A bovinocultura é um dos destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial, uma vez que o País tem o maior rebanho bovino comercial do mundo e é o maior exportador de carne bovina. Para manter e melhorar a competitividade no mercado internacional é fundamental o monitoramento da sanidade animal e a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes, especialmente em relação às doenças virais que causam grande impacto na produtividade. As infecções em bovinos causadas por pestivírus resultam em grandes perdas econômicas em todo mundo. Estas podem variar de subclínicas até fatais e pode envolver sinais clínicos respiratórios, reprodutivos e digestivos. As espécies virais pertencentes à família Flaviviridae, gênero Pestivirus, que causam estas infecções são: vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), BVDV tipo 2 (BVDV-2) e vírus da doença da fronteira (BDV), além de um pestivírus atípico, o vírus Hobi-like. O objetivo deste trabalho foi caracterizar filogeneticamente isolados de pestivírus detectados no Brasil entre 1995 e 2014. Para isso, 89 isolados de pestivírus foram amplificadas por RT-PCR, sequenciadas e analisadas filogeneticamente em três regiões genômicas, região 5’ não traduzida (5’UTR), autoprotease N terminal (Npro) e glicoproteína 2 (E2). Estes isolados eram provenientes de amostras biológicas de bovinos, soro fetal bovino e de cultivos celulares contaminados, de seis estados brasileiros (PB, PR, MS, MT, RS, SC). No total, 53,9% das sequências foram identificadas como BVDV-1, 33,7% como BVDV-2 e 12,3% como vírus Hobi-like. Os subgenótipos predominantes foram BVDV-1a (35,9%) e BVDV-2b (31,4%), porém, BVDV-1b (10,1%), 1d (6,7%), 2c (2,2%) e 1e (1,1%) também foram identificados. O BVDV-1e e 2c foram descritos pela primeira vez no Brasil. Estes resultados poderão contribuir para o desenvolvimento de vacinas e testes de diagnósticos mais eficazes, visando futuros programas de controle e erradicação destes vírus no País. / The livestock is one of the highlights of Brazilian agribusiness in the world scenario. Since Brazil has the world’s largest commercial cattle population and is the largest beef exporter. To maintain and improve the competitiveness in the international market, is essential to monitor the animal health and the application of appropriate and efficient disease control programs, especially in relation to viral diseases, which cause major impact on productivity. Infection caused by pestiviruses in cattle results in great economic losses worldwide. It can vary from subclinical to fatal, and may involve respiratory, reproductive and digestive clinical signs. The viral species belongs to the family Flaviviridae, genus Pestivirus, that are the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV type 2 (BVDV-2) and border disease virus (BDV), and one atypical pestivirus, the Hobi-like virus. The aim of this study was to phylogenetically characterize pestiviruses detected in Brazil between 1995 and 2014. For this, 89 pestivirus isolates were amplified by RT-PCR, sequencing and phylogenetically analyzed in three genomic regions, 5’ untranslated region (5’UTR), N terminal autoprotease (Npro) and envelope glycoprotein 2 (E2). These isolates were from biological samples of cattle, fetal bovine serum and contaminated cell cultures from six Brazilian Federal States (PB, PR, MS, MT, RS, SC). In total, 53.9% sequences were identified as BVDV-1, 33.7% as BVDV-2 and 12.3% as Hobi-like viruses. The predominant subgenotypes were BVDV-1a (35.9%) and BVDV-2b (31.4%). Furthermore, BVDV-1b (10.1%), 1d (6.7%), 2c (2.2%) and 1e (1.1%) were also identified. The BVDV-1e and 2c were described for the first time in Brazil. These results will contribute for the development of more efficient vaccines and diagnostic tests, aiming future pestivirus control and eradication programs in Brazil.

A síndrome da má absorção (SMA), caracterizada pelo mau desenvolvimento e desuniformidade do lote de aves, causa importantes prejuízos econômicos à avicultura comercial. No entanto, por se tratar de uma doença multifatorial e possivelmente polimicrobiana, o envolvimento do parvovírus de galinha (ChPV) na ocorrência da SMA ainda é pouco conhecido. Com o propósito de elucidar a possível associação entre a presença do ChPV e a ocorrência da SMA, foram desenvolvidas e aplicadas ferramentas moleculares para a detecção e quantificação do ChPV em amostras de frangos comerciais no Estado do Rio Grande do Sul. Uma PCR quantitativa foi desenvolvida para detectar e quantificar cópias do genoma (CG) do ChPV em amostras de suabes de cloaca de 59 frangos saudáveis e 68 frangos com sinais clínicos sugestivos de SMA. Os resultados revelaram que todas as amostras dos dois grupos investigados, continham o genoma do ChPV. No entanto, a carga viral em frangos com SMA foi significativamente (p≤0,0001) maior (1x105 CG/100 ng DNA) do que em frangos saudáveis (1,3x103 CG/100 ng DNA). Adicionalmente às amostras de cloaca, o ChPV também foi investigado em amostras de tecidos (fígado, timo, baço, bursa de Fabricius - BF e intestino) e soros provenientes de nove frangos saudáveis e 50 frangos com sinais indicativos da SMA. O ChPV foi encontrado tanto em aves saudáveis como nas aves com SMA, no entanto, observou-se uma diferença na distribuição deste agente nos tecidos analisados. O genoma do vírus foi mais frequentemente detectado na BF, baço e intestino das aves com SMA, sendo que o intestino foi o tecido que apresentou maior carga viral. Os resultados encontrados nestes estudos demonstraram que o genoma viral estava altamente disseminado nas aves investigadas. Além disso, observou-se uma maior carga viral em frangos de corte com SMA quando comparado com aves sadias. Com base nos resultados encontrados, sugere-se que a maior carga viral de ChPV existente em aves com SMA, em relação a aves saudáveis, seja um dos fatores que favoreça a ocorrência da síndrome. / The malabsorption syndrome (MAS), characterized by the poor development and lack of uniformity of chicken flocks, causes significant economic losses to commercial poultry. However, because it is a multifactorial and possibly polymicrobial disease, the involvement of Chicken parvovirus (ChPV) in the MAS occurrence is still not clear. In order to elucidate the possible association between the presence of ChPV and the occurrence of MAS, molecular tools were developed and applied for the detection and quantification of ChPV DNA in commercial poultry samples in the state of Rio Grande do Sul. A quantitative PCR was developed to detect and quantify the ChPV genome copies (GC) in cloacal swab samples of 59 healthy broilers and 68 broilers with clinical signs suggestive of MAS. The results showed that all investigated samples of the two groups contained the genome ChPV. However, viral loads in MAS-affected animals were significantly (p≤0.0001) higher (1x105 GC/100 ng DNA) than in healthy broilers (1.3x103 GC/100 ng DNA). In addition to the cloacal samples, the presence of ChPV DNA was also investigated in tissue samples (liver, thymus, spleen, bursa of Fabricius - BF and intestine) and sera from nine healthy broilers and 50 broilers with signals indicative of MAS. The ChPV was found in healthy avian as well MAS-affected, however, there was a difference in the distribution of this agent in those tissues. The virus genome was more frequently detected in the BF, spleen and intestines of the MAS-affected broilers, and the intestines contained the highest viral loads, in comparison with other tissues. Our results demonstrated that the viral genome can be found in both healthy and MAS-affected broilers. In addition, higher viral loads were detected in broilers with signs suggestive of MAS compared to healthy birds. Based on these results, it is suggested that the greatest viral load of ChPV existing in MAS-affected broilers when compared to healthy birds, is one of the factors that favor the occurrence of the syndrome.

Objetivando aferir uma possível relação entre a contaminação de fontes aquáticas com o manejo de animais, o presente estudo buscou detectar a presença de rotavírus em amostras de fezes bovinas e águas coletadas nos municípios de Rolante, Riozinho e Taquara, no Rio Grande do Sul. Nestas localidades, pertencentes ao Vale do Paranhana, foram coletadas 104 amostras de água de diferentes origens, incluindo água de torneira, açude, poço cavado, poço artesiano, arroio, rio e vertente. As coletas de água foram realizadas nas proximidades das propriedades rurais e nas mesmas. Além disso, foram coletadas 38 amostras de fezes bovinas em propriedades de gado de leite. As amostras de água foram submetidas a um processo de concentração de partículas virais e o RNA foi extraído seguindo metodologia padronizada. Para detecção de RNA genômico, foi empregada a reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tendo como alvo o gene mais conservado dos rotavírus, codificante da proteína VP6. Para avaliar a presença de vírus infeccioso, as amostras foram inoculadas em células MA-104, HEp-2 e CRIB. Das amostras de água, 25 (24%) continham genoma de rotavírus, sendo 8,6% amostras do município de Rolante, 4,8% de Riozinho e 10,6% amostras coletadas em Taquara. Estas 25 amostras contendo genoma viral foram subsequentemente submetidas ao isolamento em cultivos celulares, em nenhuma delas foi observado efeito citopático característico de rotavírus (CPE). A extração de RNA desses cultivos, após três passagens consecutivas, não revelou a presença de genoma viral. Em relação às amostras de fezes examinadas, em nenhuma delas foi detectada a presença de genoma de rotavírus. Conclui-se que o isolamento, como empregado no presente estudo, não teve sensibilidade suficiente para viabilizar seu uso como técnica para identificar rotavírus como contaminante de águas. Vinte e quatro por cento das amostras de água continham rotavírus, mas sua origem ainda deve ser determinada. / The aim of present study was to assess a possible relationship between the contamination of water sources with animal husbandry in the region. In the localities belonging to Paranhana valley, the municipalities of Taquara, Rolante e Riozinho, were collected 104 water samples from different sources including tap water, ponds, dug wells, boreholes, streams, river and slopes. The water samplings were conducted in the vicinity of farms and on them. In addition, 38 fecal samples were collected from cattle dung from animals on propertie of dairy in Taquara.Water samples were subjected to a process of viral particles concentration and RNA extraction following standard methodology. For genomic RNA detection, were used reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (RT-PCR) targeting the most conserved gene of rotaviruses, gene encoded the viral protein 6 (VP6).To evaluate the presence of infective viruses samples were inoculated on MA-104 cells, HEp-2 and CRIB. Of all water samples, 25 (24%) contained genome of rotavirus, 8,66% samples from Rolante, 4,81% samples from Riozinho and 10, 59 samples collected on Taquara. The 25 samples containing viral genome which all were subsequently subjected to isolation in cultured cells, none were observed cytopathic effect typical of rotavirus (CPE). RNA extraction of these inoculations after three consecutive passages did not reveal the presence of rotavirus genomes. Regarding the stool samples, none were detected presence of rotavirus genome. Viral isolation, as used in this study did not have sufficient sensitivity to enable its use as a technique for rotavirus identification as water contamination.

Trata da modelagem teórica de um experimento que simula in vitro a evolução da aptidão (fitness) de uma população de virus. / We consider a nonlinear partial differential equation of conservation type to describe the dy- namics of vesicular stomatitis virus observed in aliquots of fixed particle number taken from an evolving clone at periodic intervals of time [5]. The changes in time behavior of fitness function noticed in experimental data are related to a crossover exhibited by the solutions to this equation in the transient regime for pulse-like initial conditions. As a consequence, the average replication rate of the population is predicted to reach a plateau as a power t1/ 2

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / MolÃculas bioativas extraÃdas a partir de algas marinhas, tais como os polissacarÃdeos sulfatados,vÃm se destacando como possuidores de diversas atividades biolÃgicas. Este estudo teve como objetivo avaliar as atividades antiviral e anti-inflamatÃria de uma fraÃÃo polissacarÃdica sulfatada da alga marinha Gracilaria birdiae. Os polissacarÃdeos sulfatados totais (PST) foram extraÃdos por digestÃo enzimÃtica e em seguida, fracionados em coluna de DEAE-celulose, originando duas fraÃÃes (FI- 0,5 M e FII- 0,75 M). A fraÃÃo FI, de maior rendimento, foi objeto de estudo, sendo identificada como uma agarana por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) e de elevada massa molecular (>100 KDa) por cromatografia de permeaÃÃo em gel. A viabilidade celular da fraÃÃo FI foi determinada por alteraÃÃo da morfologia celular com posterior quantificaÃÃo a 492 nm. As cÃlulas foram tratadas com diluiÃÃes seriadas de FI (1000 a 7,8 μg/mL) e em seguida, incorporado o corante vermelho neutro, com posterior leitura de absorbÃncia. O grau de atividade antiviral foi expresso como percentagem de inibiÃÃo viral. Os resultados mostraram que FI na concentraÃÃo de 250 μg/mL nÃo apresentou toxicidade em cÃlulas C6/36, Vero e HEp-2 e apresentou um efeito antiviral significativo com inibiÃÃo de 95,8% contra o HSV-1, de 94,4 % contra o HSV-2 em cÃlulas Vero e de 89,2 % contra DENV-1 em cÃlulas C6/36, quando comparado ao grupo controle. Em adiÃÃo, FI (10 mg/kg) apresentou efeito anti-inflamatÃrio quando administrada por via subcutÃnea (s.c.) em ratos Wistar no modelo de peritonite utilizando carragenina como agente flogÃstico ou no edema de pata induzido por carragenina ou dextrana. FI (10 mg/kg) provocou um efeito anti-inflamatÃrio por uma diminuiÃÃo no nÃmero de leucÃcitos na cavidade peritoneal, alÃm de tambÃm reduzir o edema de pata induzido por carragenina na terceira hora, comprovado pela quantificaÃÃo da mieloperoxidase e tambÃm o edema por dextrana nos primeiros trinta minutos. Para analisar o envolvimento da via heme oxigenase na atividade anti-inflamatÃria de FI, os animais foram prÃ-tratados por via s.c. com um inibidor especÃfico do grupo heme (zinco rotoporfirina IX). Depois de inibida por ZnPP IX, o efeito anti-inflamatÃrio de FI no edema de pata induzido por carragenina nÃo foi observado. Para avaliar os efeitos sistÃmicos, FI (10 mg/kg) foi administrada por via intraperitoneal em camundongos em dose Ãnica. As alteraÃÃes sistÃmicas foram avaliadas durante 48 h ou por dose repetida, uma vez ao dia durante 14 dias, sendo que FI (10 mg/kg) nÃo causou mortalidade ou alteraÃÃes significativas nos parÃmetros bioquÃmicos, hematolÃgicos e histolÃgicos, sendo considerada segura na dose testada. / Bioactive molecules extracted from seaweed, such as sulfated polysaccharides, have been highlighted as having diverse biological activities. This study aimed to evaluate the antiviral activity and anti-inflammatory effect of a sulfated polysaccharide from seaweed Gracilaria birdiae. Total sulfated polysaccharides (TSP) were extracted by enzimatic digestion and following fractioned on DEAE-cellulose column, obtaining two fractions (FI - 0.5 M and FII - 0.75 M). The FI fraction, which had the highest yield, was object of this study, has been identified as an agar by IR spectroscopy (FT-IR) and with a high molecular weight (>100KDa) by gel permation cromatography. The cell viability of FI fraction was determined by the change of the cell morphology with further quantification at 492 nm. Cells were treated with serial dilutions of FI (1000 to 7.8 μg/mL) and then, neutral red dye was incorporated, with subsequent measurement of absorbance. The degree of antiviral activity was expressed as percent inhibition of the virus. The results showed that FI at a concentration of 250 μg/mL showed no toxicity on C6/36, Vero and HEp-2 cells and had a significant antiviral effect with inhibition of 95.8% against HSV-1, 94.4% against HSV-2 on Vero cells and 89.2% against DENV-1 on C6/36 cells, when compared to the control group. In addition, FI (10 mg /kg) presented anti-inflammatory effect when administered by subcutaneous route (s.c.) in Wistar rats in a model of peritonitis using carrageenan with a flogistic agent or in the paw edema using carrageenan or dextran. FI (10 mg/kg) induced an anti-inflammatory effect by a decrease in the leukocytes into the peritoneal cavity. FI also reduced the paw edema induced by carrageenan in the third hour comproved by the mieloperoxidase quantification and also inhibited the paw edema induced by dextran on the first thirty minutes. To analyze the involvement of the heme oxygenase pathway on antiinflammatory activity of FI, animals were pretreated by s.c. route with an specific inhibitor of heme group (zinc protoporphyrin IX). After inhibition by ZnPP IX, the anti-inflammatory effect of FI on carrageenan-induced paw edema has not been observed. To evaluate the systemic effects, FI (10 mg/kg) was administered by intraperitoneal route in mice in a single dose. The systemic changes were evaluated during 48 h or by repeated dose, once a day for 14 days. The results showed that, FI (10 mg/kg) did not cause mortality or significant changes in the biochemical, hematological and histopathological parameters, considered safe in the tested dose.

Esta tese compreende estudos sobre diagnóstico, caracterização antigênica e molecular de amostras do vírus da raiva e sobre o desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o vírus rábico. O primeiro capítulo descreve dois casos de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro trabalho do primeiro capítulo descreve a ocorrência de raiva em um canino no município de Tapes, leste do RS. Após a confirmação do diagnóstico, a amostra de vírus isolada foi submetida à caracterização antigênica e molecular. Tal amostra apresentava características compatíveis com amostras de vírus rábico isoladas de morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis. Portanto, o primeiro caso de raiva canina no RS após 19 anos, ocorreu devido a um contato incidental entre um morcego não hematófago e o canino infectado. Assim, o status de região livre de raiva urbana pode ser mantido no Estado. O segundo trabalho do primeiro capítulo descreve a primeira ocorrência no RS de raiva em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus. Neste caso, a amostra isolada apresentou características de amostras isoladas de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A identificação de vírus rábico em um morcego frugívoro, com tal perfil, não representa fato novo na história recente da raiva, mas a descrição deste caso ilustra que a raiva em morcegos frugívoros no RS apresenta características semelhantes à raiva em morcegos frugívoros de outras regiões do Brasil e sugere que o mesmo foi contaminado devido ao contato com morcegos hematófagos. Com o objetivo de permitir o monitoramento sorológico da raiva em morcegos e a identificar novos potenciais reservatórios do vírus, no segundo capítulo desta tese é reportado o desenvolvimento de dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra raiva. O primeiro teste desenvolvido é a inibição da imunoperoxidase (“immunoperoxidase inhibition assay”; IIA), que foi testada frente a 422 amostras de soros humanos. A IIA foi muito eficiente, tendo demonstrado uma acurácia de 97.63%. Esta técnica provavelmente poderá ser utilizada para detecção de anticorpos contra raiva em outras espécies, embora no presente estudo tenha sido avaliada apenas com soros humanos. Com o objetivo de pesquisar anticorpos contra raiva em diferentes espécies animais utilizando pequenos volumes de soro foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático do tipo “sandwich” (“sandwich enzyme linked immunosorbent assay”; S-ELISA). O S-ELISA foi inicialmente comparado com um teste padrão FAVN (Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test) e a seguir empregado na pesquisa de anticorpos em soros de diferentes espécies, incluindo morcegos, sagüis, raposas, felinos silvestres, guaxinis, quatis, bovinos, camundongos e humanos. Os resultados mostraram que o S-ELISA foi eficiente na detecção de anticorpos contra o vírus da raiva em diferentes espécies, com uma acurácia de 87,5%. A caracterização de amostras de vírus rábico em situações epidemiológicas específicas, assim como o desenvolvimento de testes sorológicos a fim de identificar anticorpos em distintas espécies e identificar novos possíveis reservatórios para raiva, contribuirão para o maior conhecimento da biologia da raiva na natureza, particularmente em nosso Estado, possibilitando assim a tomada de medidas de controle mais adequadas. / This thesis describes studies about diagnosis, antigenic and molecular characterization of rabies vírus strains and about serological assays development for antibodies against rabies virus detection. The first chapter describes two cases of rabies in State of Rio Grande do Sul (RS). This first work of the first chapter on this thesis, describes the canine rabies in Municipality of Tapes, east of RS. After the diagnosis confirmation, the rabies virus strain was submitted to antigenic and molecular characterization. The sample shown similar characteritics with rabies vírus isolates from insectivorous bats Tadarida brasiliensis. Thus, the first canine rabies in RS after 19 years occurred by an incidental contact between the contamined canine and a non-haematophagous bat. In view of that, the status of urban rabies free of the area should not be compromised. The second work of first chapter describes the first occurrence in RS of rabies in frugivorous bats Artibeus lituratus. In this case, the isolated sample shown characteristics similar to characteristics from haematophagous bats Desmodus rotundus. The rabies virus identification in a frugivorous bat with this profile, does not represent a new fact in the recent history of rabies, but the description of this case illustrates that the rabies in frugivorous bats in RS has similar characteristics to rabies in frugivorous bats in other regions of Brazil and suggests that it was contamined due to contact with haematophagous bats. With the purpose to allow the serological monitoring of rabies in bats and identify new potential reservoirs of the virus, in the second chapter of this thesis is reported the development of two serological tests for detection of antibodies against rabies. The first developed assay is the immunoperoxidase inhibition assay (IIA), that was tested with 422 sera from humans. The IIA was very efficient, with 97.63% of accuracy. This assay probably can be used to antibodies detection against rabies in other species, in despite of the present study, it was tested only with sera from humans. With the aim to research rabies antibodies in different animal species with small volume of serum, was developed the sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA). The S-ELISA was initially compared with the gold standard test Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test and after used to search antibodies in sera from different species including bats, marmosets, foxes, wild felines, raccoons, coatis, bovines, mices and humans. The S-ELISA was efficient to detect antibodies in different species with 87.5% of accuracy. The characterization of rabies virus strains in specific epidemiological situations as well as the serological assays development to identify antibodies in distinct species and identify new potential rabies reservoirs for rabies, contribute to greater understanding of the biology of rabies in nature, particularly in our State, allowing the taking of appropriate control measures.

A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

A síndrome da má absorção (SMA), caracterizada pelo mau desenvolvimento e desuniformidade do lote de aves, causa importantes prejuízos econômicos à avicultura comercial. No entanto, por se tratar de uma doença multifatorial e possivelmente polimicrobiana, o envolvimento do parvovírus de galinha (ChPV) na ocorrência da SMA ainda é pouco conhecido. Com o propósito de elucidar a possível associação entre a presença do ChPV e a ocorrência da SMA, foram desenvolvidas e aplicadas ferramentas moleculares para a detecção e quantificação do ChPV em amostras de frangos comerciais no Estado do Rio Grande do Sul. Uma PCR quantitativa foi desenvolvida para detectar e quantificar cópias do genoma (CG) do ChPV em amostras de suabes de cloaca de 59 frangos saudáveis e 68 frangos com sinais clínicos sugestivos de SMA. Os resultados revelaram que todas as amostras dos dois grupos investigados, continham o genoma do ChPV. No entanto, a carga viral em frangos com SMA foi significativamente (p≤0,0001) maior (1x105 CG/100 ng DNA) do que em frangos saudáveis (1,3x103 CG/100 ng DNA). Adicionalmente às amostras de cloaca, o ChPV também foi investigado em amostras de tecidos (fígado, timo, baço, bursa de Fabricius - BF e intestino) e soros provenientes de nove frangos saudáveis e 50 frangos com sinais indicativos da SMA. O ChPV foi encontrado tanto em aves saudáveis como nas aves com SMA, no entanto, observou-se uma diferença na distribuição deste agente nos tecidos analisados. O genoma do vírus foi mais frequentemente detectado na BF, baço e intestino das aves com SMA, sendo que o intestino foi o tecido que apresentou maior carga viral. Os resultados encontrados nestes estudos demonstraram que o genoma viral estava altamente disseminado nas aves investigadas. Além disso, observou-se uma maior carga viral em frangos de corte com SMA quando comparado com aves sadias. Com base nos resultados encontrados, sugere-se que a maior carga viral de ChPV existente em aves com SMA, em relação a aves saudáveis, seja um dos fatores que favoreça a ocorrência da síndrome. / The malabsorption syndrome (MAS), characterized by the poor development and lack of uniformity of chicken flocks, causes significant economic losses to commercial poultry. However, because it is a multifactorial and possibly polymicrobial disease, the involvement of Chicken parvovirus (ChPV) in the MAS occurrence is still not clear. In order to elucidate the possible association between the presence of ChPV and the occurrence of MAS, molecular tools were developed and applied for the detection and quantification of ChPV DNA in commercial poultry samples in the state of Rio Grande do Sul. A quantitative PCR was developed to detect and quantify the ChPV genome copies (GC) in cloacal swab samples of 59 healthy broilers and 68 broilers with clinical signs suggestive of MAS. The results showed that all investigated samples of the two groups contained the genome ChPV. However, viral loads in MAS-affected animals were significantly (p≤0.0001) higher (1x105 GC/100 ng DNA) than in healthy broilers (1.3x103 GC/100 ng DNA). In addition to the cloacal samples, the presence of ChPV DNA was also investigated in tissue samples (liver, thymus, spleen, bursa of Fabricius - BF and intestine) and sera from nine healthy broilers and 50 broilers with signals indicative of MAS. The ChPV was found in healthy avian as well MAS-affected, however, there was a difference in the distribution of this agent in those tissues. The virus genome was more frequently detected in the BF, spleen and intestines of the MAS-affected broilers, and the intestines contained the highest viral loads, in comparison with other tissues. Our results demonstrated that the viral genome can be found in both healthy and MAS-affected broilers. In addition, higher viral loads were detected in broilers with signs suggestive of MAS compared to healthy birds. Based on these results, it is suggested that the greatest viral load of ChPV existing in MAS-affected broilers when compared to healthy birds, is one of the factors that favor the occurrence of the syndrome.

Os vírus entéricos causam infecções que podem ocasionar uma alta morbidade e mortalidade em cães. A diarreia se destaca como o principal sinal clínico e a subsequente desidratação pode causar a morte do animal. O Carnivore protoparvovirus 1 (CPV-2), Canine mastadenovirus A tipo 1 (CAdV-1), o Canine coronavirus (CCoV), o Canine rotavirus (CRV) e o Canine distemper virus (CDV) são considerados os principais agentes que causam gastroenterite viral aguda em cães jovens. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença destas cinco espécies virais na população de cães do Brasil. Para isto, foram coletados 325 suabes retais de cães com ou sem diarreia, jovens (> 6 meses) e adultos (< 6 meses), com ou sem histórico de vacinação e de diversas regiões do Brasil. As amostras foram analisadas através da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR) utilizando iniciadores específicos para cada um dos agentes virais. Resultaram 81% (264/325) das amostras positivas para um destes vírus, das quais 30,7% (100/325) foram positivas para o CPV-2, 25,5% (83/325) para o CDV, 17,2% (56/325) para o CCoV, 4,6% (15/325) para o CRV e 2,7% (9/ 325) para o CAdV-1. Algumas amostras apresentaram co-infecções, sendo que as espécies mais predominantemente encontradas em co-infecções foram o CDV e CPV-2 em 15,4% (50/325) e 15,0% (49/325), respectivamente, seguidos do CCoV em 10,1% (33/325,), CRV em 3,0% (10/325) e CAdV-1 em 1,5% (5/325) das amostras. A associação viral mais observada foi CDV e CPV-2 em 31/325 (9,5%) amostras positivas para ambos os vírus. Em conclusão, os resultados demonstram que CPV-2, CDV e CCoV são os principais vírus entéricos patogênicos que circularam no Brasil entre os anos de 2008 e 2014, infectando mais frequentemente animais jovens. / Enteric viruses cause infections that lead to high morbidity and mortality. Diarrhea is the main clinical sign, whose subsequent dehydration can cause death of the animal. Carnivore protoparvovirus 1 (CPV-2), Canine mastadenovirus A (CAdV-1), Canine coronavirus (CCoV), Canine rotavirus (CRV) and Canine distemper virus (CDV) are considered the main agents that cause acute viral gastroenteritis in young dogs. The aim of this study was the detection of these five viral species in dogs from Brazil. Rectal swabs from 325 dogs, puppies (< six months old), adult dogs (> 6 months old), with or without a history of vaccination, were collected from various regions of the country. The samples were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) or reverse transcription following followed by PCR (RT-PCR) using oligonucleotides specific for each one of this virus. As result, 81% (264/325) of the samples were observed to be positive for at least one virus, 30,7% (100/325) were positive for CPV-2, 25,5% (83/325) for CDV, 17,2% (56/325) for CCoV, 4,6% (14/325) for CRV and 2,7% (9/325) for CAdV-1. Some samples showed co-infection, where the species most predominantly found were CDV and CPV-2 with 15,4% (50/325) and 15,0% (49/325), respectively, followed by CCoV with 10,1% (33/325,), CRV with 3,0% (10/325) and CAdV-1 1,5% (5/325). The most observed viral association was CDV and CPV-2, with 31/325 (9,5%) positive samples for both viruses. In conclusion, the results showed that CPV-2, CDV and CCoV are the main pathogenic enteric viruses that circulated in Brazil between the years 2008 and 2014, infecting more frequently puppies.