesuré avec RT-E2-2 et RT-E2-1 dans les isolats Européens (médiane, 1.02; intervalle, 0.64-1.80) et Africains 1 (médiane, 0.80; intervalle, 0.53-1.09) sont similaires (P=0.08). Par contre, les ratios mesurés avec les isolats Africains 2 (médiane, 3.23; intervalle, 1.92-3.49) ou Asiatique- Américains (médiane, 3.78; intervalle, 1.47-37) sont nettement supérieurs à ceux obtenus avec les isolats Européens (P<0.02 pour chaque comparaison). Les distributions des quantités de E2 contenues dans les 139 échantillons mesurées avec RT-E2-2 (médiane, 6150) et RT-E2-1 (médiane, 8960) étaient statistiquement différentes (P<0.0001). Nous avons observé que les charges virales totale (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% intervalle de confiance (IC) 1.11-4.19), et épisomale du VPH-16 (OR, 2.14 95% IC 1.09-4.19), mais pas la présence de formes intégrées (OR, 3.72 95% IC 1.03-13.4), sont associées aux néoplasies intraepitheliales cervicales de haut grade (CIN-2,3), et ce, en contrôlant pour des facteurs confondants tels que l’âge, le taux de CD4 sanguin, l’infection au VIH, et le polymorphisme de VPH-16. La proportion des échantillons ayant un ratio E6/E2 > 2 pour les femmes sans lésion intraépithéliale (7 de 35) est similaire à celle des femmes avec CIN-2,3 (5 de 11, p=0.24) ou avec CIN- 1 (4 de14, P=0.65). Le polymorphisme du gène E2 est un facteur qui influence la quantification des charges intégrées de VPH-16. / Episomal and integrated HPV-16 loads are currently estimated by quantitation with real-time PCR of HPV-16 E6 (RT-E6) and E2 (RT-E2-1) DNA. We assessed the impact of HPV-16 E2 polymorphism on quantitation of integrated HPV-16 DNA in clinical specimens. First, HPV-16 E2 was sequenced from 135 isolates (123 from European and 12 from non-European lineages). A novel assay targeting conserved HPV-16 E2 sequences (RT-E2-2) was optimized and applied with RT-E6 and RTE2- 1 on 139 HPV-16-positive cervicovaginal lavages collected from 74 women (58 HIV-seropositive, 16 HIV-seronegative). Ratios of HPV-16 DNA copies measured with RT-E2-2 and RT-E2-1 with European (median, 1.02; range, 0.64-1.80) and African 1 (median, 0.80; range, 0.53-1.09) isolates were similar (P=0.08). Ratios obtained with African 2 (median, 3.23; range, 1.92-3.49) or Asian-American (median, 3.78; range, 1.47-37) isolates were greater than those with European isolates (P<0.02 for each comparison). Distributions of HPV-16 E2 copies measured in 139 samples with RT-E2-2 (median, 6150) and RT-E2-1 (median, 8960) were different (P<0.0001). HPV-16 total (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% confidence interval (CI) 1.11-4.19), episomal (OR, 2.14 95% CI 1.09-4.19) but not integrated (OR, 3.72 95% CI 1.03-13.4) load, were associated with high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN-2,3) after controlling for age, CD4 count and HIV, and HPV-16 polymorphism. The proportion of samples with an E6/E2 ratio >2 in women without SIL (7 of 35) was similar to that of women with CIN-2,3 (5 of 11, P=0.24) or CIN-1 (4 of 14, P=0.65). E2 polymorphism was a factor that influenced measures of HPV-16 integrated load.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

L’histoire naturelle de l’infection anale par le virus du papillome de type 16 (VPH-16) est mal définie pour les hommes ayant des relations sexuelles avec d’autres hommes (HARSAHs) VIH-séropositifs. Le but de cette étude était d’évaluer l’association entre la charge épisomale et intégrée du VPH-16 et la progression de la néoplasie intraépithéliale anale (AIN). Les charges épisomales et intégrées du VPH-16 furent mesurées par PCR quantitatif en temps réel sur 665 spécimens anaux obtenus de 135 hommes VPH-16-positifs participant à l’étude prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group). Le grade de l’AIN fut déterminé sur des biopsies obtenues lors des anuscopies à haute résolution périodiques. L’intégration du VPH-16 fut confirmée par DIPS-PCR pour démontrer la présence de jonctions virales-cellulaires. La charge épisomale du VPH-16 [ratio de cote (OR) 1.5, intervalle de confiance (IC) à 95%=1.1–2.1], le nombre de types de VPH [OR 1.4 (IC 95%=1.1–1.8)] et le tabagisme actuel [OR 4.8 (IC 95%=1.3–18.6)], mais non la charge intégrée, furent associés aux lésions de haut-grade (AIN-2,3) après ajustement pour l’âge et le décompte des lymphocytes CD4. La charge épisomale du VPH-16 était le seul facteur prédictif de progression de l’AIN de bas-grade (AIN-1) vers l’AIN-2,3 [OR 8.0 (IC 95%=1.2–55.4)]. Les spécimens avec une charge épisomale du VPH-16 élevée étaient moins susceptibles de contenir de l’intégration [OR 0.5 (IC 95%=0.3–0.8)]. L’intégration du VPH-16 fut détectée en absence d’AIN, dans l’AIN-1 et dans l’AIN-2,3. L’analyse des jonctions virales-cellulaires ne permit pas d’identifier un site d’intégration spécifique. / The natural history of human papillomavirus type 16 (HPV-16) anal infection is undefined among HIV-seropositive men having sex with men (MSM). The aim of this study was to assess the association between HPV-16 episomal and integrated viral loads and the progression of anal intraepithelial neoplasia (AIN). HPV-16 episomal and integrated loads were measured on 665 specimens from 135 HPV-16-positive men participating in the prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group) study. AIN grade was evaluated on biopsies obtained during periodical high-resolution anoscopies. HPV-16 integration was confirmed by DIPS-PCR to demonstrate the presence of viral-cellular junctions. HPV-16 episomal loads [odds ratio (OR) 1.5, 95% confidence interval (CI)=1.1–2.1], burden of HPV infection [OR 1.4 (95% CI=1.1–1.8)] and current smoking [4.8 (95% CI=1.3–18.6)], but not integrated loads, were associated with high-grade lesions (AIN-2,3) after age and CD4 counts adjustment. A high HPV-16 episomal load was the only predictive factor of progression from low-grade AIN to high-grade AIN [OR 8.0 (95% CI=1.2–55.4)]. Specimens with higher HPV-16 episomal loads were less likely to contain integration [OR 0.5 (95% CI=0.3–0.8)]. HPV-16 integration was detected in the absence of AIN, in AIN-1 and in AIN-2,3. The analysis of the viral-cellular junctions did not allow identifying a specific site of integration.