Made available in DSpace on 2015-11-18T13:13:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 153.pdf: 1182479 bytes, checksum: 572ca8cb379e9adc3ceb185ab244a3eb (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é uma arbovirose causada pelo vírus Dengue (DENV), cujos principais vetores são os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus. A. aegypti é o único vetor de DENV em Cabo Verde, país que teve a sua primeira epidemia da dengue registrada em 2009. Contudo, pouco se sabe acerca da variação no nível de competência vetorial das populações do vetor aos diferentes sorotipos de DENV. O estudo teve como objetivo avaliar a competência vetorial de A. aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, a quatro sorotipos de DENV. Para isso, os mosquitos foram alimentados artificialmente com sangue contendo diferentes sorotipos de DENV, e em seguida dissecados ao 7º, 14º e 21º dia após infecção (dpi) para verificar a presença do vírus no intestino, cabeça e glândulas salivares usando a técnica de RT-PCR. Adicionalmente, o número de cópias de RNA viral presente nas glândulas salivares foi determinado por qRT-PCR. Foram observadas altas taxas de infecção das glândulas salivares para DENV-2 e DENV-3 (65 e 75 por cento respectivamente), enquanto que para DENV-1, o RNA viral só foi detectado no intestino e cabeça, não chegando a infectar as glândulas salivares. DENV-4 não disseminou para cabeça e glândulas salivares, mantendo a infecção apenas no intestino (9 por cento). O número de cópias de RNA viral nas glândulas salivares não variou significativamente entre DENV-2 e DENV-3 e nem entre os diferentes períodos de incubação do vírus e títulos de DENV testados. Conclui-se, que a população de Aedes aegypti da ilha de Santiago, Cabo Verde, possui alta competência vetorial para as cepas de DENV-2 e DENV-3 e são pouco susceptíveis para as de DENV-1 e DENV-4. As cópias de RNA viral nas glândulas salivares mantêm-se relativamente constante por 21 dias após a infecção, o que pode potencializar a capacidade vetorial de mosquito A. aegypti e sugere alguma forma de modulação da replicação do vírus nesse órgão

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 guilherme_oliveira_ioc_mest_2013.pdf: 3479656 bytes, checksum: 4ad372ddeca17dc08f228d0e510e0f7e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hepatite A é uma doença hepática aguda, causada pelo vírus da hepatite A (HAV), um vírus de RNA da família Picornaviridae com transmissão fecal-oral. Atualmente, o Brasil apresenta um padrão de endemicidade intermediária da doença. Normalmente, a doença possui curso autolimitado e é benigna, porém existem formas graves que podem causar insuficiência hepática aguda em 0,01% dos casos. Além de medidas sanitárias, outro método importante de prevenção é a utilização de vacinas inativadas, esta porém só é utilizada na imunização de grupos de risco. É conhecido o elevado risco de infecção pelo HAV em comunidades nativas no mundo, no entanto, poucos trabalhos abordam este tema em comunidades indígenas do Brasil. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de hepatite A em aldeias e povoados pertencentes a reserva Apinajé, Tocantinópolis/TO. Foram analisadas 799 amostras sorológicas para anti-HAV total, sendo 358 indígenas e 441 dos povoados locais, em onze comunidades geograficamente separadas. Para tal, utilizou-se o Kit imunoenzimático comercial da marca Diasorin®. A prevalência total de anti-HAV na população estudada foi de 85,5 %. A localidade que apresentou maior prevalência foi a Aldeia Girassol (95,5%) Observou-se o aumento da prevalência de anti-HAV com o envelhecimento da população, sendo menor a prevalência (32,7%) observada no grupo etário mais jovem (0-2 anos) e maior prevalência (100%) acima dos 40 anos de idade. Observa-se que, entre os indígenas, 84,87% possuem anti-HAV reagente e nos povoados 85,97%, não havendo diferença ao comparar estas prevalências. Observamos que 39% das crianças até 12 anos estão sob risco de adquirir a doença, e até os 5 anos este número sobe para 59%, logo, a população média suscetível à hepatite A é baixa por situar-se entre a faixa de 5 à 14 anos. A reserva Apinajé apresenta prevalência intermediária de anti- HAV, tanto nas aldeias quanto nos povoados. Em relação a tendência de soroconversão de hepatite A, nas aldeias isto ocorre com maior frequência durante a transição da fase pré-escolar para escolar, enquanto que nos povoados este risco se dá entre a fase escolar e a adolescência. A prevalência encontrada em crianças e adolescentes reforça a possibilidade da implementação da vacina contra hepatite A no calendário infantil / Hepatitis A is an acute liver disease cause d by hepatitis A virus (HAV), an RNA virus of the Picornaviridae's family of fecal-oral transmission. Curre ntly Brazil has a pattern of intermediate endemicity of the disease. Usually the disease is self-limited and has a benign course, but there are severe forms that can cause acute liver failure in 0.01% of cases. Besides to sanitary actions, another impor tant method of prevention is to use inactivated vaccines, but this is only used to immunize ri sk groups in Brazil. In native communities, the risk of HAV infection is high around the wo rld, however, few works addre ss this issue in indigenous communities in Brazil. The objective of this stu dy was to evaluate the prevalence of hepatitis A in villages and towns belonging to Apinajé reservation, Tocantinópolis/TO. For this purpose, 799 serum samples were analyzed for anti-HAV to tal being 358 from indigenous villages and 441 from local town in eleven geographically separated communities. It was used the commercial immunoenzymatic kit DiaSorin® br and. The overall prevalence of anti-HAV in the population studied was 85.5%. Th e locality with th e highest prevalence was the Girassol Village (95.5%). We observed in creased prevalence of anti-HAV with an ascending aging of population, and the lowest prevalence (32.7%) in the younger age group (0-2 years) and a higher prevalence (100%) over 40 years of age. It is observed that among the indigenous people 84.87% have anti-HAV reagent and in the town s 85.97%, with no difference when comparing these prevalences. We observed that 39% of children under 12 years are bound to acquire the disease, and up to 5 years, this prevalence ri ses to 59%, so the averag e population susceptible to hepatitis A is low as it is between the ranges of 5 to 14 years old. The reserve Apinajé has intermediate prevalence of anti-HAV, both in villages and in the town. Regarding the trend of seroconversion of hepatitis A in the villages that occurs most frequently during the transition from preschool to school phase, while in the vi llages this risk occurs between middle childhood and adolescence. The prevalence in children and adolescents strengthens implementation of hepatitis A vaccine included in the childhood schedule could minimize the risks associated with the disease.

VANDERLEI, E. S. O. Atividades antiviral e anti-inflamatória de uma fração polissacarídica sulfatada da alga marinha vermelha Gracilaria birdiae (Plastino e Oliveira). 2012. 141 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-12-03T12:19:08Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_esovanderlei.pdf: 5817978 bytes, checksum: dc9dd25d9df39cef6cafbcd2ab3bab3d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-16T21:03:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_esovanderlei.pdf: 5817978 bytes, checksum: dc9dd25d9df39cef6cafbcd2ab3bab3d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-16T21:03:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_esovanderlei.pdf: 5817978 bytes, checksum: dc9dd25d9df39cef6cafbcd2ab3bab3d (MD5) Previous issue date: 2012 / Bioactive molecules extracted from seaweed, such as sulfated polysaccharides, have been highlighted as having diverse biological activities. This study aimed to evaluate the antiviral activity and anti-inflammatory effect of a sulfated polysaccharide from seaweed Gracilaria birdiae. Total sulfated polysaccharides (TSP) were extracted by enzimatic digestion and following fractioned on DEAE-cellulose column, obtaining two fractions (FI - 0.5 M and FII - 0.75 M). The FI fraction, which had the highest yield, was object of this study, has been identified as an agar by IR spectroscopy (FT-IR) and with a high molecular weight (>100KDa) by gel permation cromatography. The cell viability of FI fraction was determined by the change of the cell morphology with further quantification at 492 nm. Cells were treated with serial dilutions of FI (1000 to 7.8 μg/mL) and then, neutral red dye was incorporated, with subsequent measurement of absorbance. The degree of antiviral activity was expressed as percent inhibition of the virus. The results showed that FI at a concentration of 250 μg/mL showed no toxicity on C6/36, Vero and HEp-2 cells and had a significant antiviral effect with inhibition of 95.8% against HSV-1, 94.4% against HSV-2 on Vero cells and 89.2% against DENV-1 on C6/36 cells, when compared to the control group. In addition, FI (10 mg /kg) presented anti-inflammatory effect when administered by subcutaneous route (s.c.) in Wistar rats in a model of peritonitis using carrageenan with a flogistic agent or in the paw edema using carrageenan or dextran. FI (10 mg/kg) induced an anti-inflammatory effect by a decrease in the leukocytes into the peritoneal cavity. FI also reduced the paw edema induced by carrageenan in the third hour comproved by the mieloperoxidase quantification and also inhibited the paw edema induced by dextran on the first thirty minutes. To analyze the involvement of the heme oxygenase pathway on antiinflammatory activity of FI, animals were pretreated by s.c. route with an specific inhibitor of heme group (zinc protoporphyrin IX). After inhibition by ZnPP IX, the anti-inflammatory effect of FI on carrageenan-induced paw edema has not been observed. To evaluate the systemic effects, FI (10 mg/kg) was administered by intraperitoneal route in mice in a single dose. The systemic changes were evaluated during 48 h or by repeated dose, once a day for 14 days. The results showed that, FI (10 mg/kg) did not cause mortality or significant changes in the biochemical, hematological and histopathological parameters, considered safe in the tested dose. / Moléculas bioativas extraídas a partir de algas marinhas, tais como os polissacarídeos sulfatados,vêm se destacando como possuidores de diversas atividades biológicas. Este estudo teve como objetivo avaliar as atividades antiviral e anti-inflamatória de uma fração polissacarídica sulfatada da alga marinha Gracilaria birdiae. Os polissacarídeos sulfatados totais (PST) foram extraídos por digestão enzimática e em seguida, fracionados em coluna de DEAE-celulose, originando duas frações (FI- 0,5 M e FII- 0,75 M). A fração FI, de maior rendimento, foi objeto de estudo, sendo identificada como uma agarana por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) e de elevada massa molecular (>100 KDa) por cromatografia de permeação em gel. A viabilidade celular da fração FI foi determinada por alteração da morfologia celular com posterior quantificação a 492 nm. As células foram tratadas com diluições seriadas de FI (1000 a 7,8 μg/mL) e em seguida, incorporado o corante vermelho neutro, com posterior leitura de absorbância. O grau de atividade antiviral foi expresso como percentagem de inibição viral. Os resultados mostraram que FI na concentração de 250 μg/mL não apresentou toxicidade em células C6/36, Vero e HEp-2 e apresentou um efeito antiviral significativo com inibição de 95,8% contra o HSV-1, de 94,4 % contra o HSV-2 em células Vero e de 89,2 % contra DENV-1 em células C6/36, quando comparado ao grupo controle. Em adição, FI (10 mg/kg) apresentou efeito anti-inflamatório quando administrada por via subcutânea (s.c.) em ratos Wistar no modelo de peritonite utilizando carragenina como agente flogístico ou no edema de pata induzido por carragenina ou dextrana. FI (10 mg/kg) provocou um efeito anti-inflamatório por uma diminuição no número de leucócitos na cavidade peritoneal, além de também reduzir o edema de pata induzido por carragenina na terceira hora, comprovado pela quantificação da mieloperoxidase e também o edema por dextrana nos primeiros trinta minutos. Para analisar o envolvimento da via heme oxigenase na atividade anti-inflamatória de FI, os animais foram pré-tratados por via s.c. com um inibidor específico do grupo heme (zinco rotoporfirina IX). Depois de inibida por ZnPP IX, o efeito anti-inflamatório de FI no edema de pata induzido por carragenina não foi observado. Para avaliar os efeitos sistêmicos, FI (10 mg/kg) foi administrada por via intraperitoneal em camundongos em dose única. As alterações sistêmicas foram avaliadas durante 48 h ou por dose repetida, uma vez ao dia durante 14 dias, sendo que FI (10 mg/kg) não causou mortalidade ou alterações significativas nos parâmetros bioquímicos, hematológicos e histológicos, sendo considerada segura na dose testada.

A VP3, ou Apoptina, é uma das proteínas codificadas pelo vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Esta proteína é capaz de induzir apoptose em células humanas tumorais; entretanto, o mesmo não ocorre em células normais. Assim, esta proteína apresenta-se como uma promissora candidata como agente antineoplásico. O girovírus aviário 2 (AGV2), descrito em 2011, é relacionado ao CAV e codifica proteínas homólogas às expressas por este vírus, incluindo a VP3. A comparação da sequência de aminoácidos da VP3 do AGV2 com a da Apoptina do CAV revela uma identidade de 32,2% e o compartilhamento de domínios importantes para a atividade pró-apoptótica tumor-especifica. Nesse trabalho objetivamos investigar o potencial de três variantes da VP3 do AGV2 em induzir seletivamente a morte de células humanas tumorais. Os genes das VP3 foram expressos através de um sistema de expressão adenoviral. Após a transdução dos adenovírus recombinantes expressando as VP3 do AGV2 nas células humanas tumorais A549 e normais MRC-5, a localização subcelular dessas proteínas foi analisada por imunofluorescência e suas implicações sobre a viabilidade celular foram determinadas pelo ensaio de MTT. Nossos resultados evidenciam que os adenovírus expressando as variantes da VP3 do AGV2 possuem a habilidade de inibir preferencialmente a proliferação de células tumorais. Demonstramos também que as VP3 do AGV2 acumulam-se no núcleo das células tumorais, enquanto que na maior parte das células normais essas proteínas ficam restritas ao citoplasma. No entanto, inesperadamente detectamos, em menor proporção, a expressão de VP3 do AGV2 também no núcleo das células normais. Ainda, analisando as sequências de aminoácidos das variantes da VP3 do AGV2, pudemos conjecturar que a presença de um sinal de exportação nuclear com menor eficiência do que o existente na Apoptina do CAV pode estar correlacionado com a localização nuclear dessas proteínas nas células normais e com a inibição da proliferação celular verificada nessas células. Este é o primeiro trabalho demonstrando o potencial da proteína VP3 codificada pelo AGV2 em induzir preferencialmente a morte de células humanas tumorais. / VP3, also known as Apoptin, is one of the proteins encoded by the chicken anemia virus (CAV). This protein is able to induce apoptosis in tumor cells; however, the same does not occur in normal cells. Thus, this protein appears as a promising candidate for anticancer therapy. The recently discovered avian gyrovirus 2 (AGV2) is related to CAV and encodes CAV-homologous proteins, including VP3. The comparison of the AGV2-VP3 amino acid sequence with CAV-Apoptin shows an identity of 32.2% and the presence of functional domains that seem to be important for its tumor-specific pro-apoptotic activity. In this work, we aim to investigate the potential of three AGV2-VP3 protein variants as inducers of apoptosis in human tumor cells. VP3 genes were expressed through an adenoviral expression system. After transduction of the recombinant adenoviruses expressing the AGV2-VP3 variants in human tumor A549 cells and normal MRC-5 cells, subcellular localization of these proteins was analyzed by immunofluorescence and their effects on cell viability was determined by MTT assay. Our results show that the adenoviruses expressing AGV2-VP3 have the ability to inhibit preferentially the proliferation of tumor cells. We also demonstrate that AGV2-VP3 variants accumulate in the nucleus of tumor cells, whereas in most normal MRC-5 cells these proteins are restricted to cytoplasm. However, we unexpectedly detected the expression of AGV2-VP3 proteins, in a lesser extent, in the nucleus of normal cells. Furthermore, analyzing the amino acid sequences of AGV2-VP3 variants we could speculate that the presence of a nuclear export signal (NES) with a lower efficiency than CAV-Apoptin NES may be correlated to the nuclear localization of these proteins in normal cells and to the cell proliferation inhibition observed in these cells. This is the first study validating the potential of AGV2-VP3 protein to preferably induce death of human tumor cells.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

Os morcegos (Ordem Chiroptera) estão entre as espécies de mamíferos mais diversificadas e distribuídas no mundo. É reconhecido o papel fundamental que eles exercem na natureza. Por outro lado, são conhecidos como importantes reservatórios de agentes de doenças infecciosas, dentre os quais vírus, até pouco tempo desconhecidos, que nas últimas décadas se tornaram emergentes em humanos e outras espécies. Dentre os vírus RNA emergentes, destacam-se o SARS-CoV, MERS-CoV, vírus Hendra e Nipah e o último a causar importante surto na África, vírus Ebola.Mais de 100 espécies de vírus já foram detectadas em morcegos em todo o mundo, tanto vírus RNA, quanto vírus DNA, embora importância desses últimos como agentes de zoonoses ainda não tenha sido confirmada. Estudos no Brasil com relação à detecção de vírus em morcegos são praticamente inexistentes, e são focados apenas na vigilância e epidemiologia do vírus rábico. Portanto, este trabalho objetivou a detecção de vírus, tanto RNA, quanto DNA, em amostras de morcegos no estado do Rio Grande do Sul, através de técnicas moleculares e sequenciamento dos fragmentos obtidos. Identificamos a presença de vírus da família Coronaviridae, Circoviridae e Adenoviridae em amostras de fezes e tecidos de morcegos insetívoros e hematófagos. A detecção de novas espécies de vírus da família Circoviridae confirma a diversidade viral que estes vírus podem apresentar. Os resultados obtidos por investigação não podem afirmar se tais vírus apresentam potencial zoonótico, mas por serem dados inéditos no país, reforçam a importância da vigilância e de estudos adicionais para melhor compreender o papel que diferentes espécies de morcegos tem como reservatórios de vírus que possam ter impacto na saúde animal e humana. / Bats (Order Chiroptera) are among the most diverse and worldwide distributed mammal species. It is recognized the important role they play in nature, but, on the other hand, they are known as important reservoirs of infectious diseases, including viruses, until then unknown, that have become emerging in recent decades. Among RNA viruses of great importance are the SARS-CoV, MERS-CoV, Hendra and Nipah viruses and the one responsible to cause major outbreaks in Africa recently, the Ebola virus. More than 100 species of virus have been detected in bats in the world, both RNA and DNA viruses DNA, although the latter still hasn't confirmed its importance on zoonosis or the impact it would cause to the host itself.Studies in Brazil are practically nonexistent, because they are focused only on surveillance and epidemiology of rabies virus. Therefore, this work aimed to virus detection, both RNA and DNA in samples from bats in the State of Rio Grande do Sul, through molecular techniques and sequencing of the fragments obtained.We identify the presence of viruses of the family Coronaviridae, Circoviridae and Adenoviridae in stool samples and tissues. In addition, the discovery of new species of viruses of the family Circoviridae confirms viral diversity that these bats can carry. The results obtained in this investigation cannot confirm if such viruses have zoonotic potential, but as they are the first data published in the country, it underscores the importance of vigilance and additional studies to better understand the role that different species of bats have as reservoirs of viruses that may have an impact on animal and human health.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:05:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340550.pdf: 794194 bytes, checksum: b6f56f927dd80a6c17a5813be3af20ed (MD5) Previous issue date: 2016 / A videira é uma das frutíferas mais produzidas no mundo. Seu cultivo está presente na cultura de praticamente todos os povos e difundida por várias partes do mundo. Contudo, devido à forma de propagação, predominantemente vegetativa, presença constante de fitófagos e utilização de enxertia, é recorrente a presença de vírus fitopatogênicos em plantas de videira. Por este motivo, ao longo dos anos, muitos estudos foram realizados com o objetivo de desenvolver e aperfeiçoar os métodos de indexagem. Os primeiros métodos adotados para indexagem em videiras, foi a observação de sintomas nas plantas ou em plantas indicadoras, através da enxertia, esta pratica é conhecida como indexagem biológica. Com a necessidade de maior agilidade e precocidade para identificação de plantas com vírus, passou-se a ser utilizados métodos de indexagem sorológica, através dos testes do tipo ELISA. ? Neste cenário, o objetivo com este trabalho foi testar e desenvolver métodos confiáveis para a indexagem molecular de videiras, assim como conhecer a presença e distribuição dos principais vírus em viveiros nacionais. Um estudo preliminar foi implantado visando estabelecer um protocolo de extração de RNA adequado para obtenção de material genético com qualidade e pureza. Foram coletadas amostras de 109 plantas matrizes em cinco viveiros nacionais e de um Programa do Banco Genético de Melhoramento da Videira, as amostras foram utilizadas para a realização dos testes sorológico (ELISA) e molecular (RT-qPCR), para os vírus GVA, GVB, GFkV, GFlV, GLRaV-1 e GLRaV-3, o teste ELISA foi realizado utilizando o anti-soro comercial AGRITEST (Valenzano, Itália) e o RT-qPCR através de sonda marcada com química ZenTM (IDT, Coralville, Estados Unidos das Américas). Para o desenvolvimento dos marcadores moleculares, sequências de ORF?s (Open Read Frame) de cada vírus, bem como a sequência do gene 18S rRNA para controle interno, foram obtidas a partir do NCBI e posteriormente análisadas com a ferramenta on line BLAST, para seleção de regiões adequadas para a construção de marcadores moleculares, dentre as sequências obtidas, foi selecionada as regiões com ausência de pontos de mutação após o alinhamento das fitas, para isto, foi utilizado o software BioEdit. Foram construídos marcadores moleculares (forward | probe | reverse) com o quencher interno ZenTM e fluorescência do reporter FAM em três fragmentos genômicos para cada vírus, utilizando o algoritmo da ferramenta on line PrimerQuest. Para os testes de amplificação, via T-qPCR, foi utilizadoIXamostras de três isolados virais distintos e a reação foi realizada com o mastermix QuantiTec Probe (Qiagen, Hilden, Alemanha) em 45 ciclos de amplificação. Nos testes preliminares, foi observado maior qualidade e concentração do RNA obtido extraído a partir de tecidos tenros, como o mesocarpo de frutos e a folha da videira, contudo, devido a estes tecidos possuírem comummente reduzida carga viral, não são utilizados para indexagem, que é tradicionalmente realizada através de segmentos de sarmentos em dormência. Para este tecido, foi observado melhores resultados utilizando o kit de extração RNeasyPlant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Devido a isto, este kit foi empregado durante o desenvolvimento deste estudo. Os marcadores sintetizados para os vírus GVA, GVB e GFlV não amplificaram na reação de RT-qPCR, provavelmente devido a dificuldade no anelamento das sequências utilizadas, desta forma, para estes vírus será necessário novos estudos para síntese de sequências a serem empregadas na indexagem. Para o GFkV, GLRaV-1 e GLRaV-3 foi possível utilizar os marcadores desenvolvidos neste estudo. Em todos os viveiros coletados foi identificado a presença de ao menos uma planta contaminada por vírus, somente estando livre de contaminação as mudas da coleção do Programa de Melhoramento Genético. O GVB, seguido pelo GFkV foram os vírus encontrados com maior frequência neste estudo, enquanto o GVA foi o único vírus ausente em todas as amostras indexadas. Não foi observado a presença de GLRaV-1 pelo teste ELISA, sendo uma amostra identificada como positiva para este vírus por meio da indexagem molecular. Para os vírus GVA, GVB e GFlV será necessário o desenvolvimento de maiores estudos para validar marcadores moleculares com a química ZenTM (IDT, Coralville, Estados Unidos das Américas), o marcador GLRaV-1 01 e GFkV 01 podem ser empregados para a indexagem para os vírus GLRaV-1 e GFkV respectivamente, bem como os marcadores GFLRaV-3 01 e GLRaV-3 03 podem ser utilizados para indexagem do vírus GLRaV-3 em reações de RT-qPCR a partir de tecidos de videira.<br> / Abstract : The grapevine is one of the fruit world's most productive importance, being rooted in almost all cultures and spread in various parts of the world. However, because the propagation method, predominantly vegetative, through grafting, facilitate the presence of pathogenic viruses in vine tissues. For this reason, over the years, many studies objective develop and improve the indexing methods. The old methods used for vine indexing was the simple observation of symptoms in plants or indicator plants through grafting, this known as a biological indexing. Nowadays, improving the speed and precocity for indexing, serological methods are been adopted, the most common is ELISA test. These due to the strong advance in molecular biology in recent years, which stand out for their accuracy, reliability and speed of execution. However, to adopt molecular tests, it is necessary develop solid and reliable approaches. The objective of this work is test and develop reliable methods for molecular grapevine indexing, as well knowing the presence and distribution of the main virus in National Nurseries. A preliminary study was implanted looking for stablish one adequate RNA extraction protocol to obtain quality genetic material. Were collected samples from 109 plants in 5 national nurseries, and from the Grapevine breeding program and genetic bank, the samples were utilized to make the serological test (ELISA) and molecular (RT-qPCR) to the virus GVA, GVB, GFkV, GFlV, GLRaV-1 and GLRaV-3. The ELISA test made using the commercial anti serological AGRITEST (Valenzano, Italy), and the RT-qPCR through the labeled probe from ZenT chemilcal (IDT, Coralville, USA). To develop molecular markers, ORF?s sequences (Open Read Frame) of each virus, as well the gene sequence of 18S rRNA to internal control, sequences obtained from NCBI and after analyzed with online BLAST tool. To select adequate regions to build molecular markers, between the obtained sequences, the regions with absence of mutation points after alignment were selected, for this; we made use of BioEdit software. Molecular markers (forward/probe/reverse) designed with internal quencher Zen and fluorescence from reporter FAM in three genomic fragments for each virus, utilizing the logarithmic online tool PrimerQuest. For the amplification test, through T-qPCR, we made yse of three distinct viral samples, and the reaction made using mastermix QuantiTec Probe (Qiagen Hilden, Germany) in 45 amplification cycles.XIIn the preliminary tests, more RNA quality and concentration obtained from tender tissues, like fruits mesocarp and grapevine leaf. However, due to the reduced viral charge from this tissue, are not widely used for indexing, normally is used segments from dormancy branches. For this tissue, better results utilizing RNeasyPlant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) observed. For this reason, we made use of this kit during this study. The molecular markers were synthetized to the virus GVA, GVB, and GF1V did not amplify in the RT-qPCR reaction, probably due to annealing difficulties in the utilized sequences, this way, to this virus it is necessary new studies to synthetize sequences for indexing using. To the GFkV, GLRaV-1 and GLRaV-3 the markers developed on this study amplified. In all the nurseries, at least one plant had virus contamination, being free only the collection from the Plant breeding program. The GVB, followed by the GFkV are encountered with more frequency in this study, while the GVA is the only absence in all the samples. The ELISA test did not identify GLRaV-1 to any sample, while one positive sample detected through molecular indexing. To the virus GVA, GVB, and GF1V will be necessary develop more studies to validate molecular markers. The marker GLRaV-1 01 and GFkV 01 are ready to use in indexing of GLRaV-1 e GFkV virus respectively, as well the markers GFLRaV-3 01 e GLRaV-3 03 are to the GLRaV-3 virus in RT-qPCR from grapevine tissues.

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um vírus pequeno, sem envelope e com genoma DNA circular de fita simples pertencente ao gênero Circovirus da família Circoviridae. O PCV2 está associado a uma síndrome multissistémica, atualmente denominada de porcine circovirus–associated disease (PCVAD) que acomete suínos e causa sérios prejuízos econômicos. Esta doença caracteriza-se por apresentar uma variedade de manifestações clínicas, como diminuição do ganho de peso, distúrbios respiratórios e entéricos, desordens reprodutivas e alta mortalidade. Além disso, PCVAD está fortemente associada a manifestações de dermatite, comprometimento renal e depleção linfóide. Apesar das grandes perdas econômicas e das inúmeras manifestações clínicas, a patogenia e o mecanismo de infectividade do PCV2 ainda não estão totalmente esclarecidos. O objetivo deste trabalho é avaliar a patogenia do PCV2 em suínos naturalmente infectados e em cultivo celular através da caracterização dos efeitos da infecção no sistema vascular. Primeiramente, foi realizada uma investigação para determinar os parâmetros hemostáticos de suínos naturalmente infectados por PCV2. Além disso, avaliou-se, in vitro, as alterações nas propriedades hemostáticas em células endoteliais infectadas pelo PCV2. Nossos resultados, mostram que suínos naturalmente infectados pelo PCV2 apresentam um estado protrombótico, demonstrado pela diminuição do tempo de coagulação e dos níveis de fibrinogênio, ativação e consumo plaquetário, aumento na atividade de trombina no plasma, e presença de vasculite nos capilares sanguíneos. In vitro, foi demonstrado que as células endoteliais infectadas pelo PCV2 apresentam um fenótipo ativado, caracterizado pelo aumento na atividade procoagulante na superfície celular. Além disso, foi observado que o tratamento com trombina exógena nos cultivos celulares infectados por PCV2 induz um aumento na carga viral. A partir disso, evidencia-se a participação do endotélio na infecção pelo PCV2, e a capacidade do vírus em modular a hemostasia. O conjunto destes dados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante a infecção pelo PCV2, especialmente no sistema vascular, permitindo uma maior compreensão dos mecanismos patogênicos da PCVAD e fornecendo novos conhecimentos dos processos envolvendo a interação PCV2-suíno. / Porcine circovirus type 2 (PCV2) is a small non-enveloped virus with a single-strand DNA genome, which belongs to the Circovirus genus of the Circoviridae family. PCV2 is related to a multisystemic syndrome nowadays called porcine circovirus-associated disease (PCVAD), which affects pigs and causes considerable economic losses. The disease is characterized by a variety of clinical manifestations, such as decrease in weight gain, respiratory and enteric disturbance, reproductive disorders and high mortality rates. Apart from this, PCVAD is also associated to dermatitis, renal failure and lymphoid depletion. In spite of the large economic losses and of the numerous clinical manifestations, the pathogenesis and infection mechanism of PCV2 have not been fully clarified. The aim of this study is to evaluate the PCV2 pathogenesis in naturally infected pigs and in cell culture, by characterizing the effects of the infection in the vascular system. Firstly, an investigation aimed at determining the hemostatic parameters in naturally infected pigs was conducted. Also, an in vitro evaluation of the hemostatic properties of PCV2-infected endothelial cells was performed. Our results show that pigs naturally infected with PCV2 presented a prothrombotic state manifested as decreased coagulation time and fibrinogen levels, reduced platelet activation and consumption, increased thrombin plasma activity, and as the occurrence of vasculitis in capillary vessels. In vitro, it was demonstrated that endothelial cells infected with PCV2 presented an activated phenotype characterized by a higher procoagulant activity on the cell surface. Apart from this, the treatment with exogenous thrombin in PCV2 infected cell cultures induces an increase in viral load. These findings reveal the role played by the endothelium in the PCV2 infection and the capacity of the virus to modulate hemostasis. Taken together, these results afford to better understand the phenomena taking place in the host during PCV2 infection, namely in the vascular system, shedding new light on the pathogenic mechanisms of PCVAD and on the processes involved in the swine-PCV2 interaction.

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Membros da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) tem sido associados a diferentes condições clínicas em bovinos. Assim, diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 é uma valiosa informação objetivando um melhor entendimento da patogenia e epidemiologia destes vírus no rebanho bovino. Contudo, métodos para diferenciação são escassos devido às reações cruzadas originadas da alta homologia genômica e antigênica entre estes vírus. O presente estudo concentrou-se na análise da região carboxi-terminal da glicoproteína C (nucleotídeos 16763 - 17337 em BoVH-1 e 17671 - 18242 em BoHV-5), uma vez que tal região apresentou características potenciais que permitissem a diferenciação entre estes vírus. Assim, no primeiro capítulo do presente trabalho a região carboxi-terminal da gC foi utilizada como alvo para o desenvolvimento de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) seguida da Análise da Restrição Enzimática (REA) do fragmento amplificado, capaz de diferenciar entre isolados de BoHV-1 ou BoHV-5, gerando fragmentos com tamanhos de 575 pares de base (pb) frente a BoHV-1 e 572 pb frente a BoHV-5. A diferenciação entre BoHV-1 e BoHV-5 foi obtida após a digestão dos amplicons com a enzima de restrição Bgl I. No segundo capítulo, a região carboxi-terminal de 23 amostras Sul-Americanas de BoHV-1 ou BoHV-5 foram amplificadas e sequenciadas. A análise filogenética realizada com as sequências de nucleotídeos revelou identidade variando entre 98,7 a 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 a 92% (BoHV-1/ BoHV-5) e 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). Alinhamentos realizados com sequências de aminoácidos revelaram identidade variando entre 97,5 a 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 a 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) e 92,1 a 99,5% (BoHV-5/ BoHV-5). Análises filogenéticas revelaram, ainda, que: i) alguns isolados de BoHV-5 apresentaram um padrão diferente daqueles até o presente reconhecidos; ii) uma amostra isolada no Uruguai (BoHV-1.2) apresentou um padrão de agrupamento distinto quando comparado com as outra amostras de BoHV-1.2. O terceiro capítulo apresenta o primeiro relato de detecção de BoHV-5 de sêmen bovino através da análise antigênica, amplificação diferencial da região amino-terminal do gene da gC de BoHV-1 e 5, seguida da caracterização por REA do isolado em estudo. Em síntese, através da utilização da gC foi possível avaliar a homologia entre as amostras Sul- Americanas estudadas; desenvolver uma PCR/REA diferencial entre estes vírus e relatar a detecção de uma amostra de BoHV-5 isolada à partir de sêmen contaminado. / Members of the Herpesviridae family, Alphaherpesvirinae subfamily bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) have been associated to different clinical conditions of cattle. Thus, differentiation has become an important tool for a better understanding of the pathogenesis and epidemiology of BoHV infections in cattle. However, currently available methods for such differentiation are hampered by cross-reactions from high genomic and antigenic homology between these viruses. The present work focused on the analysis of the carboxy-terminal portion of glycoprotein C (gC), corresponding to nucleotides 16763 - 17337 on BoHV-1 and 17671 - 18242 on BoHV-5 once such region showed characteristics that would allow a clear distinction between BoHV-1 and 5. In view of that, in the first chapter, the carboxy-terminal region of gC was the target for the development of a Polymerase Chain Reaction followed by a Restriction Enzyme Analysis (PCR/REA) for differentiation between BoHV-1 and 5. The PCR/REA was designed to amplify a segment on the carboxy-terminal portion of the glycoprotein C (gC) gene, giving rise to amplicons of 575 base pairs (bp) for BoHV- 1, and 572 bp for BoHV-5. The amplicons were digested with the Bgl I for differentiation between BoHV-1 and 5. In the second chapter the region previously described of 23 South American isolates of BoHV-1 and BoHV-5 were amplified and sequenced. Nucleotide sequence alignments revealed identity ranged from 98,7 to 99,8% (BoHV-1/ BoHV-1), 88,3 to 92% (BoHV-1/ BoHV-5) and 96 to 99,7% (BoHV-5/ BoHV-5). The identity deduced from amino acid sequences ranged from 97,5 to 99,5% (BoHV-1/ BoHV-1), 77,5 to 84,4% (BoHV-1/ BoHV-5) and 92,1 to 99,5% (BoHV-5/ BoHV- 5) . Phylogenetic analyses and deduced amino acid sequences revealed that: i) some BoHV-5 isolates seem to be “non a non b” subtype and ii) there is a Uruguayan BoHV-1.2 strain that has a distinct nucleotide and amino acid sequence when compared to others BoHV-1.2 strains. The third chapter of the present work contains the first report of a BoHV-5 strain isolated from the bovine semen by antigenic characterization, differential amplification of the N-terminal region of gC gene from BoHV-1 and 5 followed by genomic characterization by REA and antigenic characterization of the isolate analyzed.