Objetivando aferir uma possível relação entre a contaminação de fontes aquáticas com o manejo de animais, o presente estudo buscou detectar a presença de rotavírus em amostras de fezes bovinas e águas coletadas nos municípios de Rolante, Riozinho e Taquara, no Rio Grande do Sul. Nestas localidades, pertencentes ao Vale do Paranhana, foram coletadas 104 amostras de água de diferentes origens, incluindo água de torneira, açude, poço cavado, poço artesiano, arroio, rio e vertente. As coletas de água foram realizadas nas proximidades das propriedades rurais e nas mesmas. Além disso, foram coletadas 38 amostras de fezes bovinas em propriedades de gado de leite. As amostras de água foram submetidas a um processo de concentração de partículas virais e o RNA foi extraído seguindo metodologia padronizada. Para detecção de RNA genômico, foi empregada a reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tendo como alvo o gene mais conservado dos rotavírus, codificante da proteína VP6. Para avaliar a presença de vírus infeccioso, as amostras foram inoculadas em células MA-104, HEp-2 e CRIB. Das amostras de água, 25 (24%) continham genoma de rotavírus, sendo 8,6% amostras do município de Rolante, 4,8% de Riozinho e 10,6% amostras coletadas em Taquara. Estas 25 amostras contendo genoma viral foram subsequentemente submetidas ao isolamento em cultivos celulares, em nenhuma delas foi observado efeito citopático característico de rotavírus (CPE). A extração de RNA desses cultivos, após três passagens consecutivas, não revelou a presença de genoma viral. Em relação às amostras de fezes examinadas, em nenhuma delas foi detectada a presença de genoma de rotavírus. Conclui-se que o isolamento, como empregado no presente estudo, não teve sensibilidade suficiente para viabilizar seu uso como técnica para identificar rotavírus como contaminante de águas. Vinte e quatro por cento das amostras de água continham rotavírus, mas sua origem ainda deve ser determinada. / The aim of present study was to assess a possible relationship between the contamination of water sources with animal husbandry in the region. In the localities belonging to Paranhana valley, the municipalities of Taquara, Rolante e Riozinho, were collected 104 water samples from different sources including tap water, ponds, dug wells, boreholes, streams, river and slopes. The water samplings were conducted in the vicinity of farms and on them. In addition, 38 fecal samples were collected from cattle dung from animals on propertie of dairy in Taquara.Water samples were subjected to a process of viral particles concentration and RNA extraction following standard methodology. For genomic RNA detection, were used reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (RT-PCR) targeting the most conserved gene of rotaviruses, gene encoded the viral protein 6 (VP6).To evaluate the presence of infective viruses samples were inoculated on MA-104 cells, HEp-2 and CRIB. Of all water samples, 25 (24%) contained genome of rotavirus, 8,66% samples from Rolante, 4,81% samples from Riozinho and 10, 59 samples collected on Taquara. The 25 samples containing viral genome which all were subsequently subjected to isolation in cultured cells, none were observed cytopathic effect typical of rotavirus (CPE). RNA extraction of these inoculations after three consecutive passages did not reveal the presence of rotavirus genomes. Regarding the stool samples, none were detected presence of rotavirus genome. Viral isolation, as used in this study did not have sufficient sensitivity to enable its use as a technique for rotavirus identification as water contamination.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O vírus da cinomose canina (CDV) é classificado no gênero Morbillivirus da família Paramyxoviridae e é o agente etiológico de uma das mais importantes doenças virais de canídeos domésticos. A cinomose ocorre em todo o mundo e produz alta mortalidade em populações imunologicamente naïve. Apesar de encontrar-se bem controlada pela vacinação, casos de cinomose ocorrem esporadicamente tanto em cães vacinados quanto em não vacinados. Uma das causas suspeitas desta falha vacinal é a grande variabilidade genética entre cepas de CDV. O objetivo deste trabalho foi detectar e analisar a variabilidade genética do CDV circulante no País. Foram coletados 386 suabes retais de cães em diversas regiões do Brasil, dos quais se detectaram 155 positivos através de uma RT-nested-PCR de um fragmento do gene do nucleocapsídeo. Destes, 23 foram selecionados para amplificação parcial do gene da hemaglutinina, sequenciamento e análise filogenética. A grande maioria das sequências obtidas agrupou no genótipo América do Sul-I, que inclui isolados da Argentina e do Uruguai, com exceção de uma amostra similar à cepa vacinal Rockborn. A análise filogenética sugere a presença de pelo menos sete subgenótipos do genótipo América do Sul-I circulando neste continente. O grupo América do Sul-II é formado somente por isolados da Argentina. Além disso, propõe-se que este grupo e os clados Rockborn-like e Europa Selvagem sejam denominados subgenótipos dentro de um genótipo único. / Canine distemper virus (CDV) is classified in the genus Morbillivirus within the family Paramyxoviridae and is the etiologic agent of one of the most important viral diseases of domestic Canidea. It occurs worldwide and produces high mortality in immunologically naïve populations. Despite being well controlled by vaccination, cases of canine distemper occur sporadically in vaccinated and unvaccinated dogs. One of the suspected causes of this vaccine failure is the great genetic variability between strains of CDV. The objective of this study was to detect and analyze the genetic variability of CDV circulating in our country. Rectal swabs were collected from 386 dogs in various regions of Brazil, of which 155 were found positive by a nested RT-PCR of a fragment of the nucleocapsid gene. Of these, 23 were selected for partial amplification of the hemagglutinin gene, sequencing and phylogenetic analysis. The vast majority of sequences obtained grouped in genotype South America-I, which includes isolates from Argentina and Uruguay, with the exception of a sample similar to the vaccine strain Rockborn. Phylogenetic analysis suggests the presence of at least seven subgenotypes belonging to South America-I genotype, circulating in this continent. The group South America-II consists only of isolates from Argentina. Furthermore, it is proposed that this group and clades Rockborn-like and Europe Wildlife are denominated subgenotypes within a single genotype.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango. Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP) em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório, um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP. / Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains (GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the glycoprotein E.

A bovinocultura é um dos destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial, uma vez que o País tem o maior rebanho bovino comercial do mundo e é o maior exportador de carne bovina. Para manter e melhorar a competitividade no mercado internacional é fundamental o monitoramento da sanidade animal e a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes, especialmente em relação às doenças virais que causam grande impacto na produtividade. As infecções em bovinos causadas por pestivírus resultam em grandes perdas econômicas em todo mundo. Estas podem variar de subclínicas até fatais e pode envolver sinais clínicos respiratórios, reprodutivos e digestivos. As espécies virais pertencentes à família Flaviviridae, gênero Pestivirus, que causam estas infecções são: vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), BVDV tipo 2 (BVDV-2) e vírus da doença da fronteira (BDV), além de um pestivírus atípico, o vírus Hobi-like. O objetivo deste trabalho foi caracterizar filogeneticamente isolados de pestivírus detectados no Brasil entre 1995 e 2014. Para isso, 89 isolados de pestivírus foram amplificadas por RT-PCR, sequenciadas e analisadas filogeneticamente em três regiões genômicas, região 5’ não traduzida (5’UTR), autoprotease N terminal (Npro) e glicoproteína 2 (E2). Estes isolados eram provenientes de amostras biológicas de bovinos, soro fetal bovino e de cultivos celulares contaminados, de seis estados brasileiros (PB, PR, MS, MT, RS, SC). No total, 53,9% das sequências foram identificadas como BVDV-1, 33,7% como BVDV-2 e 12,3% como vírus Hobi-like. Os subgenótipos predominantes foram BVDV-1a (35,9%) e BVDV-2b (31,4%), porém, BVDV-1b (10,1%), 1d (6,7%), 2c (2,2%) e 1e (1,1%) também foram identificados. O BVDV-1e e 2c foram descritos pela primeira vez no Brasil. Estes resultados poderão contribuir para o desenvolvimento de vacinas e testes de diagnósticos mais eficazes, visando futuros programas de controle e erradicação destes vírus no País. / The livestock is one of the highlights of Brazilian agribusiness in the world scenario. Since Brazil has the world’s largest commercial cattle population and is the largest beef exporter. To maintain and improve the competitiveness in the international market, is essential to monitor the animal health and the application of appropriate and efficient disease control programs, especially in relation to viral diseases, which cause major impact on productivity. Infection caused by pestiviruses in cattle results in great economic losses worldwide. It can vary from subclinical to fatal, and may involve respiratory, reproductive and digestive clinical signs. The viral species belongs to the family Flaviviridae, genus Pestivirus, that are the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV type 2 (BVDV-2) and border disease virus (BDV), and one atypical pestivirus, the Hobi-like virus. The aim of this study was to phylogenetically characterize pestiviruses detected in Brazil between 1995 and 2014. For this, 89 pestivirus isolates were amplified by RT-PCR, sequencing and phylogenetically analyzed in three genomic regions, 5’ untranslated region (5’UTR), N terminal autoprotease (Npro) and envelope glycoprotein 2 (E2). These isolates were from biological samples of cattle, fetal bovine serum and contaminated cell cultures from six Brazilian Federal States (PB, PR, MS, MT, RS, SC). In total, 53.9% sequences were identified as BVDV-1, 33.7% as BVDV-2 and 12.3% as Hobi-like viruses. The predominant subgenotypes were BVDV-1a (35.9%) and BVDV-2b (31.4%). Furthermore, BVDV-1b (10.1%), 1d (6.7%), 2c (2.2%) and 1e (1.1%) were also identified. The BVDV-1e and 2c were described for the first time in Brazil. These results will contribute for the development of more efficient vaccines and diagnostic tests, aiming future pestivirus control and eradication programs in Brazil.

Os herpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) e o vírus da diarreia viral bovina (BVDV), são causas importantes de prejuízos sanitários e econômicos na bovinocultura. Estes agentes têm sido eventualmente detectados em búfalos (Bubalus bubalis) embora o papel desses vírus na biologia dessa espécie seja ainda desconhecido. A produção de búfalos vem se desenvolvendo expressivamente no Brasil, onde esses animais são mantidos frequentemente próximos ou associados à criação de bovinos. Como parte inicial de um projeto mais amplo sobre infecções por BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e BVDV em búfalos, o presente estudo objetivou analisar a presença de anticorpos neutralizantes e genomas virais em amostras de soros bubalinos coletados em rebanhos do Estado do Rio Grande do Sul. Foram examinados 339 soros de animais maiores de 12 meses, de ambos os sexos, de diferentes raças e tipo de exploração. Os animais não eram vacinados para quaisquer vírus de interesse na pesquisa e se apresentavam sem alterações clinicamente aparentes na ocasião da coleta. Para a detecção de anticorpos neutralizantes, as amostras de soro foram examinadas através do teste de soroneutralização (SN) frente a diferentes amostras de herpesvírus: BoHV-1.1 (amostra LA) , BoHV-5b (amostra A663) e BuHV-1 (amostra b6). Cento e oito destas amostras foram examinadas adicionalmente frente ao BoHV-1.1 (amostra EVI123/98) e BoHV-1.2a (amostra SV265/96), para permitir uma avaliação da sensibilidade da SN utilizando como vírus de desafio todas as variantes disponíveis de BoHV-1 e BoHV-5. A sensibilidade da SN foi menor quando considerados os resultados obtidos com cada um dos vírus separadamente. Quando os resultados positivos frente a amostra LA, SV265/96 e A663 foram somados, a prova se apresentou mais sensível. Apesar disso, a SN não permitiu a identificação dos vírus que efetivamente haviam infectado os animais, devido ao elevado grau de reatividade cruzada. Para a verificação da circulação de pestivírus, foram realizados testes de SN utilizando a amostra “Oregon C24V” de BVDV-1 como vírus de desafio. Das 176 amostras analisadas, 19 (10,8 %) apresentaram anticorpos neutralizantes reagentes com o vírus utilizado. Paralelamente, para a detecção de genomas de pestivírus, foi desenvolvida uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) capaz de detectar os três tipos conhecidos de BVDV (1, 2 e 3) e otimizada para o exame das amostras de soros bubalinos. Cinco amostras (2,8 %) continham genomas virais, sugerindo a ocorrência de prováveis infecções persistentes nos animais, semelhante ao que ocorre em bovinos. Os resultados obtidos evidenciam a circulação de herpesvírus e pestivírus nas populações bubalinas analisadas. Mais estudos são necessários para definir quais os agentes efetivamente causadores de infecções nesta espécie animal. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 5 (BoHV-5) and bovine viral diarrhoea virus (BVDV) are major causes of sanitary and economic losses in cattle. These agents have been eventually detected in water buffaloes (Bubalus bubalis), although their role in host species biology is unknown. Buffalo production has had significant increase in Brazil, where these animals are often kept close to or in association with cattle. As part of a wider project on infections with BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 and BVDV in buffaloes, the present study aimed to examine the occurrence of neutralizing antibodies in buffaloes serum samples collected in farms from Rio Grande do Sul State. Three hundred and thirty nine serum samples were collected from animals with ages above 12 months, of both genders, of different races and under different management practices. The animals were not vaccinated for any virus studied in the present study and were all clinically healthy at the time of sample collection. For neutralizing antibodies detection, serum samples were tested in serum neutralization (SN) tests against different herpesviruses: BoHV-1.1 (strain LA), BoHV-5b (strain A663) e BuHV-1 (strain b6). One hundred and eight of theses samples were additionally examined with BoHV-1.1 (strain EVI123/98) and BoHV-1.2 (strain SV265/96), to compare SN sensitivity using all available variants of BoHV-1 and BoHV-5 as challenge viruses. The SN sensitivity was lower when results obtained with each virus were considered separately. Sensitivity was maximum when the positive results against strain LA, SV265/96 and A663 were added. Despite this, the SN did not allow the identification of the virus which had actually infected animals, in view of the high degree of antibody cross-reactivity. In order to assess the circulation of pestiviruses, SN tests were carried out using the sample "Oregon C24V" of BVDV-1 as challenge virus. Out of the 176 analyzed samples, 19 (10.8 %) presented neutralizing antibodies to pestivirus. At the same time, for the detection of genomes of pestiviruses, was developed a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) able to detect the three known types of BVDV (1, 2 and 3) and optimized for examining bubaline sera. Five samples (2.8 %) contained viral genomes, suggesting the occurrence of persistent infections in animals, analogous to what occurs in cattle. The results obtained confirm circulation of herpesvírus and pestiviruses in examined buffalo populations. Further studies are needed to define which of these viruses effectively infect this animal species.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) está amplamente disseminado no rebanho bovino brasileiro. Visando aprofundar o conhecimento sobre a patogenicidade para o trato respiratório de amostras dos subtipos deste vírus mais freqüentemente encontrados no Brasil (BHV-1.1 e BHV-1.a), isolados autóctones oriundos de casos de doença respiratória foram inoculados em bovinos suscetíveis. As amostras de ambos os subtipos foram capazes de induzir doença respiratória após inoculação pela via intranasal, em intensidade que variou de moderada a grave, independentemente do subtipo de vírus inoculado. Foi ainda caracterizada a resposta imune humoral induzida por tais amostras quanto ao perfil de classes e subclasses de imunoglobulinas, sendo esta igualmente indistinguível com relação aos vírus inoculados. O perfil de classes de imunoglobulinas apresentadas pelos animais permitiu a determinação do status da infecção nos animais inoculados através da análise da resposta sorológica. Na segunda etapa deste trabalho foram testadas as propriedades vacinais de um vírus recombinante, do qual foi deletada a glicoproteína E (gE; 265gE-), gerado a partir de uma amostra brasileira de BHV-1.2a. Experimentos de inoculação do recombinante 265gE- em animais suscetíveis e o desafio destes animais com a amostra parental virulenta demonstraram a segurança e eficácia desta amostra na prevenção de sinais clínicos da infecção pelo BHV-1. Posteriormente, o recombinante 265gE- foi inoculado em vacas em diferentes estágios da gestação. Não foram observadas quaisquer anormalidades nestas gestações e as 22 vacas vacinadas deram à luz a animais saudáveis. Conclui-se que o recombinante é imunogênico e capaz de conferir significativa proteção frente ao desafio com a amostra parental virulenta do vírus. O recombinante também não causou enfermidade nas vacas inoculadas nem tampouco aos fetos quando inoculado em diferentes estágios da gestação.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-08T12:17:08Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Paulo Gomes de Sousa - 2017.pdf: 1886122 bytes, checksum: 3663c656c9cf7fc3f9f9b7cecfcfc03d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-08T12:17:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Paulo Gomes de Sousa - 2017.pdf: 1886122 bytes, checksum: 3663c656c9cf7fc3f9f9b7cecfcfc03d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-08T12:17:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Paulo Gomes de Sousa - 2017.pdf: 1886122 bytes, checksum: 3663c656c9cf7fc3f9f9b7cecfcfc03d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-11-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The human metapneumovirus, first discovered and described in 2001, has been related to infections in the upper and lower respiratory tract, in all age groups, with severe cases frequently associated with children under five years old, elderlies and immune-compromised people. The present study aims to investigate the occurrence of hMPV in the pediatric population attended in the pediatry referral hospital, in the city of Goiânia - Goiás, evaluating symptomatic and asymptomatic patients. During the period of may/2014 and may/2015 251 nasal swab samples were collected from kids with age up to six years old, with respiratory infection symptoms or asymptomatic. The viral RNA was extracted using the QIAamp cador pathogen mini kit, and the extraction products were submitted to the reverse transcription reaction. The cDNA was submited a nested-PCR using specific primers to the amplification of a conserved region corresponded to the M gene. It was observed a global positivity index for the hMPV of 14.7% (37/251). In the group of children with respiratory infection, the positivity index was 16.6%, however, a significant index was also observed among asymptomatic children (12.3%). Analysis regarding the sample collection period did not show a statistically significant difference, reinforcing literature data that describe the circulation of this pathogen all year long. In Brazil there are few studies regarding the epidemiology of hMPV infections, being this the first report of hMPV occurrence in midwest, contributing to a better understanding of the role played by hMPV in the context of respiratory tract infections. / O Metapneumovírus Humano (hMPV), descoberto e descrito em 2001, vem sendo relacionado a infecções no trato respiratório superior e inferior, em todas as faixas etárias, com quadros graves mais frequentemente associados a crianças menores que cinco anos, idosos e imunocomprometidos. O presente estudo teve como objetivo investigar a ocorrência do hMPV em população pediátrica atendida em hospital de referência pediátrica do município de Goiânia-Goiás, avaliando pacientes sintomáticos e assintomáticos. Para isso, durante o período de maio/2014 a maio/2015 foram coletadas 251 amostras de swab nasal de crianças com idade inferior a seis anos de idade, apresentando quadro de infecção respiratória ou assintomáticas para a mesma. O RNA viral foi extraído utilizando o Kit QIAamp® cador® Pathogen Mini Kit e os produtos de extração foram submetidos à reação de transcrição reversa. A partir do DNA complementar obtido foi realizada uma nested-PCR utilizando iniciadores específicos para amplificação de uma região conservada correspondente ao gene M. Do total de amostras investigadas, foi observado um índice global de positividade para o hMPV de 14,7% (37/251). No grupo de crianças com quadro de infecção respiratória o índice de positividade foi de 16,6%, entretanto índice significativo também foi observado entre crianças assintomáticas (12,3%). Análise em relação ao período de coleta não demonstrou diferença estatisticamente significativa, reforçando dados da literatura que descrevem a circulação deste agente durante todo o ano. No Brasil, existem poucos estudos a respeito da epidemiologia das infecções por hMPV, sendo este o primeiro relato de ocorrência do hMPV na região centro-oeste, contribuindo para uma melhor compreensão do papel deste agente no contexto das infecções do trato respiratório.

Introdução: Os vírus parainfluenza são importante causa de infecções respiratórias. Na população pediátrica a doença característica associada com HPIV-1 e 2 é a laringotraqueobronquite, enquanto que o HPIV-3 está associado com a pneumonia e bronquiolite. Objetivos: Realizar a análise molecular do fragmento do gene da HN. Métodos: Foram analisados aspirados nasofaríngeos coletados entre 1995 a 2005, de crianças com doença respiratória aguda. A detecção dos HPIV 1, 2 e 3 foi realizada por multiplex RT-PCR. Posteriormente, o fragmento de gene HN foi amplificado, sequenciado e, a análise molecular foi realizada. Resultados e discussão: Um total de 6% amostras foram positivas para HPIV, sendo o HPIV-3 o vírus mais prevalente durante todos os anos estudados, o que corresponde a 80% dos casos positivos, seguido por HPIV-1 (15%) e, HPIV-2 (7%). A maioria das mutações observadas foram silênciosas, no entanto, algumas alterações de aminoácidos foram verificadas em áreas conservadas dos HPIV-3 e HPIV-2, e alterações em sítios potencias de N-glicosilação também foram observados. / Introduction: In paediatric population the characteristic illness associated with HPIV-1 and -2 is laryngotracheobronchitis, whereas HPIV-3 is associated with pneumonia and bronchiolitis. There are 5 virus distributed in two distinct genus: Respirovirus (HPIVI-1 and HPIV-3) and Rubulavirus (HPIV-2, HPIVI-4A and HIVI-4B). Objectives: To carry out the molecular analysis of the fragment of the HN gene. Methods: Nasopharyngeal aspirates from infants with acute respiratory illness collected from 1995 to 2005, were analyzed. The detection of HPIV 1, 2 and 3 were performed by multiplex RT-PCR and the fragment of HN gene was amplified, sequenced and, the molecular analysis was carried out. Results and discussion: A total of 6% samples were positive for HPIV. The HPIV-3 was the most prevalent virus during, corresponding to 80% of positive cases, followed by HPIV-1 with 15% and HPIV-2 7%. Most mutations observed were silent in all PIVs, however, some amino acids alterations in conserved areas, verified in PIV-3 and PIV-2, and alterations in N-glicosilation sites were observed.

Apesar dos esforços para controlar a infecção por HIV-1, na América do Sul, diversos recombinantes tem sido descritos, principalmente entre os subtipos B e F. Durante a tarefa coordenada de HIV-1 VGDN, foram encontrados diversos novos recombinantes BF no estado de São Paulo, sendo a maioria deles com a protease F. Técnicas filogenéticas usadas em integrases destes pacientes demonstraram que sequências recombinantes com perfis similares surgiram em diferentes eventos de recombinação. Análises filodinâmicas de amostras argentinas apontaram um crescimento contínuo de recombinantes com proteases F após a introdução da terapia intensiva, enquanto o subtipo B deixou de crescer. Dados estruturais e de interação de proteases F resistentes com o inibidor nelfinavir obtidos por dinâmica molecular sugeriram que polimorfismos do subtipo F podem atuar como restauradores de atividade ou acentuar a perda de afinidade pelo inibidor. Um vetor recombinante pNL4-3 com parte do gene gag e a protease do subtipo F foi construído, permitindo a comparação de seu efeito no fitness viral. / Despite general efforts to control HIV-1 infections, many recombinants have been described among B and F subtype in South America. During the VGDN HIV task in São Paulo state, a large number of new BF recombinants was found, most of which harbor a subtype F protease. Phylogenetic analysis of integrase genes from these patients showed distinct origins for similar recombinant regions. Phylodynamic analysis suggested that after HAART introduction in Argentina BF recombinants with F protease depicted a sustained growth, while subtype B had diminished in growth.. Moreover, structural data from proteases after HAART introduction, while subtype B had diminished growth. Subtype F proteases structure and nelfinavir interaction measured by molecular dynamics suggested that polymorphisms of this subtype may restore enzyme activity or decrease even further inhibitor affinity. A pNL4-3 recombinant vector with most of gag gene and a protease of subtype F was made, which allows the comparison of its effects on viral fitness.